Способ выделения надокисной дисмутазы из белковых растворов

 

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ НАДОКИСНОЙ ДИСМУТАЗЫ ИЗ БЕЛКОВЫХ РАСТВОРОВ, включающий хроматографию ферментсодержащего белкового раствора на катионообменной смоле, отличающ и и с я тем, что, с целью увеличения выхода и повышения степени чнстоты фермента, хроматографию ферментсодержащего белкового раствора ведут при рН 4,7-5,0 на катионообменной смоле с той же полярностью, что и надокисная дисмутаза, причем в качестве катионообменной смолы используют карбоксиметипцеллкшозу или декстраны, содержапдае карбоксиметильные или сульфопропипьные группы , или агарозы, содержащие карбоксиО ) метильные группы. С

COIO3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (Я)4 А 61 К 37 48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 2929201/30-15

{22) 16.05.80 (31) 1687/80 (32) 21.04.80 (33) DK (46) 07.10.85. Бюл. Ф 37 (72) Джек Таанинг Йохансен (DK) (71) Де Форенеде Бриггерир А/С (ПК) (53) 615.779.94(088.8) (56) 1. Petersen К. et а1.,Carlsberg

Res. Commun, 1977, 42, р. 391-395.

2. Патент Дании У 131091, кл. А 61 К 37/02, 1975 °

3. $.А. Gosc in and I. Fr idovich.

The purification and proporties of

supегоxide dismutase from $accharomyces cerevisial. — Biochim. Biophys.

Acta, 1972, 289,. р. 276-283.

„.SU„„11 A (54) (57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ НАДОКИСНОИ

ДИСИУТАЗЫ ИЗ БЕЛКОВЫХ РАСТВОРОВ, включакиций хроматографию ферментсодеркащего белкового раствора на катионообменной смоле, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью увеличения выхода и повыщеиия степени чистоты фермента, хроматографию ферментсодерзащего белкового раствора ведут при рН 4,7-5,0 на катионообменной смоле с той ае полярностью, что и надокисная дисмутаза, причем в качестве катионообменной смолы используют карбоксиметипцеллюлозу или декстраны, содержащие карбоксиметильные или сульфопропильйые груп- Я пы, или агарозы, содержащие карбокси«. метнльные группы.

1184434

Изобретение относится к способу извлечения содержащей медь и цинк надокисной дисмутазы (НЕД) из вод— ных растворов, содержащих указанный энзим совместно с сопутствующими 5 протеинами.

Надокисные дисмутазы представляют собой энзимы, каталитически воздействующие на дисмутацию надокис— ного радикала О, до кислорода и пе- 10 рекиси водорода

20г + 2Н вЂ” Н Ог + Ог

Энзимы, обладающие этим свойством, выделены из многочисленных различных организмов. 15

Надокисные дисмутазы, содержащие медь и цинк в их активных участках обнаружены в цитоплазме эвкариотов.

Эти энзимы представляют собой двумерные молекулы, которые проявляют 0 высокую степень гомологии в свойственной им последовательности аминокислот (1) .

Другой класс надокисньгх дисмутаз, е содержащих железо или марганец в их активных участках, обнаружен в прокариотах и эвкариотной митохондрии.

Следовательно, у этого класса имеет место большое сходство в составе аминокислот и -оконечных амино30 кислот. Однако существенная гомология между двумя классами надокисных дисмутаз отсутствует. По-видимому функция дисмутаз, состоит в защите клеток аэробных организмов от токсических воздействий перекисного радикала, являющегося побочным продуктом реакции-кислорода в организме. Считают, что надокисный радикал вызывает различные воспалительные

40 процессы в тканях и что он содействует появлению ревматоидных артритов. По этой причине предложено использовать надокисную дисмутазу для лечения воспалительных заболеваний и,воз45 можно, ревматоидных артритов, Терапевтическое действие содержащей медь и цинк надокисной дисмутаэы в отношении воспалительных заболеваний установлено опытным путем. Таким образом, большое значение имеет разработ50 ка способа измельчения содержащей медь и цинк надокисной дисмутазы в промышленном масштабе и с высоким выходом, 55

Среди содержащих медь и цинк надокисных дисмугаз, в наибольшей степени изучен бычий энзим. Так, известны полная последовательность аминокислот и рентгеновская структура этого энзима. Кроме того, проведены исследования разнообразными спектроскопическими способами.

