Способ получения препарата гистидиндекарбоксилазы

 

COIO3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (.Ю4 С 12 N9 88 (21) 3723730/28-13 (22) 13 ° 02,84 (46) 15.02.86. Бюл. У 6 (71) Научно-исследовательский институт медицинской энзимологии

АМН СССР (72) Ф.Е. Романцев и В.Н. Прозоровский (53) 577.15(088.8) (56) Иммобилизованные ферменты.

Под. ред. Березина И.В. и др. т.1, М.: МГУ, 1976, с. 131.

Прозоровский В.Н. Препаративное получение кристаллической и гомогенной гнстидиндекарбок"илазы из

Micrococcus sp.n. и исследование ее структуры. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, M., 1971, с. 140.,Я0.„1211289 д (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА

ГИСТИДИНДЕКАРБОКСИЛАЗЫ, предусматривающий выращивание штамма продуцента Micrococcus sp.п на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и стимуляторы роста, при перемешивании, отделение биомассы и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью увеличения кратности использо" вания препарата и упрощения способа его получения, выращивание проводят в условиях аэрации, дополнительно культивируя биомассу в течение 3540 ч после достижения стационарной фазы роста, а выцеление продукта осуществляют обработкой 50-60Х суспензии клеток 10-14Х тимолом при 60о

64 С с последующей обработкой суспензии органическими растворителями и высушиванием препарата на воздухе.

1211

35

1

Изобретение относится к производству ферментных препаратов.

Целью изобретения является увеличение кратности использования препарата гистидиндекарбоксилазы

5 и упрощение способа его получения.

Сущность изобретения заключается в том, что применение предлагаемого способа получения препарата гистидиндекарбоксилазы позволяет получать .фермент, иммобилизованный на естественной матрице — клеточных структурах микроорганизма. При этом предложенные параметры и условия выделения являются оптимальными в силу следующих причин.

Если выращивание клеток продуцента проводить не в условиях аэрации, то происходит снижение активности препарата на 52-56 . Увеличение концентрации тимола свыше 14Х нецелесообразно, поскольку не вызывает положительного эффекта в достижении целей. Снижение концентрации тимола менее 10 не позволяет достичь иммобилизации гистидиндекарбоксилазы, поскольку приводит к неполному освобождению препарата от примесей, а именно: при б тимола препарат на

l8-21 загрязнен экстрагируемыми

30 веществами и не отвечает требованиям, предъявляемым к свойствам иммобилизованных ферментов.

Превьппение времени выращивания свыше 40 ч приводит к лизису клеток и уменьшает активность препарата, а именно: при 50 ч роста активность препарата снижена на l6-19 .. Сокращение времени выращивания менее

35 ч не позволяет достичь иммобилизации, поскольку приводит к умень40 шению прочности фиксации фермента на клеточных структурах и уменьшает активность препарата, а именно: при 30 ч роста количество неим- . мобилизованного (несвязанного, 45 экстрагируемого) фермента составляет 15-17Х.

Увеличение концентрации суспензии, клеток свыше 60 . приводит к уменьшению активности препарата: при 70 . суспензии активность снижена на 2327 . Снижение концентрации суспензии клеток менее"50 нецелесообразно, поскольку не вызывает положительного эффекта в достижении цели, приводит к увеличению объема реакционной смеси и увеличивает расход тимола.

289 2

Увеличение температуры более 64 С приводит к получению неактивного препарата, а именно: при 74 С активность снижена на 37-41 . Уменьшение температуры менее 60 С не позволяет достичь иммобилизации, сокращает срок хранения препарата и уменьшает его активность а имеййо: о

Ф при 50 С количество неиммобилизованного фермента составляет 12-14Х, активность уменьшается на 26 29 ., а срок хранения сокращается в 1,8 раза.

Л р и м е р i . Клетки продуцента

Nicrococcus sp.n. выращивают на питательной среде известного состава в условиях аэрации, биомассу собирают центрифугированием (10 000 g о

Э

15 С, 15 мин) через 35 ч после выхода роста культуры на стационарную фазу.

Стадия 1. 75 r влажных клеток суспендируют в 150 мл (т,е. доводят объем суспензии до 150 мл, получая

50Х-ную суспензию клеток) 0,1 М

К-фосфатного буфера рН 6,1, насыщенного тимолом при 30 С, оставляют при перемешивании 20 мин, после чего добавляют 15 r кристаллического тимола (т.е. получают 10Х-ную концентрацию тимола в суспензии клеток).

Суспензию нагревают при интенсивном перемешивании до 60 С (температура водяной бани не должна превышать о

85 С во избежание инактивации нагреI ваемого препарата) и выдерживают при этой температуре 2 мин. Далее быстро охлаждают до комнатной температуры.

