Способ получения сорбента

 

1.СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА для выделения и очистки вирусов гриппа путем модификации поргистого стекла, отличающийся тем что, с целью повышения стабильности сорбента и обеспечения возможности повышения выхода и удельной активности вируса, модификацию осуществляют трех-четырехкратной обработкой пористого стекла парс1ми Т;Сб при 160-180°С в течение 100-120 мин и гидролизом продукта парами воды после каждой стадии с последующей обработкой полученного продукта раствором овальбумина. 2. Способ по п.1, отличающ и и с я тем, что используют § раствор овальбумина при общем содержании последнего 150+10мг в расчете на 1 г сорбента.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

»Д»»

РЕСПУБЛИК

3(!5П а 61 К 39/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3600003/28-13 (22) 12 ° 04.83 (46) 23.11.84. Бюл. 9 43 (72) A.Н.Волковà, A.И.Крашенюк, Н.Б.Федотова и В.И.Яковлев (71) Ленинградский ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового

Красного Знамени технологический институт им.Ленсовета (53) 543.544(088.8) (56).1.Мгедлишвили Б.В., Жданов С.П.

Бреслер С.Е. и др. Жидкостная ситовая хроматография вируса гриппа на модифицированных пористых стеклах. Труды Института им.Пастера, 1976, с. 47,43.

2. Патейт Великобритании

9 1346631, кл. С 07 G 7/02, опублик.

1975.

3. Регламент производства вакцины гриппозной, хроматографической инактивированной жидкой 9 124-79, ст. 6, опер. 26, утвержд . начальником Главного управления по производству бактерийных и вирусных препаратов Министерства здравоохране ния СССР, 1981.

„„SU„„49 7 А (54)(57) 1.СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА для выделения и очистки вирусов гриппа путем модификации пористого стекла, отличающийся тем„ что, с целью повышения стабильности сорбента и обеспечения возможности повышения выхода и удельной активности вируса, модификацию осуществляют трех-четырехкратной обработкой пористого стекла парами TiCt< при 160-180 С в течение 100-120 мин и гидролизом продукта парами воды после каждой стадии с последующей обработкой полученного продукта раствором овальбумина.

2. Способ по п.l, о т л и ч а юшийся тем, что используют Я раствор овальбумнна при общем содержании последнего 150+10мг в расчете на 1 r сорбента.

1124977

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается производства сорбентов для очистки вирусов гриппа методом гель-хроматографии.

Наиболее распространенным методом для выделения и очистки. вирусов гриппа из вирусосодержащей жидкости являетсл метод эксклюзионной (гельхроматографни) хроматографии с применением сорбентов на основе порис- 10 того стекла. При этом сорбент должен обладать минимальной сорбционной емкостью по отношению к вирусам гриппа и сопутствующим белкам.

Мето етод основан на разделении вирусов 15 и белков по принцнпу молекулярных сил. Отсутствие активных центров на поверхности сорбента исключает возможность сорбции белков или вирусов, что, в свою очередь, позволяет наиболее полно выделить вирусы гриппа

20 и отделить их от белка. Сорбент, используемый для гель-хроматографии„ должен обладать стабильностью, исключающей попадание модификатора в целевой продукт, механическими

25 свойствами, позволяющими фильтровать и наполнять колонку, быть нечувствительным к микробному воздействию и к изменениям рН.

Известен способ получения сорбента для выделения и очистки вирусов гриппа путем модифицирования макропористых стекол компонентамн аллантоисной жидкости (lg .

Недостатком этого способа являет- Ç5 ся нестабильность получаемого сорбента вследствие того, что процесс модифицирования является нестабильным, зависящим от принципиальной нестабильности различных параметров 4() вирусосодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ).

В результате полученный сорбент не требует повторного модифицироваКроме того, модифицированные стекла можно стерилизовать только химически (формалином), а выход вируса достигается в жестких условиях по рН и концентрации каС1.

Известен также способ получения .сорбента путем модификации носителя титаносодержащими группами (2j .

Недостатком этого способа является то, что получаемый сорбент обладает большой сорбционной емкостью к белку и использование водных растворов для модификации (пропитка) не позводяет получить необходи- мое число и расположение слоев, т.е. требуемую структуру сорбента. В результате этого не обеспечивается воспроизводимости результатов при вы- 60 делении вируса гриппа.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ получения дорбеита для выделения и очистки вируса гриппа путем модификации пористого стекла поливиннл пирролидоном (ПВП).

