Питательная среда для определения лецитиназной активности синегнойной палочки

 

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛВЦИГШ1АЗНОЙ АКТИЮЮСТИ СИНЕЩОЙНОЙ ПАЛОЧКИ, содержащая кальций хлористый, магний серноквслый, натрий хлористый, агар, диспшлированную воду, о тл н ч а ю щ а я с я тем, что, с целью ускорения и упрощения определения, она дополнительно содержит натрий двууглекисльп} и яичный желток при следующем соопюшении компонентов , г/л дастиллированной воды: Кальций хлористый0,05-0,15 Магний сернокислый 0/)5-d,I5 Натрий хлс сгьга4,75-5,15 Натрий двууглекислый0 ,05-0,15 § чикА желток20,0-30,0 ,0-20.0 (Л

ая <э

СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

PECn_#_i JlHH

702 А

3(59 С 12 0.1/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

0,05-0,15 го,о-зо,о

12 0-20.0

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3357937/28-13 (22) 24.11.81 (46) 15.01.84. Бюл. N 2 (72) Т. С. Минина, А. Г.,Фестинатова и И. В. До. марадский (71) Всесоюзный научно-исследовательский ин-ститут прикладюй микробиологии (53) 576.093.31 (088.8) (56) 1. Справочник по микробиологическим и вирусалогическим методам исследования. од ред. М. О. Биргера. М., "Медицина", 1973, с. 252.

2. Ktinge Ч. К. Differenzierung der in wasser

vorkommenden Bakterien des genus Pseudomontis

olurch die Eigel breaktion. — Archive Hygienlund Вестегкйоду. 141, 1957, 348 — 360.

3. Оп P. Ч. Factory that iffuence toxiganicity of Pseudomonas aeruginosa. — 3. Bacteriology.

88, 1964, р. 1421 — 1427 (прототип). (54) (57) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕЦИТ1 И:-1АЗНОЙ АКТИВНОСТИ

СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ, ций хлористый, магний сернокислый. натрий хлористый, агар, дистиллированную воду, о тл и ч а ю щ а я с я тем, что, с целью ускорения и упрощения определения, она дополнительно содержит натрий двууглекислый н яичный желток лри следующем соотношении компонентов, г!л дистнплироваиной воды:

Кальций хлористый 0,05-0,15

Магний сернокислый 0,05-4,15

Натрий хлористый 4,75-5,15

Натрий диууглекислый

Яичный желток

1067042

Изобретение относится к микробиологии и может найти применение в клинических и научных (генетических) исследованиях.

Известна среда(Чистовича для определения лецитиназной активности кокков, содер- . 5

- жащая мясопептониый агар и яичный желток (3).

Известна питательная среда для определения лецитиназной активности псевдомонад, содержащая пептон NaqHPO4, КнэР04, яичный желток, MgSO4, глюкозу, агар и воду 12). 10

Однако известные среды не позволяют опре. делять лецитиназную активность синегнойной палочки. !

Известна также питательная среда для онределения лецитинаэной активности синегной- 15 ной палочки, содержащая кальций- хлористый, магний сернокислый, натрий хлористый, агар, дистиллированную воду, а также калий фосфорнокислый однозамещенный, глутаминовую кислоту и альфа-алании 13). 20

Однако данная среда не обеспечивает быстроты и простоты определения, так как фермента достаточно не накопляется и для его определения необходимо выполнить ряд дополнительных приемов: смыв вь|росших микроор- g5 ганизмов, центрифугирование, определений ак-. тивности лецитиназы путем титрования раствора, что требует дополнительного времени и труда.

