Способ получения деполимеризованного гепарина

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (51)4 С 08 В 37 10

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТУ

i(2!) 3244902/23-05 (86) РСТ/SE 80/00005 (07.01.80) (22) 06.02.8! (31) 7900164-0 (32) 08.01.79 (33) SE (46) 30.01.86. Бюл. 1! 4 (71) Каби АБ (SE) (72) Ульф Пер Фредрик Линдал, Гуд" рун Элизабет Бекстрйн, Джон !Ойгве

Леннарт Тунберг, Ларс-Оке Франссон, Ларс-Олов, Андерссон, Эрик !0нгве

Холмер, Инга Хелена Сандберг и Эва

Гунилла Седерстрем (ЯЕ) (53) 547.995.17 (088.8) (56) Ciffonelly J.À. Nitrons acid

Depolymerizatlon of Clycosaminoglycans. — Methods Carbonyds. Chem.

1976, 7, 139-141. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕПОЛИМЕРИЭОВАННОГО ГЕПАРИНА обработкой деполимеризующим агентом и выделением целевого продукта, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью сокращения длительности процесса, в качестве деполимеризующего агента используют азотистую кислоту или смесь перйодата и перхлората натрия, а обработку проводят 20 мл азотистой кислоты на 1 мас.ч. гепарина в смеси воды и диметоксиэтана при их соотношении 1:1 при 10 С 2 мин с последующим введением 2 мас.ч. ацетата натрия на 1 мас.ч. гепарина или водной смесью перйодата и . перхлората натрия при молярном соотношении 0,04:0,4 на 1 мас.ч.. гепа" рина и рН 3 в темноте.

Составитель T.Ìàðòèíñêaÿ

Техред A.Áaáÿíåö Корректор. Т.Колб

Редак то р Л. Вес ело в ск ая

Заказ 310/61 Тираж 471

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Б-35, Раушская наб, ц..4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент.", г . Ужгород, ул. Проектная, 4

Изобретение относится к химии полисахаридов, конкретно к получению деполимеризованного гепарина, обладающего высокой биологической актив:acòüþ.

Целью изобретения является сакращение длительности процесса.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1. 0,5 r гепарина, извлеченного из кишечника свиньи:, растворяют в 150 мл воды, охлажцао ют до 4 С и пропускают через колонку 3 х 7 см, наполненную Рочех

®

50 11-28 (Н форма), размером частиц 200-400 мен (0,074 — 0,037 мм) . Затем колонку промывают 100 мл воды и промывочную жидкость смешивают с исходным раствором. Туда же добавляют 250 мл диметоксиэтана,, охлажденного до -20 С, и 10 мл изоамилнитрила, и полученную смесь при !

О С выдерживают 2 мин. Реакцию прекращают введением в реакционную смесь 10 мл 107-ного раствора ацетата натрия. Затем вводят 5,2 л этанола, осажденный денолимеризованный гепарин выделяют центрифугированием.

Полученный продукт растворяют в

500 мл 0,05 M раствора NaC1 - 0,05 М раствор Трис-НС1, рН = 7,4. Раствор фракционируют, разделяя его на порции по 100 мл посредством хемосорбционной хроматографии с использованием колонки, содержащей 75 мл антибромина — СефарозыР (примерно

5 мг белка на 1 мл геля). Колонку элюируют с использованием соленого градиента (500 мл 0,05 М раствора

NaC1 — 0,05 М раствора Трис-НС1): (500 мл 3 М раствора NaC1 — 0,05 М раствора Трис-НС1), основная часть используемого продукта проходит через колонку или элюируется при низ ком значении ионной силы (менее

0,4 мол. МаС1), этот продукт не об209033

2 ладает биологической активностью.

Активные компоненты (очищенные производные гепарина) элюируются в широкой верхней части 0,5 М раст-!

;ора NaC1 и 3 М раствора 11аС1, что соответствуе";.- 4X от исходного материала, Зти фракции собирают и обес: оливают методом гель-хроматографии.

Производные гепарина, полученные

1Î и очищенные указанным образом, имеют размер молекулы, соответствующий размеру тетрадекаоктадекасахарида (мол.вес 3600-4800). Структурный анализ показывает наличие тех же структурных компонентов,что и в исходном материале, причем L-идуронозил-2-О-сульфат-(1 5, -4)-N-сульфо-D-глюкозамин-6 0-сульфат является доминирующим дисахаридным звеном мо2О лекулы, Количество несульфатированной идуроновой кислоты увеличивается с

6Х в исходном материале до 167.

Пример 2. 0,5 г гепарина растворяют в 250 мл водного раствора, содержащего G,02 моль NaIG<, 0,2 моля NaC104 и 0,05 буферообразующего раствора циртрата натрия, рН = 3. После выдержки в течение Зч о в темноте при 4 С окисление преЗО кращают введением малярного избытка D ìàííèòà с последующим диализом раствора и сушкой при темпера" о туре ниже 0 С, Расщепление полисахаридной цепи осуществляют обработкой продукта щелочью (5 мг/мл водного раствора при рН = 12) при комнатной температуре. Спустя

l0 мин раствор нейтрализуют 1 M раствором уксусной кислоты и подвергают обессоливанию посредством гель-хроматографии на декстране (Сефадекс С-25). Полученный проВ дукт может быть восстановлен боргидрицом натрия. д> Гель-хроматография показывает, что полученный гепарин имеет размер молекул, соответствующий 10-25 сахаридным звеньям,