Штамм дрожжей @ @ цмпм @ -449,используемый для регистрации прямых генных мутаций

 

Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ЦМПМ Y-449 (Коллекция Центрального музея промьшшенных микроорганизмов института ВНИИгенетика ), используемый для регистрации прямых генных мутаций.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

09) (11) (5))4 С 12 0 1

5188 A

OllHCAHHE ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬ1ТЪ9 (21) 3511207/28-13 (22) 12.11.82 (46) 15.12.86. Бюл. )) 46 (71) Ленинградский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова (72) Л.М. Грачева и Г.В. Касинова (53). 663.18(088.8) (56) Захаров И.А. и др. Мутационный процесс у грибов. "Наука", 1980, с. 25.(аналог) .

N. Loprieno et af."Ми а1доп Res.", 1974, 25, 11 2, 197-217 ° (54) ШТАММ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVLSIAE ЦМПМ Y-449, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ

ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ ПРЯМЫХ ГЕННЫХ МУТАЦИЙ (57) Штамм дрожжей Saccharomyces

cerevisiae ЦМПМ Y-449 (Коллекция

Центрального музея промьппленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика"), используемый для регистрации прямых генных мутаций.

1 113

Изобретение относится к области генетики и представляет собой новый тестерный штамм дрожжей, используемый для регистрации .прямых генных мутаций.

Тестерные штаммы предназначены для оценки генетической опасности, вызываемой химическими и физическими факторами, загрязняющими окружающую среду. Одним из средств фиксирования 1 генетических последствий действия на клетку различных физических и химических мутагенов является регистрация прямых генных мутаций с использованием предназначенных для этого тестерных штаммов. Регистрация мутаций IIQ генам аденинзависимости имеет преимущества перед другими способами определения прямых генных мутаций. Это преимущество заключается в том, что возникающие мутантные колонии отличаются по цвету от колоний исходного штамма и поэтому их легко регистрировать визуально методом простого подсчета.

Известен способ для регистрации прямых генных мутаций на S. cqrevisiae к аденинзависимости, в котором в качестве исходного используют штамм, способный к синтезу аденина и имеющий колонии белого цвета.

Под воздействием химических и физических факторов могут возникать мутации в генах ade T u ade 2, блокирующие синтез аденина и приводящие к накоплению красного пигмента в мутантных клетках. Это позволяет на фоне белых колоний исходного штамма легко регистрировать мутантные колонии красного цвета.

Недостатком такого штамма являет ся малая чувствительность к мутагенному действию различных агентов, обусловленная тем, что регистрация мутаций проводится по двум генам.

В связи с этим при использовании этого штамма требуется проанализировать большое количество колоний (не менее 400000) при испытании. одной дозы вещества в одной повторности. Для этого требуется приблизительно 200 чашек с питательной средой.

Объем работы еще более возрастает при проверке веществ со слабой мутагенной активностью.

Наиболее близким к заявляемому по

t пр п инципу регистрации прямых генных мутаций является штамм дрожжей ЯЬд5188 2

rosaccharomyces pombe SP-198 ade 660. Использовался этот штамм на регистрации прямых белых аденинзависимых мутанов по 5 генам аденинзависимости (ade 1, ade 3, ade 4, ade 5 и

ade 9), возникающих под воздействием химических и физических агентов на фоне красного аденинзависимого штамма, Недостатком этого штамма является невысокая точность определения мутаций, так как использование этого штамма не исключает возможность появления ревертантных колоний, имеющих такой же фенотип, как и мутантные колонии. Поскольку различные физические и химические факторы могут индуцировать различное число ревертантов, точность регистрации генных. мутаций с использованием этого штамма значительно снижается.

Целью изобретения является штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae

1ПГ-216 (зарегистрированный в Коллекции института "ВНИИгенетика" под номером ЦМПМ 7-449), обладающий более высокой точностью и чувствительностью . определения прямых генных мутаций.