Целью изобретения является ускорение и упрощение определения. . Эта цель достигается тем, что питательная среда для определения лецитиназной активности синегнойной папочки, содеужащая кальций хлористым,, магний сернокиспый, натрий xJI0» ристый, агар и дистиллированную воду, дополнительно содержит натрий двууглекислый и яичный желток при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной водьк

Кальций хлористый, 0,05-0,15

Mar urk еероокисль1й 0,05-0,15

Натрий хпористый 4,75-5,15

Натрий двууглекислый . 0,05 — 0,15

Яичный жспток 20,0-30,0

Агар 12 0 — 20,0

: Питательную. среду готовят следующим образом.

Готовят раздельно растворы солей, смешивают их с расплавленным агароми перед упот50 реблением в состав среды вводят желток в виде эмульсии. Введение змульсин желтка проводят в агаризованную среду, имеющую температуру не выше 50 С. Среду разливают в чашки и охлаждают. 55

B тех случаях, когда предполагается ойределение лецитиназной активности (например, нри генетических исследованиях) штаммов синегнойной палочки, требующих для своего развития определенных компонентов (аминокислот, витаминов и др.), компоненты также могут быть дополнительно введены в состав среды.

Пример 1. Готовят среду следующего состава, г/л:

Кальций хлорисгый

Магний сернокислый

Натрий двууглекислый

Натрий хлористый

Яичный желток

0,05

4,75

20,00 (удельный вес принимают за 1)

12.00

Агар-агар

Вода дистиллированная до 1 л.

Для приготовления cpejga предварительно от) вешивают на технических весах хлористый кальций, сернокислый магний, двууглекислый натрий, хнористый натрий и агар-агар в указанных количествах и растворяют их при постоянном помешивании, нагревая среду до расплав ления агара. Затем рН среды доводят до 7,4 и разливают ее по емкостям. Стерилизацию осуществляют автоклавированием при 121 С в течение 15 мин.

Приготовленные указанным способом чашки засевают штаммами РАО М1 4262 и

Ps.putida 8s 250, дпя чего на поверхность среды культуры . наносят петлей (штрихом) или пипеткой в виде капель в количестве

10 -5x10s клеток. Через 48 ч инкубации при оптимальной температуре (синегнойную палочку инкубируют при 37 С, à Ps. putida— нри 30 С)вокруг колоний синегнойной папочки появлялись ореолы, имеющие вид двухконтурного кольца: внутренний — матовый с металлическим блеском и внешний — прозрачный.

Бри работе с ауксотрофными штаммами до заполнения чашек Петри соответствующие . аминокислоты в виде стерильных растворов ,вносят в среду s количестве 0,02 г/л. Так, . для штамма FA0 М1 4262 синегнойной палочки в среду вносят гистидин, триптофан, метионин, иэолейцин и валин, а для штамма

SS 250 Ра; putida-триптофан. Затем к расплавленной и охлажденной до 50 С солевой основе, добавляют эмульсию яичного желтка (смесь равных обьемов желтка и физиологического раствора) в количестве 20 г/л, среду тщательно пепемешивают и разливают по чашкам Петри (15 — 20 мл). Чашки подсуцщ= ,. вают при 37 С в течение 40 мин. Чашки с эмульсией желтка готовят непосредственно перед опытом. расщепляли (т.е. не давали ореолов), образованы кишечной палочкой.

Пример 4. Готовят солевую среду с добавлением эмульсии желтка (без добавле ния аминокислот).

На среду высевают прототрофный штамм синегнойной палочки и штамм с А — 87 кишечной палочки, нуждающийся в дополнительных факторах питания.

Солевую среду с эмульсией желтка засевают с помощью пипетки (каплями) смесью отмытых ночных культур обеих видов бактерий. Через 48 ч на среде четко заметны коло нии синегнойной палочки, окруженные, двухконтурными зонами, свидетельствуюппеми о расщеплении лецитина. Кишечная палочка роста не дает (при посеве очень густых суспензий смешанных культур иногда появляются единичные колонии кишечном палочки; но ореолов вокругх них никогда не отмечалось).