Процесс обычно проводят в водном растворе в статических условиях, после адсорбции пористое стекло с модификатором отмывают дистиллированной водой и подвергают термообработке. Использование полученного сорбента позволяет выделять вирус гриппа в зависимости от используемого штамма на 16-48% (выход вируса) при удельной активности 0,36-1,41 (отношение титра вируса к содержанию белка в пике). Этот сорбент в настоящее время широко используется в медицинской промышленности (3) .

Недостатками известного способа являются непрочная модификация стек" ла, что приводит к сползанию модификатора с поверхности носителя и попаданию в целевой продукт, необходимость повторного модифицирования орбента поливинилпирролидоном через

-10 хроматографических циклов (через

3 мес.), что является нетехнологичным, а также низкий выход вирусов гриппа при низкой степени его очист ки, высокая стоимость ПВП и длительность процесса модификации носителя.

Целью изобретения является повышение стабильности сорбента и обеспечение возможности повышения выхода и удельной активности вируса при выделении.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу.получения сорбента для выделения и очистки вирусов гриппа путем модификации пористого стекла, модификацию осуществляют трех-четырех кратной обработкой пористого стекла парами

Т1С1 при 160-1800С в течение

100-120 мин и гидролизом продукта парами воды после каждой стадии с последующей обработкой полученного продукта раствором овальбумина.

Кроме того используют раствор овальбумина при общем содержании последнего 150 10 мг в расчете на

1 г сорбента.

Технология получения сорбента для очистки вирусов гриппа состоит в попеременной обработке носителя— пористого стекла с размером пор

2000 А, удельной поверхностью 25м /г парами четыреххлористого титана и воды при Ф 160-180 С три-четыре раза и обработке.титансодержащего:; сорбента раствором овальбумииа.

Такая обработка приводит к созданию на поверхности пористого стекла титансодержащих групп, связанных с поверхностью прочными ковалентными связями заданного состава и строения.

1124977 ния (количество титана на сорбенте после 200 хроматографических циклов оставалось практически равным исходному„содержанию — 0,24 мг экв/г для трехкратной обработки и 0,30 мг экв/г для четырехкратной: обработки). При . этом модификация титан-оксидными группами приводит к снижению растворимости стекла и выходу кремния в раствор с 0,05 мг/мл без модификации до 0,005 мг/мл после. Обработку овальбумином проводят путем сорб-. ции из раствора в емкостях на 100 мл при t = --4 С, Полученный сорбент отмывают:от белка фоновым буфером. Обработка овальбумином сорбентов с тремя и четырьмя слоями гидроксидных групп приводит к практически полному взаимодействию активных центров поверхности сорбентов с белком (85-95%). Отмывка белка фосфатным фоновьзк буфером рН 7,2 с 0,15 М

ЙаС1, а также десорбция белка буферными растворами рН 2,2-9,0 с ионной силой с 0,15 - 1,5 М NaC1 не приводит к снятию белка, т.а. озальбумин

1 вязан с поверхностью прочными имическими связями, при этом увеличение или снижение количества циклов модифицирования (один, два, пять, шесть) при обработке овальбумином снижает количество химически сорбированного белка до 50%, что, в свою очередь, освобождает активные центры поверхности.

Выбранный интервал температур

160-180 С обработки носителя парами четыреххлористого титана обусловлен тем, что при этой температуре поверх ность стекла наиболее гидроксилирована. Увеличение температуры приводит к дегидратации ОН-групп на поверхности, а следовательно, к снижению количества. вступивших з реакцию с Т» С1 гидроксилов, т.е. умень.шению модификатора в поверхностном слое и снижению активности.

Уменьшение температуры обработки приводит к замедлению взаимодействия Т1С64 с гидроксильными группами а также не исключает возможности присутствня молекулярно-связанной воды, которая при взаимодействии с

Т1СС4 может привести к частичному . нековалентному связыванию модификатора с поверхностью носителя, т.е. снижению устойчивости сорбента.

Выбранное время обработки носителя парами Tic9<100-120 мин обусловлено тем, что 100 мин это то время, при котором все гидроксильные группы поверхности вступают во взаимодействие с парами TiC1< . Увеличение времени обработки выше 120 мин не целесообразно, так как поступающие пары, не реагируя, выводятся иэ реактора. Уменьшение времени контакта снижает количество модификатора в поверхностном слое, что, в свою очередь, снижает количество активных центров, вступающих в реакцию с оваль бумином.

