Способ получения антибиотиков а51568-фактора а и а51568- фактора в

 

Способ получения антибиотиков формулы .

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Гяютз1антаиии

b с1

О О ф с1 o) ("o g м нс мн ll с; — ин

Ъ сн,1,: "

С

Ф 1 (-Hg СН вЂ” о w

O=C

Ън

) Ф н 4А он

НООСГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3679352/28-13 (22) 19.12.83 (31) 450880 (32) 20.12.82 (33) US (46) 23.11.85. Бюл. № 43 (71) Эли Лилли энд Компани (US) где n=1 (A51568-фактор А);

n=2 (A51568-фактор В), заключающийся в том, что штамм

N0cardia oriental is NRRL 15232 культивируют в питательной. среде, содер(59 4 С 12 Р 1/06// (С 12 P 1/06, С 12 R 1:365) (72) Марвин Мартин Хен и Гари

Дж. Маркони (VS) (53) 615.779.9(088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ

А51568-ФАКТОРА А И А51568-ФАКТОРА В. (57) Способ получения антибиотиков формулы кащей источники углерода, азота и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях с последующим выделением из культуральной жидкости целевых продуктов.

1 11

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков.

Целью изобретения является создание способа получения новых антибиотиков, активными против грамположительных микроорганизмов.

Для осуществления способа используют штамм Nocardia ozientalis NRRL

15232, который характеризуется сле- дующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Имеет субстрактный и воздушный мицелий. Воздушные гифы похожи на паутину, при глубинном культивировании в условиях встряхивания разрываются на короткие фрагменты.

Рельеф споровой поверхности гладкий. Форма споры меняется.от сферической до цилиндрической. Образует споры в незначительном количестве и нерегулярно.

Солодовый агар с дрожжевым экстрактом (МСП Р 2), Рост обильный, складчатая .поверхность. Воздушный мицелий обильный, серый. Растворимый пигмент красновато-коричневый.

Крахмальный агар с неорганическими солями (МСП 9 4). Рост обильный, воздушный мицелий обильный, перламутровый белый. Растворимый пигмент отсутствует.

Глицерин — аспарагиновый агар (МСП Р 5). Рост обильный. Воздушный мицелий обильный, перламутровый белый. Растворимый пигмент светло-.коричневый.

Тирозиновый агар (МСП У 7). Рост обильный. Обратная сторона колонии черного цвета. Воздушный мицелий обильный, желтый. Растворимый пигмент темный, красновато-коричневьпл.

Агар Чапека. Рост хороший. Воздушный мицелий хороший, перламутровый белый. Растворимый пигмент светло-коричневый.

Агар Эмерсона. Рост обильный, морщинистый, слоистый. Воздушный мицелий хорошо развит, бледно-желтый.

Глицерин — глицин . Расх обильный. Воздушный мицелий обильный, перламутровый серый. Растворимый пигмент оливково-коричневый.

Цельные клетки по сахарному составу относятся. к типу А, а клеточная оболочка — к типу 1У;

Физиолого-биохимические признаки.

Каталаза положительная.

94285 2

Разлагает коэеин, ДНК, гипоксантин, тирозин, мочевину, ксантин, не разлагает аденин.

Желатину разжижает.

Гидролизует эскулин, снятое молоко, крахмал.

Меланоидная пигментация отрицательная. Нитрит из нитрата не образует.

Фосфатаза положительная.

10 Совместимость с NaC1 8Х.

Устойчив к лизоциму, пенициллину, рифампицину; чувствителен к бацитра-, цину, новобиоцину.

Вырабатывает. уреазу. Усваивает углеродсодержащие соединения.и органи-. ческие кислоты.

Грамноложительный.

Выживает при 50 С 8 ч.

Температурный интервал 10-40 С.

Сбраживает углеводы до кислоты:

L (+)арабинозу, целлобиозу, i-эритрит, фруктозу, Й(+)галактоэу, глюкозу, .глицерин, i-инозитол, инулин, d(+)лактозу, d(+)мальтозу, Й(-)маннит, Й(+)маннозу, Й(+)мелезитоэу, d-метилD-глюкозид, салицин, сахарозу, d(+) . трефалозу, й(+)ксилоэу; не сбраживает адонитол, целлюлозу, дульцитол, d(+)мелибиоэу,,d(+)рафинозу, L(+)рамнозу, d(-)сорбит.

Пример 1. Получение посевной культуры первой стадии.

Для выращивания Nocardia orienta1is NRRL 15232 на скошенном агаре готовят следующую среду, г/л: термически обработанная овсяная мука 60,0: дрожжи 2,5; К НРО 1,0; исходный минеральный раствор Чапека 5,0 мл/л; агар 25,0; дистиллиро40, ванная вода до 1,О.л. . Исходный минеральный раствор Чапека

-:содбржит, г/100 мл: КС1 10,0; MgSO

«7Н О 10,0; PeSO< 7Н О 0,2; дистиллированная вода до 100 мл.

Перед стерилизацией раствор с рН

6,2 доводят до рН 7,3 водным раствором гидроокиси натрия. После стерилизации рН среды 6,7.