П р и м е.р 5. Соленая среда с эмульсией желтка может быть использована также для выявления мутантов синегнойной палочки, лишенных лецитиназной активности.. В качестве объекта исследования используют штамм РАОм6 4262 и к среде добавляют ами нокислоты, соответствующие его питательным потребностям (cM. пример 1). Мутагенез осуществляют с помощью нитрозогуанида, Иэ

324 колоний штамма РАОм(. 4262 обнаруже; на одна колония без двухконтурного ореола.

Последующий рассев клеток этой колонии на солевой среда с эмульсией желтка и аминокислотами подтвердил, что это лецитиназо- негативный мутант.

Результаты определения лецигиназной активности исследуемых культур приведены в таблице.

Использование щпательной среды позволяет быстро и просто определять лецитинаэную активность синегнойной палочки, причем определение можно осуществлять визуально.

Питательная среда делает возможным определение лецитинаэной активности клинических штаммов синегнойной палочки с целью определения степени . их патогенности, изучение генетических особенностей этого. возбудителя, а также дифференциации ппаммов синегнойной, палочки от лецитиназоотрицательных псев-; домонад (например, Ps. put ida), встречающихся в одном и хопе же клиническом материале.

3 106704

Появление ореолов свидетельствует о нали-, чии лецитиназной активности у исследуемой культуры. В чашках с культурой Ps. putida ореола вокруг колоний не наблюдается, из чего можно сделать вывод об отсутствии лецитинаэной активности у исследуемого организMR.

Четкое различие в морфологии колоний, регистрируемое визуально, позвоЛяет дифферен цировать синегнойиую палочку от некоторых 10 непатогенных псевдомонад.

Пример 2. Готовят среду следующего состава, г/л:

Кальций хлористый 0,15

Магний сернокислый 0,15 t5

Натрий двууглекислый 0,15

Натрий хлористый 0,15

Яичный желток 30,00

Агар-агар 20,00

Вода дистиллированная до 1 л 20 рН среды 7,2

Технические приемы для приготовления чашек Петри со средой такие же, как и в примере 1. Однако до добавления эмульсии желтка к одной порции среды добавляют аминокислоты, соответствующие питательным потреб. ностям штамма Я,А-87 (аргинин, гистидин, лейцин, пролин), и витамин Ât. Ко второй порции среды аминокислоты и витамин В1 не. прибавляют, поскольку она предназначена для

„. 30 выращивания прототрофного штамма синегнойной палочки. Рост кишечной палочки на среде с добавками аминокислот и сннегнойной палочки на среде, содержащей лишь эмульсию желтка, отмечался уже через 2 сут после посева ! ,2х10 клеток (инкубация в обоих случаях проводилась при температуре 37 С), по образование. двухконтурных ореолов вокруг коло,ний отмечалось только на среде, инокулироt ванной сииегнойной палочкой.

П р и и е р 3. На среду с аминокисло;тами и витамином В, (согласно примеру 2) сеют одновременно культуры кишечной и си,негнойной палочек (смесь содержала примерно по 100 клеток каждого вида бактерий).

Через 48 ч выращивания при 37 С отбирают по 10 колоний с двухконтурным ореолом и без него, Общепринятый анализ культураль. о ио-биохимических свойств показал, что все колонии с ореолами принадлежали синегнойной палочке, а колонии, которые лецитин не

1067042

Способ посева материала

201

P. put lds

BS-250

120

P. аегид1поаа 1822

230

8к

36к

133

120

42 к

2732 ф

185

Е. co1i Ga-87

188

Мутанты Р. авгиев 1поаа

4262 П вЂ” 16 (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) Составитель Г. Смирнова

Техред Т.Маточка Корректор О. Тигор

Редактор Т. Веселова

Заказ 11154/29 Тираж 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

П р и м е ч а и и е: Цифры в таблице означают число выросших колоний на чашке;

"+"- наличие лецитиназной активности; "—" — отсутствие лецнтиназной активности.