Устройство для флуоресцентного исследования биологических объектов

 

1. УСТРОЙСТВО ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ, содержащее измерительную кювету открытого типа, сообщенную гадравлическим трактом с каналом подачи исследуемой среды, регулировочный тубус, систему подачи и стока °. транспортной среды, оптическую систему , включающую источник излучения и фотоприемник, соединенный через усилитель и амплитудный дискриминатор с регистратором, о т л и ч а ю е ее я тем, что, с целью сокра щения времени анализа,селекции малых концентраций исследуемых биообъектов на фоне концентрированных популяций биообъектов, оно имеет два канала подачи фоновых и обнаруживаемых биообъектов, каждый из которых включает резервуар с объектами , электромеханический зажим и гидравлический тракт, последние соединены в общей точке межДу собой и с гидравлическим трактом канала подачи исследуемой среды, третий электромеханический зажим, установгленный в гидравлическом тракте канала подачи исследуемой среды, три управляемых ключа, сигнальные входы которых объединены и соединены с выходом усилителя, блок установки пороговых уровней, соеднненный с амплитудным дискрииинатором, выход которого соединен с регистратором, i и управляемый кольцевой счетчик, выходы которого соединены с управ (Л ляющими входами каждого из электромеханических зажимов и каждого управляемого ключа, причем выходы первого и второго управляемых ключей , управлякодие входы которых соединены с электромеханическими зажимами каналов подачи фоновых и ;О обнаруткиваемых биообъектов, соединеО 00 ны с входами блока установк пороговых уровней, а выход третьего управСП ляемого ключа соединен с входом амплитУдного дискриминатора. 2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что, с целью повышения достоверности селекции исследуемых биообъектов, амплитудный дискриминатор выполнен двухпороговым,

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК .

09) (н>

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (2!) 3474526/28-13 (22) 20,07.82 (46} 07.05.84. Бюл. Ф 17 (72) E.È.-Култьппев, В.Е.Курочкин и С.П.фалеев (71) Ленинградский институт авиационного приборостроения и Всесоюзный научно-исследовательский и кон-, структорский институт медицинской лабораторной техники (53) 615.471:616.088.9.074 (088.8) (к ) l. Курочкин В.Е. и др. Проточный цитофлуориметр.. — "Новости медицинской техники". Изд.-во ВНИИ меди" цинского приборостроения, 1979, вып.2, с.50-5!. (54)(57) 1. УСТРОЙСТВО ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ

ОБЬЕКТОВ, содержащее .измерительную кювету открытого типа, сообщенную гидравлическим трактом с каналом подачи исследуемой среды, регулировочиый тубус, систему подачи и стока транспортной среды, оптическую систе" му, включающую источник излучения и фотоприемник, соединенный через усилитель и.амплитудный дискримина тор с регистратором, о т л и ч а юg е е с я тем, что, с целью сокращения времени анализа селекции малых концентраций. исследуемых биообъектов на фоне концентрированных популяций бнообъектов, оно имеет два канала подачи фоновых и обнаруживаемых биообъектов, каждый из дц А 61 В 10/00; G О! N 21/64 которых включает резервуар с объек- тами, электромеханический зажим и гидравлический тракт, последние соединены в общей точке между собой и с гидравлическим трактом канала подачи исследуемой среды, третий электромеханический зажим, установ.— ленный. в гидравлическом тракте канала подачи исследуемой среды, три . управляемых ключа, сигнальные входы которых объединены и соединены с выходом усилителя, блок установки пороговых уровней, соединенный с амплитудным дискриминатором, выход которого соединен с регистратором, и управляемый кольцевой счетчик, З выходы которого соединены с управляющими входами каждого из электромеханических зажимов и каждого управляемого ключа, причем выходы первого и второго управляемых ключей, управляющие входы которых соединены с электромеханическими зажимами каналов . подачи фоновых и обнаруживаемых. биообъектов, соединены с входами блока установки пороговых уровней, а выход третьего управ ляемого ключа соединен с входом амплитудного дискриминатора.

2. Устройство по и. l, о т л и— ч а ю щ е е с я тем, что, с целью повышения достоверности селекции исследуемых биообъектов, амплитудный дискриминатор выполнен двухпороговым, 1090350

Изобретение относится к микробиологическим исследованиям, а именно к устройствам выделения и идентификации биологических объектов, и может быть использовано в онкологии 5 (поиск опухолевых клеток ), в санитарно-эпидемиологической службе (поиск патогенных бактерий), а также в службах контроля водоочистных сооружений. 1О центраций исследуемых объектов на фоне концентрированных популяций . биообъектов.