Разрушенные клетки собирают центрифугированием (10 000 g, 20 С,15 мин) .

Стадия 2. Клетки смешивают с

350 мл воды и выдерживают при перемешивании 30 мин при комнатной температуре. Суспензию центрифугируют в укаэанных условиях, после чего осадок суспендируют в 150-160 мл ацетона и фильтруют, промывая на фильтре дважды ацетоном (по 150 мл) и эфиром (по 100 мл). Препарат высушивают на фильтре 30 мин. Полученный таким. образом ферментный препарат (24,7 r) хранят в чашках Петри о при 10 С 1 r. Активность при хранении уменьшается на 4-6 .. Выход 63,5Х (от активности в биомассе). Активность препарата 0,455 мккат на 1 г сухого веса препарата.

H p и м е р 2. Клетки продуцента

Micrococcus sp.n. выращивают на питательной среде известного соста1211289 зО

55 ва в условиях аэрации. Биомассу собирают центрифугированием (10 000 g о

15 С,. 15 мин) через 40 ч после выхода роста культуры на стационарную фазу.

Стадия 1. 90 r влажных клеток суспендируют в 150 мл (т.е. до водят объем суспензии до 150 мл, получая 6ОХ суспензии клеток) О, 1М

К-фосфатного буфера рН 6,1, насыщенного тимолом при 30 С, оставляют при перемешивании 20 мин, после чего добавляют 21 г кристаллического тимола (14Х-ный раствор тимола). Суспензию нагревают при интенсивном перемешивании до 64 С (температура водяной бани не должна превышать юсО

85 С во избежание инактивации нагреваемого препарата) и выдерживают при этой температуре 2 мин. Далее быстро охлаждают до комнатной тем пературы. Разрушенные клетки собира- ют центрифугированием (10 000 g, 10 С 15 мин) .

Стадия 2 ° Клетки смешивают с

350 мл воды и выдерживают при перемешивании 30 мин при комнатной температуре. Суспензию центрифугируют в указанных условиях, после чего осадок суспендируют в 150-160 мл ацетона и фильтруют, промывая на фильтре дважды ацетоном (по 150 мл) и эфиром (по 100 мл). Препарат высушивают на фильтре 30 мин. Полученный таким образом ферментный препарат гистидиндекарбоксилаэы (24,9 г) хранят в чашках Петри при 10 С 1 r.

Активность при хранении уменьшается на 4-67. Выход 64,5Х (от активности в биомассе). Активность препарата

0,445 мккат на 1 r сухого веса препарата.

Пример 3. Клетки продуцента

Micrococcus sp.ï. выращивают на питательной среде известного состава в условиях аэрации. Биомассу собира— ют центрифугированием (10 000 g

1,5 С, 15 мин) через 37 ч после выхода роста культуры на стационарную фазу.

Стадия 1. 82,5 г влажных клеток суспендируют в 150 мл (т.е. доводят объем суспензии до 150 мл, получая

557 суспензию клеток) 0,1 М К-фосфатного буфера рН 6,1, насыщенного о тимолом при 30 С, оставляют"-при перемешивании 20 мин, после чего добавляют 18 г кристаллического ти4 мола (получая 127.-ный раствор тимола). Суспензию нагревают при интенсивном перемешивании до 62 С (тем пература водяной бани не должна прео вьппать 85 С во избежание инактивации нагреваемого препарата) и выдерживают при этой температуре 2 мин. Далее быстро охлаждают до комнатной температуры. Разрушенные клетки соби10 рают центрифугированием при 10 000 g (20 С, 15 мин).

Стадия 2. Клетки смешивают с

350 мл воды и выдерживают при перемешивании 30 мин при комнатной температуре. Суспенэию центрифугируют в указанных условиях, после чего осадок суспендируют в 1-50-160 мл ацетона и фильтруют, промывая на фильтре дважды ацетоном (по 150 мл) и эфиром (по 100 мл). Препарат высушивают на фильтре 30 мин. Полученный таким образом ферментный препарат (24,8 г) хранят в чашках Петри о при 10 С 1 г. Активность при хране25 нии уменьшается на 4-6Х.,Выход 64% (от активности в биомассе). Активность препарата 0,450 мккат на 1 г сухого веса препарата.

Пример 4. Аналогичен примеру 1 за исключением того, что на стадии 1 проводят нагревание суспензии до 64 С.

II p и м е р 5. Аналогичен примеру 1 за исключением того, что на стадии 1 суспендируют 90 r влажных кле-. ток (60Х-ная суспензия).

