Способ обработки клубеньковых бактерий
СПОСОБ ОБРАБОТКИ КДУБЕНЬКОШХ . БАКТЕРИЙ, предусматривакиций приготовление суспензии бактерий и облучение ее лазерш в4 светом с длиной волны 441,6 нм, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью увеличения жизнеспособности клубеньковых бактерий и их азотфиксирукнцей активности, после облучения лазерным светом с длиной волны 441,6 нм бактерии через 8-10 мин облучают лазерным светом с длиной волны 632,8 нм при плотности энергии обоих лазеров 40 80 Дж/см. (Л ж% ккощ 100 80 ВО fO го о 00 со
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
ОЮIХ
РЕСПУБЛИК аа (и) y@y С 12 N 13/00, 1/20
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
И ABTQPCH0MY СВИДЕТЕЛЬСТВУ
CEO
ГОсудАРстВенный нОмитет сссР по делАм изов етений и отнйытий
1 (21) 3463243/28-13 (22) 05.07.82 (46) 30.04.84, Бюл. N- 16 (72) А.Ф. Лобазов, В.А.Иостовников, И.В.Хохлов, Н.И.Мильто и Г.Ф.Артишевская (71) Ордена Трудового Красного Знамени институт физики АН БССР и Институт микробиологии АН БССР (53) 663.14 (088.8) (56) 1. Петухов А.П. Генетика бактерий. N., "Медицина", 1977, с. 113.
2. Разумовский П.Н., Балаур М.И,, Балаур Н.С. Развитие исследований
rio фотоэнергетике микроорганизмов.
Сборник "Проблемы фотоэнергетики растений". 1975, Кишинев, вып. 3, с. 191-196. (54)(57) СПОСОБ ОБРАБОТКИ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ, предусматривающий приготовление суспензии бактерий и облучение ее лазерным светом с длиной волны 441,6 нм, о т л и ч-аю шийся тем, что, с целью увеличения жизнеспособности клубеньковык бактерий и их азотфиксирующей активности, после облучения лазерным светом с длиной волны 441,6 нм бактерии через 8-10 мин облучают лазерным светом с длиной волны 632,8 нм при плотности знергии обоих лазеров 4080 Дж/см .
10891 1
Иаксимальное увеличение жизнеспособности бактерий наблюдается при плотности энергии 60 Дж/см +
g.
+ 60 Дж/см. При дозах 40 + 40 Дж/см и 80 + 80 Дж/см наблюдается некоторое снижение эффективности увеличения жизнеспособности обрабатываемых бактерий, поэтому выбрана доза, Изобретение относится к технической и сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для получения микроорганизмов с повышенной жизнеспособностью и азотфик- 5 сацией.
Известен способ обработки микроорганизмов ультрафиолетовым излучением, заключающийся в тои, что микроорганизмы обрабатывают ультрафиолетовым излучением с h.=265 нм (1).
Недостаткаии данного способа является практически малая эффективность получения микроорганизмов с ценныии биологическими и хозяйствен- 15 ными признаками, низкая жизнеспособность при инокулировании полученных микроорганизмов в почву.
Наиболее близким к предлагаемому является способ обработки клубенько- 20 вых бактерий, предусматривающий приготовление суспензии бактерий и облучение ее лазерным светом с длиной волны 441,6 нм (2) .
Согласно известному способу клубеньковые бактерии обрабатывают излучением гелий-кадмиевого лазера ЛГ-70 (441 6 нм).
Недостатками известного способа является низкая жизнеспособность и низкая азотфиксирующая активность обработанных бактерий.
Цель изобретения — увеличение жизнеспособности клубеньковых бактерий и их азотфиксирующей активности..
Поставленная цель достигается тем, что согласно способу обработки клубеньковых бактерий, предусматривающему приготовление суспензии бактерий ио 40 облучение ее лазерным светом с длиной волны 441,6 ни, предложено, согласно изобретению, после облучения лазерным светом .с длиной волны
441,6 ни бактерии через 8-10 мин
Облучают лазерным светом с длиной волны 632,8 нм при плотности энергии обоих лазеров 40-80 Дж/см .
Способ осуществляют следующии образом. 50 подтверждающая влияние на положительный эффект плотности энергии обоих лазеров в пределах 40—
80 Дж/см2 для каждой длины волны (табл. 1).
Увеличение жизнеспособности и азотфиксации клуьеньковых бактерий достигается путем комбинированного облучения (красный + синий) области спектра.
Отдельно эффект облучения красным светом не достигается (табл. 2)
) так как обработка бактерий отдельно как синим, так и красным светом по отдельности не приводит к сущест.венному увеличению жизнеспособности и азотфиксирующей активности. И т лько при комбинированной обработке жизнеспособность увеличивается на
15-8 1 . и азотфиксация увеличивается на 17-52 .