Указанная цель достигается тем, что устройство для флуоресцентного исследования биологических объектов, содержащее измерительную кйвету открытого типа, сообщенную гидравлическим трактом с каналом подачи исследуемой среды, регулировочный тубус, систему подачи и стока транспортной среды, оптическую систему, включающую источник излучения и фотоприемник, соединенный через усилитель и амплитудный дискриминатор с регистратором, имеет два канала подачи фоновых и обнаруживаемых биообъектов, кыдый из которых включает резервуары с объектами, электромеханический зажим и гидравлический тракт, последние соединены в общей точке между собой и с гидравлическим трактом канала подачи исследуемой среды, третий электромеханический зажим, установленный в гидравлическом тракте канала подачи исследуемой среды, три управляемых ключа, сигнальные входы которых объединены и соединены с выходом усилителя, блок установки пороговых уровней, соединенный с амплитудным дискриминатором, выход которого соединен с регистратором, и управляемый кольцевой счетчик, выходы которого соединены с управляющими входами каждого из электромеханических зажимов и каждого управляемого ключа, причем выходы первого и второго управляемых ключей, управляющие входы которых соединены с электромеханическими зажимамн каналов подачи фоновых и обнаруживаемых биообъектов, соединены с входами блока установки пороговых уровней, а выход третьего управляемого ключа соединен с входом амплитудно" го дискриминатора.

С целью повышения достоверности селекции исследуемых объектов селекции исследуемых биообъектов амплитудный дискриминатор выполнен двухпороговым.

На фиг. 1 изображено предлагаемое устройство; на фиг. 2 — структурная схема блока установки пороговых уровней.

Устройство содержит резервуар 1 с транспортной средой, канал 2 подачи транспортной среды, микроотверстие 3, 15

Известно устройство для флуоресцентного исследования биологических объектов, содержащее измерительную кювету открытого типа, соединенную гидравлическим, трактом с каналом подачи исследуемой среды, регулиро.— вочиый тубус, систему подачи и стока транспортной среды, оптическую систему, включающую источник излучения и фотоприемник, соединенный через усилитель и амплитудный дискриминатор с регистратором.

В известном устройстве непрерывное возбуждающее излучение проходит через фокусирующую линзу, светофильтр, 25 дихроичное зеркало и направляется микрообъективом на микроотверстие,. которое связано с каналом подачи биообъектов. Флюоресцентное излучение биообъекта, проходящего через микроотверстие, собирается микрообъективом и через оптический фильтр попадает на фотоприемник. Сигнал с фотоприем" ника усиливается и подается на реги" стрирующее устройство 1.13

Данное устройство, хотя и обладает повышенной чувствительностью и точностью регистрации биообъектов, однако не может оперативно производить селекцию сигналов об обнаруживаемых 40 биообъектах находящихся в смеси с другими бнообъектами. Такая задача является типичной при обнаружении малых концентраций опухолевых клеток в крови, а также и в некоторых других 45 случаях, связанных с обнаружением биообъектов на фоне других, по различным флуоресцентным тестам. Регулировкой коэффициента усиления усилителя можно добиться лишь частичной селекции сигналов флуоресценции, т.е. производить отсечку сигналов от слабофлуоресцирующих биообъектов, однако это уменьшает надежность и точность устройства вследствие Рассогласо 55 вания цепи усилитель — блок регистрации.

Цель изобретения. — сокращение времени анализа селекции малых кои3 1090350 4 измерительную кювету 4 открытого типа минатора. Выставление величин порос канавкой, канал 5 стока, резервуар гов осуществляется следующим обра6 для стока транспортной среды, ка- зом. По команде оператора (нажатие нал 7 подачи биообъектов, резервуар кнопки "Пуск" первый раз) на первом

8 с фоновыми биообъектами, резервуар 5 выходе кольцевого счетчика 20 появля"

9 с обнаруживаемыми биобъектами, ре- ется электрический сигнал, который зервуар 10 с исследуемыми биообъекта- поступает одновременно на управляеми, микрообъектив ll, дихроичное зер- мый зажим 21, открывая его и разрекало 12, источник 13 возбуждающего шая доступ к фоновым биообъектам в излучения, светофильтр 14, фотопри- 1п кювету (в исходном положении все емник 15, усилитель 16, первый управ- три клапана закрыты), и на управляеляемый ключ 17, второй управляемый мый ключ 17, разрешая прохождение ключ 18, третий управляемый ключ 19, через него электрических импульсов двухпороговый дискриминатор 20, блок (в исходном состоянии все три ключа

21 установки пороговых уровней коль- 5 разомкнуты). Популяция клеток фоно7 цевой счетчик 22, первый электроме» вой культуры попадает в кювету. Сигханический зажим 23, второй электро- налы от этих клеток через открытый механический зажим 24, третий электро- ключ 17 попадают на первый вход механический зажим 25, регистратор блока 21 установки пороговых уровней.