Пример 6. Аналогичен примеру 5 за исключением того, что на стадии 1 проводят нагревание сус4> пензии до 64 С.

Пример 7. Аналогичен приме ру 1 за исключением того, что на стадии 1 добавляют 21 r кристаллического тимола (147-ный раствор

45 тимола

П р и м е.р 8. Аналогичен прик меру 7 за исключением того, что на стадии 1 проводят нагревание суспензии до 64 С.

Пример 9. Аналогичен примеру 5 за исключением того, что на стадии f добавляют 2f r кристаллического тимола (14X-ный раствор тимола) °

Пример 10. Аналогичен примеру 9 эа исключением того, что на стадии 1 проводят нагревание суспензии до 64 С.

1211289

Пример ы !1-17. Аналогичны соответственно примерам 4-10 за исключением того, что в случае примеров 11-17 биомассу собирают центрифугированием через 40 ч после выхода роста культуры на стационар- ную фазу.

Л р и м е р ы 18-34. Аналогичны примерам 1-17 соответственно за ис- 1б ключением того, что в случае примеров 18-34 на стадии 2 вместо ацетона используют этиловый или метиловый спирт в тех же условиях..

В результате применения предлагае- 15 мого способа согласно примерам 1-34 получается ферментный препарат гистидиндекарбоксилазы, обладающий актив- . ностью 0,450 .0,005 мккат на 1 г сухого веса препарата, а именно: 2О

1 r сухого препарата образует за

1 с 0,450 + 0,005 мкмоль СО и 0,450».

+0,005 икмоль гистамина в ходе декарбоксилирования 0,450 +- 0,005 мкмоль гистидина (в 0,01 — 0,1 М К-фосфатном25 буфере рН 5,6 при 37 С и при концентрации субстрата (L-гистидина) 24 мг/мл).

В результате осуществления способа по примерам l-34 происходит иммобилизация фермента гистидиндекарбоксилазы, что подтверждается следующим.

Во всех случаях полностью сохраняется высокая специфичность фермента гистидиндекарбоксилазы, поскольку З5 субстрат Ь-гистидин претерпевает единственный тип превращения после обработки препаратом, что следует из результатов качественного и количественного анализа продуктов реакЮ ции двумя методами: манометрическим способом определения активности гистидиндекарбоксилазы и высоковольтным электрофореэом на бумаге проб, отобранных в различное время протека45 ния ферментативной реакции и содержащих гистидин и гистамин. При этом количество образовавшегося гистамина соответствует количеству декарбоксилированного гистидина, что сви50 детельствует об отсутствии побочных (неспецифических)реакций. Препарат осуществляет декарбоксилирование только одного оптического изомера 1-гистидина, не изменяя количеств D-гистидина, уроканиновой кислоты, гистидинола, N-ацетил гистидина или 20 основных аминокислот (аланина, валина, лейцина, изолейцина, пролина, фенилаланина, триптофана,.метионина, глицина, серина, треонина, цистеина, тирозина, аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, лизина, аргинина и D-гистидина), находящихся одновременно в инкубационной смеси. Это свидетельствует о полном сохранении высокой специфичности фермента, что позволяет использовать его для разделения смесей оптических изомеров.

Препарат не загрязняет инкубационную среду внутриклеточными компонентами, поскольку способ получения препарата включает этапы освобождения (очистки препарата) от несвязанных внутриклеточных компонентов; анализ состава инкубационной смеси, содержащей только гистидин (2-4 мг/мл)

,и 0,01-..0,1 М К-фосфатный буфер рН 5,6 (при 37 С) показывает наличие в ней после добавления препарата только

:субстрата — гистидина, препарата . иммобилизованной на клеточных струк турах гистидиндекарбоксилазы и npo.i дукта — гистамина. При этом не происходит вымывания гистидиндекарбоксилазы из препарата, поскольку не уменьшается суммарная активность препарата после его отделения от инкубационной смеси и не отмечается проявления гистидиндекарбоксилазной активности в инкубационной среде после того, как препарат бып от нее отделен. Фермент не вымывается из препарата водой, Na, К-фосфатными буферами (при 0,01-0,5 И концентрации и в интервале рН 5,4-7,6), ацетоном, спиртом, эфиром или солевыми растворами и NaCl и (NH ц) ЗОВ, поскольку после обработки препарата указанными растворами фермент не переходит в растворимое состояние.

Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет получить препарат гистидиндекарбоксилазы, который может использоваться многократно, благодаря иммобилизациифермента надругих клеточныхкомпоиентах.

Упрощение способа достигается тем, что гистидинкарбоксилаза иммобилизуется в процессе ее выделения. на тех клеточных структурах, которые в соответствии с известными способами требуется отделять от фермента.