Споры штамма высевают на скошенный агар вышеуказанного состава и инкубируют в течение 7 дней при

30 С. Затем культуру заливают стерильной дистиллированной водой и снимают культуру стерильным инстру55 ментом для диспергирования спор и мицелия. 1 мл споровой суспензии используют для засева 50 мл вегетативной среды, имеющей. следующий сос тав, г/л: картофельный декстрин

Diaion HP-20 (высокопористый стиролдивинилбензольный сополимер в форме. шариков), помещенную в колонку размером Зх25 см. Элюент отбрасывают и колонку промывают 1 л воды и 500 мл 25X-. ного раствора метанола в воде. Смесь антибиотиков элюируют из колонки дважды по 500 мл 50X-ro водного раствора метанола. Факторы А и В одинаково. адсорбируются на HP-20 и элюируют с этой смолы в одинаковых условиях.

Фракции элюата оценивают на антибиотическую активность с использованием В. subtilis. Более активные фракция .концентрируют до небольшого объема и лиофилизуют. Получают сырую антибиотическую А 51568-смесь весом.

905 мг.

Пример 3. Очистка антибиотической А51568-смеси.

Сырую антибиотическую смесь растворяют в 50 мл воды и наносят на колонку размером 1,7х44 см, заполненную

Сефадексом СМ-25 в. МНу форме. Элюент отбрасывают, колонку промывают 250 мл воды. Затем колонку элюируют элюентом, в котором концентрация бикарбоната аммония нарастает по вогнутой кривой (Н О - 1 MNH HCO>, ячейка смешения 100 мл). Собирают 50 фракций по 25 мл и проверяют их на антибиотическую активность с использованием

В, subtilis.

Факторы А н В элюируются в различ35 ных фракциях. Для обессоливання продукта отобранные фракции с фактором А наносят на хроматографическую колонку размером 1,7х10 см, запаенную

40 смолой Dia ion HP-20 которую предварительно вйдерживают в воде до равновесного набухания, и колонку промывают водой, после чего элюируют 100 мл

50X-ro водного раствора метанола.

Метанольный элюат выпаривают до сухого остатка. Остаток растворяют в небольшом количестве воды и подкисляют

0„1N водным раствором хлористоводородной кислоты. Затем подкисленную смесь лиофилизируют. Получают 25 мг очищенного антибиотического А51568фактора А.

Для выделения фактора В используют методику по примеру 3 с использованием анализа с помощью жидкостной хроматографии высокого давления вместо анализа с помощью В.subtilis.

Отдельно отобранные фракции обессоливают аналогично фракции А

3 1194285

30,0; патока 20,0; бактепентон 7,0;.. с -тирозин 1,0; дистиллированная вода до 1,0 л; РН 5,5. Доводят рН до 7,0. водным раствором гидроокиси натрия перед стерилизацией, после стерилизации РН 6,1.

Вегетативный посевной материал инкубируют в 250 мл широкогорлой колбы Эрленмейера при 308С в течение 48 ч на аппарате для встряхива-. 1б ния, вращающемся по дуге диаметром

5,08 см со скоростью 250 об/мин.

Эту инкубационную среду используют либо для засева небольших фермента-. торов (концентрация засева 0,8 об.% в об.среды),.либо для засева сосудов второй стадии„ предназначенных для получения большего объема мицелия.

Ферментация .А 51568,1.

100 л ферментационной среды засевают 0,8% (800 мл} вьппеописанной культуральной жидкостью.

Ферментационная среда имеет. следующий состав, г/л: полипропиленгликоль (2000) 0,2; картофельный декстрин Difco 30,0; патока 20,0; бактопептон ЭНсо 7,0; о -тирозин 1,0; дистиллированная вода до 100 л; РН 5,2. Водным 5N раствором гидроокиси натрия доводят

РН среды до 7, 1, стерилизуют при

121 С и давлении 1,19 — 1,33 кг/см2 в течение 45 мин. После стерилизации рН среды 6,2.

Ферментацию ведут в f65-литровом ферментационном танке в течение приблизительно 114 ч при 30 С.

Аэрацию ведут со скоростью 0 15V/V/

/мин и перемешивают обычной мешалкой со скоростью около 200 об/мин..

Накопление антибиотика в культуральной среде контролируют центрифугированием образца культуральной.жидкости при 1000 g и декантируют супернатант для анализа. Образец разбавляют фосфатным буфером с рН 6,0 и подвергают микробиологическому . анализу испытанием на чашке с агаром с использованием Nicrococcus luteous

АТСС 8341 в качестве теста-микроба.

Пример 2. Выделение антибиотической А51568-смеси.

К 3 л культуральной жидкости, содержащей факторы А и В в соотношении приблизительно 95:5, добавляют фильтровальный брикет (кизельгур) и смесь отфильтровывают. 2,7 л фильтрата с рН 7,8 наносят на смолу

194285 6

1 диметилформамида получают значения

Для удаления соли, добавленной на предыдущей стадии, каждый набор фракций наносят на колонку со смолой

Diaion HP-20, которую элюируют

5 -ным раствором изопропилового спирта, ссодержащего 0,1Ж Н РО,.