Содержащую медь и цинк надокисную дисмутазу, быков и других высших кивотных, извлекают, например, из органов и тканей, в особенности из печени, путем экстрагирования мелко изрубленной ткани холодным буферным раствором, а в случае крови путем гемолиза эритроцитов. После этого, в обоих случаях, из полученного раствора водорастворимых протеинов производят извлечение НЕД.

Извлечение осуществляют, например, путем фракционированного осаждения органическими растворителями или сульфатом аммония, в произвольном случае — в сочетании с денатурацией лобильных по отношению к нагреванию протеинов, вызываемой нагреванием в присутствии ионов двухвалентных металлов, или хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе или на других ионообменных смолах. Низкомолекулярные загрязняющие примеси обычно удаляют из очищенного раствора путем диали=-а или подвергают такой раствор фильтрованию с помощью геля на геле декстрана.

Известен способ очистки энзима посредством пропускания раствора эн .; зима через буферный раствор, обладающий ионной силой до 10 молярной концентрации, при рН 5,5-8, находящийся в колонне с ионообменной смолой, причем эта смола обладает группировками слабоосновного или слабокислотного характера, привлекающими ионы противоположной полярности. В качестве смолы может быть использована карбоксиметилцеллюлоза, однако этот продукт в интервале рН

5,5-8 не обладает противоположной полярностью относительно НЕд (2) .

Ъ

Известен двухфазный способ извлечения содержащей медь и цинк надокисной дисмутазы из дрожжей согласно которому полученную после замораживания и оттаивания плотную дрожжевую массу, перемешивают приблизительно в таком же объеме смеси этанола с хлороформом в объемном соотношении

5:3 в течение нескольких часов при о

25 С. Затем смесь центрифугируют, всплывший прозрачный слой смешивают

11844 34 4

55 с твердым вторичным кислым фосфатом калия (К„НР0,1), выделенную солью органическую фазу отделяют и осветляют центрифугированием. После этого осаждают протеины добавлением холодного ацетона, осадок повторно растворяют в холодном фосфатном буфере при рН 7,8 и очищают от имеющих коричневатый цвет примесей микрогранулированной дизтиламиноэтилцеллюлозой ДЕ-32. Светло-зеленый фильтрат диализуют относительно фос. фатного буфера при рН 7,8 и после осветления центрифугированием кроматографируют на колонке, содержащей

ДЕ-32 (3) .

В результате обработки водных растворов протеина согласно известному способу или не удается получить достаточно чистшй продукт, или же процессы настолько сложны, что приводят к слишком малому выходу чистого энзима.

Цель изобретения — увеличение выхода и повышение степени чистоты фермента.

Для достижения цели согласно способу выделения надокисной дисмутаэы из белковых растворов, включающему хромстографию ферментсодержащего белкового раствора на катионообменной смоле, хроматографию ферментсодержащего белкового раствора ведут при рН 4,7-5,0 на катионообменной смоле с той же полярностью, что и надокисная дисмутаза, причем в качестве катионообменной смолы используют карбоксиметилцеллюлозу или декстраны, содержащие карбоксиметильные или сульфопропильные группы, или агарозы, содержащие карбоксиметильные группы.

Пример 1 ° Процесс согласно ° изобретению обеспечивает хорошее выделение НЕД иэ смеси с другими, имеющимися в наличии протеинами, в водных растворах, полученных из указанных. различных сырьевых материалов, несмотря на то, что согласно теории монообменные смолы проявляют сродство лишь к веществам, имеющим противоположную полярность. Таким образом, катионообменные смолы и НЕД могут иметь одну и ту же полярность в предлагаемом интервале рН.