В основе принципа действия этого штамма лежит регистрация прямых генных мутаций по 6 генам аденинэависимости (ade 3, ade 4, ade 5, ade 6, ade 7 и ade 8). Мутации в этих генах блокируют накопление красного пигмента в клетках исходного аденинзависимого по гену ade 2 штамма, что приводит к появлению белых мутантных колоний на фоне красных колоний

40 исходного штамма. Большая точность предлагаемого штамма:по сравнению с аналогичным штаммом Shirosaccharomyces pombe обусловлена тем, что прямые белые мутанты по аденинэави45 симости индуцируются на фоне делеции G-668, затрагивающей весь ген

ade 2, что полностью исключает появление ревертантных, т.е. способных к синтезу аденина колоний, также имеющих белый цвет.

Увеличение числа генов до 6 по сравнению с 2 в случае ранее использованного штамма у 9-.15В-ПЧ Sacchaтошусез cerevisiae и с 5 в случае использования штамма SP-198- ade 660 ВЫтозассЕатошусез pombe, по которым могут быть зарегистрированы генные мутации, приводит к большей чувствительности",штамма, как тестер3 ного. Повышению чувствительности штамма способствует наличие клеточной оболочки для химических мутагенов. Введение в генотип штамма мутации rad 2, нарушающей эксцизионную систему репарации, также способствует увеличению его чувствительности.

Полученный штамм дрожжей S.cerevisiae (ЦМПИ-7 449) имеет следующие морфологические и физиологические 10 характеристики. Величина клеток 3суточной культуры на жидкой полной среде составляет 3,6 2,7 ммк. Преобладающая форма клеток — овальная.

Размножение — почкованием. t5

На жидкой полной среде после

3 сут роста образуется осадок, дающий при взбалтывании равномерную муть, пленка не образуется.

При посеве на агаризованную пол- 20 ную среду в чашки Петри через 18 сут образуются круглые колонии красного цвета с -ровными краями диаметром

2,2 см.

Отношение к углеводам. Усваивает глюкозу, галактозу, сахарозу, рафинозу, мальтоэу. Не усваивает декстрин, лактозу, ксилозу, арабинозу.

Отношение к спиртам..Усваивает этиловый спирт, глицерин. Не усва- 30 ивает маннит, дульцит, сорбит.

Отношение к органическим кислотам.

Усваивает молочную и уксусную кислоты.

Для получения заявляемого тестерного штамма были изучены три делеционных штамма Saccharomyces cerevisiae, полученные в секторе радиациойной генетики, у которых делеции затрагивали различные по величине 40 участки гена ade 2. Бып отобран штамм

1ПГ-215 генотипа ade 2 6-668 his Х, у которого частота спонтанного мутирования оказалась наименьшей, а индуцированного УФ-светом наибольшей.. 45

После скрещивания этого штамма со штаммом р9-15В-П4 генотипа à ura

Х ашр 1 был отобран сегрегант генотипа Ф-айе 2 G-668 ura X ump 1 и обозначен как тестерный штамм 1ПГ- 50

216. Для введения мутации. радиочувствительности rad 2 штамм 1ПГ-216 был скрещен со штаммом 7-ПГ-59 генотипа Ы ade 1 rad 2.

Для проверки штамма как тестер— ного в качестве мутагенов были выбра> ны УФ-свет, как сильный мутаген, и метилметансульфонат (ММС), как слабый мутаген. Условия проверки следую188 4 . щие. На суспенэию клеток испытуемого штамма действовали указанными мутагенами в различных дозах. Затем контрольную и обработанную суспенэию клеток разводили и высевали на чашки

Петри с питательной средой, содержащей спирт. На такой среде не. вырастают мутанты с дыхательной недостаточностью, имеющие такой же цвет колоний (белый),как и аденинзависимые мутанты. Разведения подбирали таким образом, чтобы при учете выживаемости на чашках вырастало не более 500 колоний, а при подсчете числа мутантов — от 2000 до 5000 колоний.