26, основание 27 канавки, канал .28: 2О В этом блоке определяется математи,подачи фоновых биообъектов, -канал ческое ожидание ш и дисперсия И .1 2

29 подачи обнаруживаемых биообъек- распределения интенсивности флюорестов, геРметичный регулировоч- ценции кз еток фоновых биообъектов

Й и тУбУС 301 ПРижимные вин- и по ним определяется н ний.порог ты 31, кольцевые пРУжины 32, р5 для двухпорогового дискриминатора герметизирующую прокладку 33, светофильтр 34 и фокусирующую линзу 35. Далее оператор нажимает второй

ИэмеРительнаЯ кювета 4, состоЯщаЯ Раз кнопку "Пуск", электрический из основания 27 и канавки, снабжена сигнал появляется на втором выходе ! тубусом 30 с прижимными винтами 31 кольцевого счетчика 22 и пропадает

30 кольцевыми пружинамн 32э герметиэи на первом, после чего первый управРующей пРокладкой 33 и имеет отверс- ляемый зажим 23 закрывается, первый тие в " Р Р щ микрообъектнв Управляемый ключ 17 размыкается, 11, на оптической оси которого после- второй Управляемый клапан 24 открыДовательно Расположены Дихрончное вается и второй управляемый ключ зеркало 12, светофильтр 14 и фотопри- 5 замыкается. Таким образом, аналогич-35 емник 15; выход котоРого соединен с но определяют математическое ожидавходом Усилителя 16. Измерител н я ние ш н дисперсию N> распределе/ 1 кювета 4 чеРез микРоотвеРстие 3 сое ния интенсивности свечения обнару-, динена с каналом 7 подачи бнообъек- живаемой культуры биообъектов и по тов> через канал 2 подачи транспорт" ним определяется верхний порог для

40 ной сРеды - с РезеРвУаРом 1 с транс- двухпорогового дискриминатора 20. портной средой, а через канал 5 сто- После выставления порогов операка — с резервуаром 6 для стока тРан-. тор третий раз нажимает кнопку спортной среды. "Нуск", в результате чего второй

Оптическая ось источника 13.воэ- управляемый клапан 23 закрывается, 45 буждающего излучения фокусирующей второй управляемый ключ 18 раэмылинзы 35 и светофильтра 34 перпенди кается, третий управляемый клапан кулярна оптической оси микрообъектива 25 открывается и третий управляемый

l1 и пересекается с ней в месте Рас ключ 19 замыкается. Таким образом, положения дихроичного зеРкала 12. " устройство готово. к обнаружению

Три электрозажима 23, 24 и 25 рас- искомых клеток в исследуемой попуположены снаружи на каналах подачи ляции (нанример, обнаружение опухофоновых биообъектов 28, обнаруживае левых клеток на фоне нормальных). мых 29 и исследуемых 7 биообъектов Устройство работает в этом режиме соответственно. следующим образом.

Перед началом работы оператор ус- Взвешенные в водной пробе исслетанавливает величины верхнего и ниж" дуемые биообъекты иэ резервуара 10 него порогов двухпорогового дискри- с исследуемыми биообъектами поступаВ l 0903 ют через открытый канал 7 подачи биообъектов и микроотверстие 3 в измерительную кювету 4 эа счет разрежения, которое создается смывной жидкостью, проходящей через канал 2, кювету 4 и канал 5.

Измерительная кювета выполнена открытой для погружения в нее микрообъектива 11 и снабжена установлен« нь1м с возможностью перемещения вдоль 10 оптической оси герметичным регулировочным тубусом 30 с отверстием, в котором размещен микрообъектив !I.

Тубус 30 навинчивается на основание кюветы 27, выполненной из кекорродн- 15 рующего материапа, а для герметичности между ниии устанавливается кольцевая герметизирующая прокладка 33 из вакуумной резины.

Иикрообъектив 11 крепится в от- 20 верстии тубуса 30 посредством кольцевых пружин 32 и прижимных винтов 3I.

Возбуждающее излучение от источника

I3 через линзу 35 и светофильтр 34 попадает на дихроичное зеркало 12 и 25 отраженное им собирается микрообъек) тином 11, в фокусе которого находится микроотверстие 3. Настройка фокуса микрообъектива 1! на микроотверстие 3 осуществляется перемещением !0 вдоль оптической оси тубуса 30. Выдер" живание соосности микрообъектива 11 и микроотверстия 3 осуществляется прижимными винтами 31.

Возбуждающее излучение поглощается биологическим объектом, проходящим через микроотверстие 3. Флуоресцентное излучение этого объекта собирается микрообъективом 11, пропускается дихрончным зеркалом 12 и через 40 светофильтр 14 попадает на фотоприеиник 15, где преобразуется в электрические импульсы.