Ф

В качестве катионообменных смол могут быть использованы следующие: различные марки карбоксиметилцеллю5

1О

40 лозы, в частности КМ-23 и У -52 (фирмы "Ватман Лимитед", Великобритания), карбоксиМетилцеллюлоза КИСефацел (фирмы "Фармациа Файн Кеми-. келэ АБ", Швеция), имеющий поперечные связи декстран, замещенный карбоксиметильными группами, под названием KM-Сефадекс (чирья: "Фармация

Файн Кемикелэ АБ"), имеющий поперечные связи декстран, замещенный сульфопропильными группами, под названием СП-Сефадекс (фирма "Фармациа

Файн Кемикелз АБ"), и имеющая поперечные связи агароза, замещенная карбоксиметильными группами, под названием KN-Сефароза КП-6Б (фирма

"Фармация Файн Кемикелз АБ").

Хроматографирование раствора на катионообменной смоле может осуществляться периодически путем перемешивания гранулированного ионообменивающего продукта в растворе, однако более выгодно осуществлять эту операцию в колонне. Такая операция легко осуществима в условиях крупномасштабного производства и обеспечивает адсорбцию всего энзима на ионообменной смоле.

После очистки раствора посредством ионообменной хроматографии, активные фракции продукта, отмытые иэ адсорбента, можно дополнительно очищать по известному способу фильтрования с применением геля или фракционированного спиртового осаждения, дополнительно подвергая очищенный продукт хроматографировачию один или несколько раз. Предпочтительно диалиэовать активные фракции против дистиллированной воды и концентрировать досуха, желательно путем высушивания вымораживанием.

Пример 2. 2,5 л диэтилового эфира добавляют к 20 кг хлебопекарных дрожжей (Saccharomyces cerevisial) и смесь оставляют на 30 мин при перемешивании. После дополнительного примерно 2-часового перемешивания при 25ОС добавляют 20 л горячей воды, доводят рН до 7,5 и продолжают перемешивание 4 часа при

45 С. После дальнейшего 16-часового перемешивания, сопровождающегося постепенным снижением температуры до 25ОС, доводят рН до 4,8 и суспенsHIo осветляют центрифугированием при 2000-кратном значении С в течение 30 мин.

1184434

Для удаления соединений с низкой молекулярной массой полученную после центрифугирования жидкость пятикратно разбавляют буфером в виде

0,01.M раствора ацетата натрия при рН 4,8 и сокращают в объеме до

10 л, применяя ультрафильтрование °

Последнюю процедуру повторяют дважды.

К концентрированному раствору !О добавляют 1 л микрогранулированной карбоксиметилцеллюлозы KN-52 (фирма "Ватман Лимитед" ), которая уравновешена с помощью 0,025 М раствора ацетата натрия в качестве буфе- !5 ра, и смесь перемешивают 1 ч. Карбоксиметилцеллюлозу собирают в колонну диаметром 30 см, промывают

i0 л буфера г виде 0,025 М раствора ацетата натрия при рН 4,8 и перено- 20 сят в колонну диаметром 10 см. В этой колонне осуществляют отмывку из адсорбента раствором ацетата .натрия при наличии линейного гра— диента концентрации (0,025- 0,200 N) при рН 4,8 в общем объеме 6 л. Скорость перемещения потока 400 мп/ч.

Собирают фракции по 30 мл. Собранные активные фракции, имеющие интенсивно-красную окраску, объединяют 30 и концентрируют посредством ультрафильтрования до проведения высушивания вымораживанием.

Пробу, полученную после высушивания вымораживанием, повторно растворяют в 50 мл 0,025 М раствора ацетата натрия, служащего буфером, при рН 4,8 и переносят в 5 40 см колонну с гелем декстрана (Сефадекс Г-50

Суперфайн, фирма "Фармация Файн Ке- 40 микелз АБ"), уравновешенного относительно ацетатного буфера. Ьаходящийся в колонне адсорбент отмывают

1 л 0,025 M раствора ацетата натрия при рН 4,8 и собираю; фракции по 45

5 мл. Скорость движения потока составляет 110 мл/ч. В результате хроматографирования на геле зеленая, содержащая медь и цинк, перекисная дисмутаза отделяется от красного гемипротеина, хотя обе полосы расположены очень близко.