Соответствующий набор фракций на каждой колонке отбирают на основании анализа с помощью жидкостной хроматографии высокого давления.

Для набора фракций концентрируют

3 и получают один продукт, обогащенный фактором А, и второй продукт, обогащенный фактором В.

Пример 4. Выделение, очистка и разделение А51568-факторов А и В.

Для отделения А51568-смеси факторов А и В от культуральной жидкосФ ти последнюю фильтруют через фильтр

Hyflo supercel. После доведения фильтрата до рН 6,0-6,5 с помощью

5NHC1 прибавляют смолу Jonac . Х-236(Н ) и смесь перемешивают для адсорбции антибиотиков. Супернатант отбрасывают и молу промывают водой (10 V смолы). После отбрасывания промывных вод. смолу Х-236 помещают в колонку, которую элюируют О, 1N раствором хлорида аммония ,(5 7 колонки), фракции объемом

-4 л сразу нейтрализуют 5N НС1.

Контролируют антибиотическую актив1 ность с помощью S.aureus и жидкостной хроматографии высокого давления.

Фракции, содержащие А 51568-факторы А и В, отбирают и для обессолива-. ния смеси пропускают через колонку со смолой Diaion HP-20. Элюент отбрасывают. Затеи смолу элюируют

5 -ным раствором иэопропилового спир та, содержащим 0,!Х НЗРО . Фракции по 500 мл собирают и определяют в них антибиотическую активность, Активные фракции соединяют, концентрируют и лиофилизируют.

Для дальнейшей очистки продукта и одновременного разделения факторов. А и В загрязненную смесь факторов А и В растворяют в воде и наносят на колонку с СИ-сефадексом С-25.

Колонку элюируют,линейным градиентои от воды до 0,,25М ИН НСО>. Фракции анализируют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления и фракции, содержащие фактор А, собирают отдельно от фракций, содержащих фактор В.

4Q

4$

50 лиофилизируют и получают соответственно практически чистый А51568фактор А и практически чистый

А51568-фактор В.

Антибиотик А51568-фактор А представляет собой белое, аморфное твердое соединение. .Элементный состав, Х: углерода

50,63; водорода 5,07; азота 8,36; хлора 8,19; кислорода 25,16.

Молекулярный вес около 1435.

Эмпирическая формула С Н зС1 N 0<< .

Потенциометрическим титрованием фактора А в 66Х-ном водном растворе рКа, равные 6,2; 8,8; 10,3 и 12,85 (первоначальный. рН=6,12).

Удельное, вращение: С 3 р =20, 4 (C=10 мг/мл „вода), (м) =-33, 6 (С=-10 мг/мл, вода) .

Спект р инфракрасного поглощения в таблетке из KBr, максимум поглощения: 3400 (широкий, сильный), 3380 (широкий, сильный), 1657 (широкий, сильный), 1587 (средней интенсивности), $505 (средней интенсивности), 1424 (средний), 1396 (средний), 1328 (широкий, слабый), 1310 (широкий, слабый), 1231 (средней интенсивности), 1174 (слабый), 1156 (слабый), 11g8 (средний), 1062 (средней интенсивности), 1028 (слабый), 1015 (сла" бый), 990 (слабый), 882 (слабый), 881 (слабый) см " .

УФ - спектрофотометрия: кислотные или нейтральные условия, макс., нм (E):278 (5500), 234 (плечо) (25000). Щелочные условия, макс., нм (Е):302 (6000), 264 (плечо) (10000).

Антибиотический А51568-фактор В— белое, аморфное твердое соединение..

Молекулярная масса около 1437.

Эмпирическая формула С Н зС1ф вО+

Протонный ЯМР— спектр фактора В схож со спектром ванкомицина и фактора А, но отличается отсутствием резонанса Ы-CH>N - ристил/лейцина, имеющего место в спектре ванкомицина и.аспарогиновых резонансов, найденных в спектрах ванкомицина и фактора А, в спектре фактора В имеются оезонансы глутамина.

Проявляет активность по отношению к аэробным и анаэробным бактериям,. таким как Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis„Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumonia1, Streptococcus species, 7 1194285 8

Haemophilgas inf luenzae, Escherichia f ragilis, Bactегоides fhetaiotaomiccoli, Klebsiella pneumoniae, ron, Bactегоides melaninogenicus, Clostridium difficile, Clostridium Bactегоids vulgatis, Bactегоides

perfringens, Clostridium septicum, cor rodens, Fusobac ter ium sumb io sum, Eubacterium aегоfaciens, Peptococcus 5 Fusobacterium necrophorum.

asaccharolyticus, Peptococcus prevo- Антибиотики или их фармацевтичесPeptostreptococcus anaегоbius, ки приемлемые соли применяют дпя леPeptostreptococcus intermedius, . чения инфекций у людейи животных, при

Propionifacterium acnes, Bactегоides . этом эффективнаядоэа равна 25-2000 мг.

Составитель Г.Смирнова

Редактор В.Иванова Техред Т.Дубинчак КоРРектоР А.Обручар

Заказ 7332/63 Тираж 524 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам иэобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r.yæãoðîä, ул.Проектная, 4