Таким образом, необходимость трехчетырехкратного модифицирования обусловлена тем, что увеличение или снижение количества циклов модифицирования при обработке овальбумином снижает количество химически

)0 сорбированного белка до 50%. При этом освобождаются активные центры поверхности, вступающие во взаимодействие с белком или вирусом при ристого водорода и проводят гидро65

15 гель-хроматографии, что является недопустимьм.

Пример 1. Навеску пористого стекла в количестве 1 r с размером пор 2000 А, очищенного от примесей и высушенного при температуре около

180 С, обрабатывают парами четыреххлористого титана в течение 100 мин при 160 С в реакторе проточного типа в токе воздуха. Затем удаляют

25 пары TiC14 и образовавшегося хлористого водорода и проводят гидролиз парами воды. Такую обработку проводят три раза.

Количество титан-оксидных групп

0,24 мг.экв/г. Далее проводят сорбцию овальбумина в емкостях на 100 мл при 4ОС с концентрацией овальбумина 2 мг/мл.

Полученный сорбент промывают фосфатным буфером рН 7,2. Емкость сорбента по овальбумину 100 мг/мл.

Химическая сорбция белка овальбумина

85%.

П р и 1» С р 2. Аналогично примеру 1, но обработку парами четырех40 хлористого титана проводят 120 мин.

Количество титан-оксидных групп

0,25 мг экв/г. Емкость сорбента по овальбумину 108 мг/мл. Химическая сорбция овальбумина 87,4%.

45 П р н м е р 3. Аналогично пРимеру 1, но обработку парами Т(С1 проводят при 180 С. Количество титан-оксидных групп 0,23 мг экв/г.

Емкость сорбента по овальбумину

105 мг экв/г. Химическая сорбция овальбумина 86%.

Пример 4. Аналогично примеру 1, но модификацию проводят четыре раза. Количество титан-оксидных групп 0,30 мг экз/г. Емкость сорбента по овальбумину 120 мг/г.

Химическая сорбция овальбумина 95%.

Пример 5. Навеску пористого стекла с размером пор 2000 A в

1 r очищенного от примесей и выо

60 сушенного при t 180, обрабатывают парами T(С14 в течение 100 мий при т 180 в реакторе проточного типа в токе воздуха. Затем удаляют пары Т О4 и образовавшегося хло1124977

Т а блица 1

Сорбент

1:328 16,0

261 1,26

0,09 лиз парами воды. Такую обработку проводят четыре раза. Количество титан-оксидных групп 0,31 мг экв/г.

Емкость сорбента по овальбумину

118 мг/г. Химическая сорбция овальбумина 93,6Ъ. 5

Гель-хроматографию проводят на колонке с диаметром 0,44 см, пло,щадью поперечного сечения 0,16 смт, высотой слоя сЬрбента 14-15 см, объем сорбента 2,2-2,4 мл при ско- 10 рости элюции 100 мл/ч см . В качестве элюирующего буфера используют фоновый буфер, т.е. 0,1 M фосфатный буфер рН 7,2 на 0,15 М N pC1.

На колонку наносят вирусосодержа- 15 щую аллантоисную жидкость в объеме

0,1 мл (4-5 Ъ от объема колонки).

Запись хроматограммы проводят на приборе РЭППС-1М.

Эффективность выделения и очист 20 ки вируса оценивают по выходу вируса и величине удельной активности (отношение титра вируса к содержанию белка в пике).

В работе используют штаммы вирусов гриппа Х-Ленинград-54/Н N< (табл. 1), A (УФА(Н-< N, ) (табл.2), A-385 (Н)И 2- ) (табл. 3). Опыты по очистке вирусов гриппа проводят на сорбентах на основе пористого стекла и модификаторов окиси титана (при различном количестве циклов

Ьодифицирования) и овальбумина.

Для сравнения испытаны сорбенты на основе пористого стекла и.модификатора поливинилпирролидона.

Результаты представлены в табл.

1-3.

Иэ приведенных данных видно, что модификация пористого стекла титан40

Пористое стекло, модифицированное поливинилпирролидоном (известного) Пористое стекло, модифицированное одним слоем титана (полученное B результате одного цикла обработки) и овальбумином. оксиднпгли группами и свальбумином независимо от применяемых штаммов вируса приводит к значительному увеличению выхода вируса по сравнению с известным. При этом резко сокращается количество белка в вирусном пике, т.е. повышается степень очистки вируса (удельная активность). Оптимальными свойствами обладают сорбенты, полученные в результате трех-четырехкратного модифицирования .пористого стекла титансксидными группами и овальбуми-.. ном.