Активные фракции объединяют и переносят в 5 ° 10 см колонну, заполненную СМ-52 и уравновешенную 0,025 M 55 раствором ацетата натрия при рН 4,7.

Адсорбент, находящийся в колонне, отмывают при наличии линейного градиента изменения концентрации ацетата (0,0250,200 М) при рН 4,8. Применяют общий объем 1200 мл при скорости движения потока 200 мл/ч и собирают фракции по 6 мл. Активные фракции объединяют, диализуют относительно дистиллированной воды и высушивают вымораживанием.

Фильтрование с наличием геля можно повторить при проведения осаждения спиртом. Пробу, высушенную вымораживанием, после периодически проведенной операции с СМ-52 растворяют в

100 мл буфера в виде 0,005 M раство-.. ра фосфата калия при рН 7,0 и постепенно добавляют 57 мл этанола. После 10-минутного центрифугирования при 13000 об/мин добавляют еще одну порцию 166 мл этанола к жидкости, полученной после центрифугирования.

Осадок собирают центрифугированием при 13000 об/мин и повторно растворяют в 50 мл буфера в виде 0,025 М раствора ацетата натрия при рН 4,8.

После этого пробу переносят в колонну с CN-52, как описано выше активные фракции диализуют против дистиллированной воды, затем высушивают вымораживанием.

Результаты очистки даны в табл.1.

Выход после фракционирования с применением KM-52, что предусматривает 115-кратную степень очистки по отношению к концентрату после ультрафильтрования, составляст 75Х от общего числа единиц в концентрате.

Если катионообменное хроматографирование проводят таким же образом, но с применением других катионообменных смол получают следующие выхода НЕД, X:

KN-52 75

Км-23 61

KN-Сефадекс Г50 75

КМ-Сефароза КЛ-6Б 85

СП-Сефадекс 64

Пример 3, Гемолиз и очистка гемоглобина.

7 л декантированной крови, которая уже содержит около 2 л плазмы и такйм образом соответствует приблизительно 5 л уплотненных кровяных

% телец, смешивают с 7 л 96Х-ного этанола при интенсивном перемешивании.

Через 1 ч добавляют 15 л деионизированной воды и продолжают перемешивание еще 30 мин. о

7 11844

Суспензию центрифугируют на центрифуге с к .рзинкой, типа MSE, приблизительно при 2000 об/мин и полученную йлотную массу гемоглобина промывают 2 л воды до опустошения центрифуги. Получают 29,1 л выделенной на центрифуге жидкости.

Выделение углекислотной ангидразы.

Выделенную на центрифуге жидкость 1О обрабатывают на 1Х12 см цилиндрической .матрице. Сефароза — глицилтирозиназобензолсульфонамид. Углекислотную ангидразу отмывают из адсорбента 0,2 М водным раствором тиоцианата 15 . калия, содержащим 0,05 моль тркс

-сульфата и имеющим рН 6,5.

Выделение НЕД и каталазы.

Раствор, содержащий НЕД и каталазу, доводят дь рН 4,75 с помощью

М уксусной кислоты и пропускают через 20 см колонну, заполненную плотным слоем 2 л КИ-23, который уравновешен в 20 мМ ацетатом натрия в качестве буфера, рН 4,8. Скорость движения потока приблизительно 15 л/ч. Затем ионообменник промывают 15 л буфера в виде 20 мМ ацетата натрия, рН 4,8.

Отмывку из адсорбента, находящегося в колонне, производят при линейном градиенте 3 л 1000 мИ и 3 л

200 мИ ацетата натрия и скорости движения потока 1 5 л/ч. НЕД отмывают приблизительно при 150 мИ ацетате натрия. 35

Каталазу отмывают из адсорбента с помощью О, 1 М раствора фосфата натрия в виде буфера.