О чувствительности штамма к воздействию мутантов судили по частоте мутирования, которую определяли как отношение числа мутантных колоний, отнесенное к общему числу выживших колоний. В каждом опыте также учитывали число мутантных колоний, возникающих в необработанном контроле. (спонтанный фон).

Летальный и мутагенный эффекты

УФ-света и ММС на штамм Ц1ЯМ 7-449 представлены в таблице. Действие

УФ-света изучали на штамме 1ПГ-216 без мутации rad 2, так как наличие последней в генотипе штамма очень сильно увеличивает летальный эффект

УФ-света.

Как следует из данных таблицы, заявляемый штамм позволяет регистрировать прямые генные мутации и при действии слабого мутагена ММС.

При этом введение мутации rad 2 увеличивает чувствительность штамма, мутагенный эффект ММС проявляется при более низких концентрациях. Это очень важно при проверке на мутагенную активность слабых мутагенов или веществ, присутствующих в очень малых концентрациях.

Для сравнения чувствительности гестерных штаммов на дрожжах-сахаромицетах заявленного и обычно используемого штамма, позволяющего регистрировать мутации по двум генам аденинэависимости (ade 1 и ade 2), рассмотрим данные по индукции мутаций

УФ-светом у штамма ЦМПМ 7-449 и данные штамма. У9-15В-П4 Saccharomyces

cerevisiae. При одинаковой выживаемости (22X) у штамма ЦМПМ Y-449 частота индуцированного мутагенеза

88 6

Преимущества заявляемого штамма по сравнению с прототипом SP-198 ,ade С-60 Scizosaccharnmyces pomhe) состоят в следующем.Воздейст вие штамма

Генотип

Выживаемость по отношению к

Доза воздействия

Отношение

Частота мутаций на 10 числа мутантов к общему числу просмотренных колоний за вычетом спонконтролю, Ж танного фона

УФ-свет L ade 2 С-668 Дж/м/с игаХ ump 1 165,6

703/191322 23,7

513/109642 52/9

246/15450 118,7

36,0

22,7

248,4

496,8

1,3

102/6958 146,0

0,5

552,0

Lade 2 С-668 мкг/мл

ura Xump 1 250

1)/242362

23/439524

5/31673

7/17550

23/183907

30/190060

6/27810

20/38190

0,1

75,6

0,3

27,5

500

1,4

6,9

750

2,9 °

3,8

1000

0,2

53,4

Аade 2-G-668 игаХ ump 1

rad 2

250

500

1,5

5,5

4,0

1,2

750

100

4,2

3,4

5 11351 на 1О 4 составляет 52,9, а штамма

У9-15В-П4 — 2,7,т.е. в 19,6 раза меньше..

Следовательно, увеличение числа генов, по которым регистрируются 5 индуцируемые мутации, значительно

Исключена возможность появления увеличивает чувствительность штамма. ревертантов, имеющих тот же Фенотип, Штамм-прототип относится к друго- что и индуцируемые мутанты, из-за му роду дрожжей, чем предлагаемый наличия в генотипе штамма цМПМ 7-449 нами штамм. Шизосахаромицеты отли- 10 делеции С-668, полностью захватываючаются от сахаромицетов многими свой- щей весь ген аде 2. ствами, в том числе способом раэмно- Учет индуцируемых мутаций ведется жения (делением клеток, а не пачко- по 6 генам аденинзависимости (у прованием) и числом хромосом (3-у шизо- тотипа по 5). сахаромицетов и 17 — у сахаромицеf5 тов). На дрожжах Saccharomyces сеге- Наличие в генотипе штамма мутации

visiae штамм, аналогичный штамму-про- ump, приводящей к повышению пРониНатотипу, неизвестен. Однако по принци- емости клеточной оболочки. пу регистрации прямых генных мута- Эти преимущества приводят к более ций штамм-прототип является наиболее высокой точности и чувствительности

20 близким. определения прямых генных мутаций.

Чувствительность штамма ЦМПМ 7-449 к летальному и мутагенному эффектам УФ-света и ММС