Известно, что излучение оптического диапазона в синей области спектра (ф - 400-460 нм) активизирует криптохромную систему микроорганизмов, участвующую в регуляции их биосинтетической активности.
Излучение в красной области спектра активизирует фотохромную систему микроорганизмов, которая участвует в регуляции морфогенеза для повышения жизнеспособности и азотфиксирующей активности, бактерии дополнительно облучают излучением гелийнеонового лазера, работающего в диапазоне красной области спектра (= 632,8 нм, Р 40-80 Дж/см 1.
Свойства полученных измененных форм при разных вариантах облучения резко отличаются. Так (см. табл.3) жизнеспособность измененных форм индуцированных излучением с
= 441,6 нм или достоверно не отличалаеь от исходных форм для видов
Rh. meliloti, Rh. trifolii или была значительно ниже для видов Rh. leguminosarum, Rh. lupini Жизнеспособность же измененных форм бактерий индуцированных комбинированным излучением, на 15-81 выше, чем у исходных форм, т.е. биологическая ценность полученных форм достаточно высока. При многократном пересеве полученных под воздействием лазерного излучения измененных форм бактерий их свойства сохраняются.
Выбор интервала времени между облучениями подобран эксперииенталь1089121
Таблица 1
Влияние плотности энергии лазера на жизнеспособность клубеньковых бактерий ю
Жизнеспособность бактерий после облучения.k контролю, Х
% 441,6 + P 632,8 ф 441,6 + 5 632,8 9 441,6 + Я 632,8
Р"- 40+40 Дж/см p 60+60 Дж/см Р 80+80 Дж/си
Вид бактерий
Достовер-. ны, различны
Откло- Достовер- Откло- Достовернение, ны, раз- кение, ны, разЙ личны Х личны
Отклонение, 7.
Rh.meliluti
+ 37
Р(0,05
+ 81 Р(0,01
+ 49
Р(u, 01
Rh.leguminosarum + 28 P(G,05
+ 61 . P(005
+ 30
Р(0,01 но (см. чертеж), как наиболее эффективный в получении жизнеспособных бактерий.
О практической ценности полученных под воздействием комбинированного облучения измененных форм свидетельствует излучение их азотфиксирующей способности. Разные виды бобовых растений инокулируют специфическими для данного вида 10 контрольными бактериями, бактериями, полученными под воздействием лазерного излучения с одной длиной волны
441,6 нм и бактериями, полученными под воздействием комбинированного об-15 лучения (предлагаемый способ). Устанавливают, что при инокуляции растений бактериями, полученными при обработке только излучением с
= 441,6 нм, содержание азота и био- 20 масса растений или незначительно увеличивается или даже снижается по сравнению с инокуляцией контрольными бактериями. При инокуляции растений бактериями, полученными при комбини- 25 рованном облучении, аэотфиксирующая способность их увеличивается: содержание общего азота увеличивается, по сравнению с обработкой контрольными бактериями, в зависимости от ви-З0 да растений от 117 до 2527., белкового азота — от 117 до 2187 и симбиотического азота — от 110 до
2997.. Усилие азотного питания приводит к увеличению растений, т.е. повышению урожайности этих ценных кормовых культур от 115 до 182K в зави- симости от вида растений по сравнению с вариантом обработки растений контрольными бактериями.
Пример. Объектами излучения являются клубеньковые бактерии из коллекции ВНИИ С/XM и местные, выделенные в различных районах Белоруссии. Всего изучают 4 образца. Облучают водную суспензию 2-3 суточных бактерий излучением промышленно выпускаемых лазеров ЛГ-70, ЛГ-75 с ч иксированной длиной волны. Высев после облучения на бобовую питательную среду производят через 1-2 ч. Жизнеспособность культур определяют методом рассева облученной суспензии на плотные питательные среды. Посевы инкубируют 3 сут для быстрорастущих бактерий и
7-8 сут для медленно растущих при
26-28 С. Для каждого варианта облучения проводят 3-4 серии опытов.
В каждой серии проводят по 3-5 опытов на один вид бактерий.
Азотфиксирующую активность исследуемых бактерий определяют в почвенной культуре в биометрах. Инокуляционная нагрузка составляет 1 млн. бактерий на семя. Увеличение артификсирующей активности составит
117-2527. по сравнению с контролем (табл. 3 и 4).
Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет повысить жизнеспособность клу беньковых бактерий на 15-817 и азотфиксирующую способность на 17-527..