Фракции, содержащие НЕД и каталазу, собирают раздельно и ультрафильтруют на мембране ДДС-600 в камере

34 8

ДДС-МФ (фирма "Де данкске Суккер Фаб-, рикер А/С").

Очистка НЕД..

Раствор НЕД диафильтруют с применением 10 мМ натрий-фосфатного буфера при рН 7,5 и дополнительно очищают хроматографией на ДЕ-52 колонне

" 8 см, уравновешенной 10 мМ натрийфосфатным буфером при рН 7,5. Колонку проявляют при линейном градиенте

2 600 мл 10 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,5 содержащего О- 0,125 М хлорид натрия. Скорость движения потока 110 мл/ч. Собирают фракцим по

10 мл.

Фракции, содержащие НЕД, объединяют. Удельная активность и адсорбционный спектр свидетельствуют о чистоте энзима.

Очистка каталазы.

Раствор каталазы после ультрафильтрования очищают путем фракционирования сульфатом аммония.

Регенерация колонны КМ-23. После отмывки каталаэы через колонку пропускают 3 л 0,5 М раствора гидрата окиси натрия, затем 3 .л воды. Далее через колонку пропускают 3 л 0,5 И раствора хлористоводородной кислоты, после этого 3 л воды и 3 л натрийацетатного буфера при рН 4,8 °

Колонну в заключение обрабатывают 20 мМ натрий-ацетатным буфером при рН 4,8 до тех пор, пока проводимость и рН жидкости, вымытой из адсорбента, не станут такими же, как у буфера. После этого колонка готова для употребления.

Результаты выделения и очистки

НЕД, каталазы и углекислотной ангид-. разы из 5 л красных кровяных телец приведены в табл. 2.

Ef

K Gf (4

U о х

o w о

<

1 «1

Ж 1

<л

<О

«

Ю о О

o o

<ч о

<л OO о о м

«,о

Ю

kf о

5 о о

<ч м

1й о

«<л

<л

Ю

Ю

<< о

< о

<ч л

<ч

<ч л о

О! л м

Ч о о о

<О

<ч

<л

<ч л о

<ч

<ч О о

° >

<Г\ о

<л

О л л о о о

QO о о о о о о л о о

<л

)ф

Н Ф

<О <О о о о л о о о

Сб

<ч

CO о

<ч

CO сл о о

<

Р «!

3; х о о а,с

À Х Е, 1

< о

Ф

CO

Ф и м л л

<ч о

<ч л

В о х х х е

I

Ev x

<О Х о хе со оо л Д О

С4 Р

1 !л Я х ю

& Э Q

«< Х

3 е <ч < о е

X о х

1184434

I 1 й5 ахи

Й 54

1 х

ы о

«! 1 д о

° 9 Х е <ч

Б и х

Ф о е

О х о х о х е х

4 5 х

)Д

2 е и И о о о

О

>Е о « х <с

О, О о <1- О.

fc x о и

g u

I x х о

<

О, О

Я

«< о е

О х о х

«4 5 3 I

1184434!

1Таблица 2

Выход

Углекислотная

Выход, Х

Каталаэа, мг

НЕД, Выход, мг Ж

Объем, л

Условия процесса ангидраза, мг

7 л декантированной крови+7 лэтанола 14

Добавление 15л воды

Центрифугирование и промывка

100 11000

29, 5 365 100 1600

100

1 3 300 82 бтмывка иэадсорбента каталазы

1400

Ультрафильтрование раствора НЕД 0 25 290 79

0,30 290 79

Редактор В.Петраш

Заказ 6288/57 Тираж 721 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г.Ужгород, ул.Проектная, 4

Аффинитное хроматографирование и отмывка из адсорбента углекислотной ангидразы

Колонка СМ-23 и отмывка из адсорбента НЕД

Колонка ДЕ-52 и отмывка иэ адсорбента

Составитель А.Макаров

- ТехредМ.Гергель Корректор И.Зрдейи