Амплитуда этих импульсов, пропор45 циональная интенсивности импульса флуоресценции, через усилитель 16, третий управляемый ключ 19 и двухпороговый дискриминатор 20 только тогда попадает в регистратор 26, когда ам50 плитуда импульса превышает нижний порог дискриминатора. Если амплитуда импульса не соответствует величине окна дискриминатора, то сигнал на

i блок регистрации 26 не пропускается. с,g

Таким образом, регистратор показывает число импульсов за определенный период времени, т.е. показывает концентрацию исследуемых биообъектов

50 в опытной пробе (с заранее заданной вероятностью правильного обнаружения и ложной тревоги). Кроме того, окно иэ двух порогов позволяет отселектнровать исследуемые биообъекты от других биообъектов,присутствующих в пробе,так какплотности вероятностей распределения амплитуд для разных биообъектов отдичаются друг от друга.

Блок 21 установки пороговых уров" ней.может быть реализован несколькими способами. Одна из схем реализации покаэанана фиг.2,где36 и37 -ключи,38 и 39 — накопители,40 и 41 — счетчики, 42 — квадратор, 43 — вычитанщее устройство, 44 — дешифратор..

Рассматриваем подробнее релизацию блока 21 установки пороговых уровней. Математическое ожидание (среднее) амплитуды импульсов вычисляетая следующим образом: м в„(%) Z viI N

1=1 где Vi — амплитуда i-ого импульса; 0 - число импульсов.

Следовательно, для вычисления среднего необходимо накопить амплитуды пришедших Х импульсов, а затем эту суммарную величину поделить на число пришедших импульсов N. Накопитель легко реализуется, например, на емкости с большой постоянной времени разряда или на накапливающем сумматоре. Делитель на заранее неизвестное число И реализовать сложнее.

Поэтому используется схема деления на заранее известное число. Осуществляется это следующим образом. Счетчик считает заранее известное число импульсов (например, К), после чего на его выходе появится сигнал, который закрывает ключ, бывший до этого открытым. В накопителе, таким образом, накопятся амплитуды К иммульсов. Установив коэффициент пере дачи накопителя или ключа равным 1/К, получим напряжение на выходе накопителя, равное среднему значению амплитуд импульсов, Известно, что дисперсия И (Ч) определяется следующим образом:

М2(Ч) - m„(V2) - (ш,(Ч)2, Имея схему вычисления среднего, нетрудно составить схему вычисления дисперсии, используя также квадраторы и вычитающее устройство. Дешифра-. тор по комбинации четырех входных сигналов выдает два выходных поро1090350 говых сигнала и может быть реализован на диодной матрице.

Двухпороговый дискриминатор про" пускает сигнал на выходе, только если амплитуда сигнала больше нижнего порога и меньше "ерхнего, в других случаях выходной сигнал равен нулю.

В качестве источника возбуждающего излучения может использоваться оптический квантовый генератор с излучением в диапазоне 300-490 NK, В качестве фотоприемника могут использоваться фотоумножители ФЭУ-79 или ФЭУ-39А.

В кольцевом счетчике 22 напряжение логической единицы (3,5-4 В) присутствует всегда только на выходе одного триггера, а на выходах остальных — ноль. . При подаче на синхровходы управляющего сигнала (в данном случае при замыкании кнопки Пуск подается нулевой управля—

II И ющий сигнал) логическая единица переходит на выход последующего в цепи триггера. Таким образом, при каждом нажатии кнопки "Пуск" логическая единица продвигается на один триггер вперед и после четырех нажатий кнопки окажется в исходном состоянии.

Четвертый триггер необходим для хранения логической единицы в то время, 5 пока устройство не работает. Периодичность нажатия кнопки рассчитывается заранее и обычно составляет несколько минут.

Транспортная среда представляет собой смывную жидкость, например воду.

Фоновые биообъекты — это раствор той среды, в которой находятся атипичные биообъекты, (например, кровь), обнаруживаемые биообъекты — это те атипичные биообъекты, наличие которых необходимо выявить в исследуемой пробе (найример, раковые клетки )..

В качестве усилителя можно использовать любой стандартный импульсный

20 усилитель напряжения. В качестве . микрообъектива может быть использован микрообъектив водной иммерсни с увеличением 30 и числовой апертуК рой 0,9.

25 В качестве блока регистрации может использоваться любой цифровой счетчик импульсов АИ-256, АИ-1024.

l090350

1090350

Яеэ. я

Составитель Ф.Рогожанский

Редактор Н.Киштулинец Техред . Л.Мартяшова .

КорректорА.ляско

Подписное

Заказ 2973/4 Тираж 688

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

l)3035, Москва, Ж-35, Раущская наб., д. 4/5

«\

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4