1089121
Продолжение табл. 1
Жизнеспособность бактерий после облучения к контролю, Ж
% 441,6 + 3 632,8 Я 441,6 + ф 632,8 ф 441,6 + Я 632,8 о 40+40 Дж/см ) 60+60 Дж/см p 80+80 Дж/см
ОтклоОткло- ДостоверР<0 05
+ 11
+ 15 Р 0,05
+ 9
Раб, 05
Rh.lupini + 16
+ 13
РСО 05 Р(0,01
+ 22 Р(0,02
Вид бактерий
Rh.trifolii
Отклоне- Достоверние, 7. ны, различны нение, Ж
Достоверны, различны кение, ны, раз7. личны
i !.18912 !
v
4J б 1
Ж 1
Е» о
Ж
>О
Е Ж
1 Ж М
O 14
» — »
I о к
Е» Ж
v Р
Х !б б >0
Р. Ж
14 ф Ж . Щ а о
У !
»
g о
Щ
>Я
3 ф о
Х
1»»
Ф !
О
О
О ф х ф
Е» о
>Я о ф
1
1
I
1
1
I >g
Ц
>0
Ю.
1
1
1 О
1 !
>
О
63
E
14
Ф
И
1 (б 1 х
0, и
Я б»
1
1
l
1
С»!
0> 1
1
1
1
>б
0> Ф ж
Г Й
Ф
40 Е
М ф о
Т
>g о х
О
Ф а
14 ь
00 1
О
О
А
v о
М
Е»
14
1
1 v
00 л
< 4
С \
Ю
О
А
Е»
v о
В о
v о
1»» и
Ф ж бб
Ж 1
Р I 4!
Е»
v о х
>0 о
v о
И
О
Ф ж
4I
Ц о
Е» м о
»»4
А
1 о
Р ж о
Ф4
1» 1 л I.
И 1
Ю
l !
Ъ
Ю
40 О
1
1 л и
5N
° л
ФМ и
Ф
4!
441 о
Ч.1 и и å л
l>, В
Я ф
Ц 1 Ф
О 1 P
0, I
f»
Ж, >О о о 4
А
34 !» о
I й(1
I 1
I 1
3 — — —
I
1
О 0 1
1
1 1
1
1
I
С>
I
1. 1
1 I
1
1 с
О О
Р а
Ф Ф ф ф
Ф Ф
Л Л
2 х
1 Р
1 Ф
1 ф о
1 Е о о
I и
Ф !
Ф
1 Е» .I 3
1 о
l l
1 О
I б!
М о
I Е4
I I>
I и
1 0
l g
I Ц
1 Е
1Ю
1 Ф ,!
1 М
I ° Х
1 ! Ф
1 б
I Ф
I
1 g
1,а
1
1.
1089121
Таблица 3
Влияние лазерного опыта света на жизнеспособность клубеньковых бактерий (усредненные значения в пределах одного вида) Жизнеспособность бактерий после обл чения к контролю, 7 комбинированное облучение
3 441,6 + ф 632,8.
P 60 + 60 Дж/см (предлагаемый способ) лазерным светомЯ 44 1,6 нм (прототип)
P л,60 Дж/см
Вид бактерий
Отклонение, 7
Отклоне- Достоверность ние, Х различий
Rh. meliloti
+ 81
P (Q,01
+ 3
P )0,1
Rh leguminosarum
+ 61 — 36
Рс0 05
P (0,05
+ 15
Rh. trifolii
Р (0,05
Р >0,1
Р c 0,05
Rh. lupini
P (0,02
+ 22
Таблица 4
Азотфиксирующая активность полученных под действием лазерного излучения измененных форм клубеньковых бактерий! Накопление азота, к конт, ролю, Е
ДостоМасса растений к
Вариант обработки . сибиотический! белко,вый общий
1 контролю, Е
100
100
100
100
Контроль
Горох
Rh. 2eguminosarum
Р >0,1
93
88
P <0,05
115
136
117
133
Вид растений.
Вид инокулированных бактерий
Индуцированныи светом
g =441,6
Индуцир ованный комбинированным облучением
Достоверность различий
1 верность различий
1089121
Продолжение табл. 4
Нвкеалеиие азоте, 9o э тоерность азлиВариант обработки белковый биотмский
Бобы
100
100
100
100
Rh. 2eguminosarum
90
Р>091
Комбинированным об117
164
110
127
P (0,05 л учением
100
100
100
100
104
112
109
108
P >0,1
182 252
218
299
P (0,01
100
Контроль
100
100
100 il =441,6
114
109
106
106
Р >0,1
Комбинированным об156
173
156
P (0,01 лучением
Составитель В.Голимбет
Редактор Н.Ковалева Техред Л.Иикеш Корректор С.Шекмар
Заказ 2871/23 Тираж 522 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4
Вид растений
Вид ииокулироваиных бактерий
Клевер
Rh. trifofii
Люцерна
Rh. me gigo t1
Контроль
$ =441.,6
Контроль =441,6
Комбинированным облучением
Ивссв растений к коитро лв, Й