Таким образом, способ получения сорбента для выделения и очистки вирусов гриппа, заключающийся в Модификации пористого стекла парами

Т1С14 при 160-180 С в течение

100-120 глин с последующим гидролизом продукта парами воды, причем процесс . модифицирования повторяют три-четыре раза, и обработке овальбумином, позволяет создать сорбент, который на стадии гель-хроматографии повышает эффективность вьщеления вирусов гриппа независимо от используемого штамма вируса примерно в два раза при увеличении удельной активности в четыре-девять раз °

Сорбент, полученный по предлагаемому способу, устойчив, не требует повторного модифицирования. Тем самым, увеличивая срок, службы сорбента и снижая затраты на его получение, исключается переход модификатора с поверхности, а также ионов кремния в целевой. продукт, что упрощает технологию получения вакцина

1:328 16,0 343 0,96

1124977

Продолжение табл. 1

Пористое стекло, модифицированное двумя слоями титана (полученное в результате двух циклов обработки) и овальбумином.

0,18

1:328 16,0 313 1,48

Пористое стекло, модифицированное тремя слоями титана (полученное в результате трех циклов обработки) и овальбумином.

0,24

1:656 32,0 170 3,86

Пористое стекло, модифицированное четырьмя слоями титана (полученное в результате четырех циклов обработки) и овальбумином.

0,30

1;656 32,0 183 3,58

Пористое стекло, модифицированное пятью слоями титана (полученное в результате пяти циклов обработки) и овальбумином.

0,46

1:328 .16,0 337 0 97

Пористое стекло,модифицированное шестью слоями титана (полученное в результате шести циклов обработки) и овальбумином.

0,60

1:328 16,0 338 0,97.П р и м е ч а н и е. Исходный титр 1:2048. В табл. 1-3 титр вируса является среднеарифметической величиной, рассчитаннойиэ нескольких опытов.

Таблица 2

Сорбент

Пористое стекло, модифицированное поливинилпирролидоном (прототип) 1:100 39,0 280 0,36

Пористое стекло, модифицированное одним слоем титана (полученное в результате одного цикла обработки) и овальбумином.

1:122 48,0 150 0,81

0,09

Зо

1124977

Продолжение табл. 2

0,18

1:200 78,0 92

0,24

2,17

0F 30

0,46

0,60

П р и м е ч а н н е. Исходный титр 1:256..1

Таблица 3

Сорбент

1!492 48,0 350 1,41

1:584 57,0 135 4,33

0,09

Пористое стекло, модифицированное двумя слоями титана . (полученное в результате двух. циклов обработки) и овальбумином.

Пористое стекло, модифицированное тремя слоями титана (полученное в результате трех циклов обработки) и овальбумином

Пористое стекло, модифицированное четырьмя слоями ти-. тана (полученное в результате четырех циклов обработки) и овальбумином.

Пористое стекло, модифицированное пятью слоями титана (полученное в результате пяти циклов обработки) и овальбумином.

Пористое стекло, модифицированное шестью слоями титана (полученное в результате шести циклов обработки) и овальбумином.

Пористое стекло, модифицированное поливинилпирролндоном (известный) Пористое стекло, модифицированное одним слоем титана (полученное в результате одного цикла обработки) и овальбумином.

1!144 56,0 194 0,74

1:212 83,0 76 2,80

1:130 51 0 180 0,70

1:.146. 57,0 162 0,90

1124977 е табл. 3

1з512 50 0 208 2,46

0,18

О, 24.

0f 30

ОФ46

0,60

Составитель О.Скородумова

Редактор .О.Черниченко Техред Т, Маточка

КорРектоР В.Синицкая

Заказ 8323/5 Тиран 687

ВНИИПИ Государственного комитета СССР, по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Подписное филиал ППП Патент, г.уигород, ул.Проектная,4

Пористое стекло, модифицированное двумя слоями титана (полученное в результате двух циклов обработки) и овальбумином

Пористое стекло, модифицированное тремя слоями титана (полученное в результате . трех циклов обработки) и овальбумином.

Пористое стекло, модифицированное четырьмя слоями титана (полученное в результате четырех циклов обработки) и овальбумином.

Пористое стекло, модифицированное пятью слоями титана (полученное в результате пяти циклов обработки) н овальбумином.

Пористое стекло, модифицированное шестью слоями титана (полученное в результате шести циклов обработки) и овальбумином.

П р и м е ч.а н и е. Исходный титр 1:1024.

1:768 75 0 87,5 8,78

1:748 73,0 60,0 12,47

1:512 50,0 184 2,78

1:584 57,0 150 3,89