Штамм культивируемых гибридных клеток вскк (п) n2д- продуцент моноклональных антител к гормону роста человека

 

Штамм культивируемых гибридных клеток ВСКК(П) 2Д (хранится в коллекции Института цитологии АН СССР под номером 2Д) - продуцент моноклональньк антител к гормону роста человека.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Iaal

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3778093/28-14 (22) 31.07.84 (46) 30.09.86. Бюл. Ф 36 (71) Институт молекулярной биологии (72) И.А. Прудовский, В.М. Бородина, Е.А.Кирьянова, Е.М.Капник, П.М. Рубцов, К.Г. Скрябин, А.В. Зеленин и А.А.Баев (53) 615.375(088,8) (56) Molecular immunology, 1980, 17, 287-290.

„Л0„„1223 45 А (gg 4 А 61 В 1О/ОО,,С 12 N 5/00 (54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГИБРИДНЫХ

КЛЕТОК ВСКК (П) У 2Д вЂ” ПРОДУЦЕНТ МО"

НОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ГОРМОНУ РОСТА

ЧЕЛОВЕКА I (57) Штамм культивируемых гибридных клеток ВСКК(П) Ф 2Д (хранится в коллекции Института цитологии АН СССР ., под номером 2Д) — продуцент моноклональных антител к гормону роста человека.

1223445

Изобретение относится к иммунологии, в частности к получению клеточных гибридов, секретирующих антитела определенной специфичности.

Цель изобретения - получение штам- 5 ма гибридомы, секретирующего моноклональные антитела к гормону роста человека. В результате свойства слияния клеток перевиваемой мьппиной миеломы Х-63 АГ8653 и лимфоцитов селезенки мьппи BALB/c получают штамм гибридомы ВС КК/П/ В 2Д, синтезирующий антитела искомой специфичности.

Морфологические свойства. Клетки

Ймеют округлую форму., ядро занимает большую часть клетки. Форма ядра округлая, иногда лопасная. Цитоплазма ободком окружает ядро. Клетки слабо прикреплены к субстрату или располагаются свободно.

Физиологические свойства. При суспензионном культивировании на среде

RPNI или DNEM с эмбриональной телячьей сывороткой и гентамицином 25 клетки дают миеломный рост, Клетки перевиваются мышам линии BALB/ñ, продуцируют иммуноглобулины мыши, Модельное число хромосом-40 5 (околотетраллоидное), выявляются мышечные акроцентрики.

Получение гибридомы. а) Иммунизация.

Мышам линии BaLB/ñ с массой 1517 г (g) вводят гормон роста человека по 600 мкг на мьппь в 6 приемов

I (в первые 5 приемов с полным адьювантом Фрейнда, в последний — без него): в стопы задних ног по 50 мкг в каждую, через 3 дня — в стопы передних ног по 50 мкг в каждую, через 4 дня — в плечи подкожно по

50 мкг в каждое, через 7 дней — интер аперитонеально - 100 мкг, через

10 дней — интреперитонеально — 100мкг

4с за 3 дня до слияния внутривенно—

100 мкг.

Слияние клеток в суспензии осуществляют с помощью 50Х-ного раствора

ПЭГ с мол.мас. 4000 на среде RPMI.

1 мл ПЭГ наносят в течение 1 мин на влажный осадок клеток (10- клеток

6 т селезенки и 10 клеток миеломы) „ осторожно покачивая пробирку (при

37 С), и инкубируют затем 1,5 мин.

Добавляют 1 мл теплового раствора

Хенкса и инкубируют 30 с, затем добавляют еще 3 мл теплового раствора

Хенкса и инкубируют 1 мин, доливают раствор Хикса до 50 мл и инкубируют

5 мин. б) Селекция гибридов.

После окончания процедуры слияния клетки высаживают в ячейки 24-ячеечных пластиковых культуральных плат, на которые за сутки до этого высаживают мьппиные перитонеальные клетки

1 (100 тыс. перитонеальных.клеток, 100 тыс. клеток миеломы, 1 млн, клеток селезенки на ячейку) . Селекцию проводят на среде ГАТ, приготовленной на.основе среды RPMI с добавлением 107. эмбриональной телячьей сыворотки, 25 мМ буфера Hepes (Good N.Е.

eta1 1966, Biochem 5,467-477) и

40 мхг/мл антибиотика гентамицина.

Клетки культивируют в термостате с поддувом углекислоты (5-7,5Х углекислоты) . Клоны гибридных клеток появляются через неделю.

Продукцию антител к гормону роста в первичных культурах гибридных клеток определяют, проверяя наличие ангител в культуральной среде по методу ELISA на гибких полихлорвиниловых платах с использованием меченых пероксидазой кроличьих антител к мьппиным иммуноглобулинам.

Дальнейшее клонирование осуществляют методом предельного разведения

/1 клетка на ячейку/ в 96-ячеечных пластиковых культуральных платах с питающим слоем перитонеальнык клеток.

Культуру прививают и выращивают в виде асцита в перитонеальной полости мышей BALB/ñ. 3а 7 дней до введения клеток мъппам — реципиентам вводят по 0,5 мл пристана. Асцит образуется через 2-3 недели после введения 1-5 млн клеток.

Очистка антител иэ асцитической жидкости.

Перед очисткой антител асцитическую жидкость размораживают в водяной бане и центрифугируют при 4000 об/мин на центрифуге 25-658 (ротор SW 65).

Осадок отбрасывают, а супернатант используют в дальнейшей работе. Определяют оптическую плотность супернатан( та при 280 нм. С этой целью к 3,4 мл супернатанта (24,2 мг белка на 1 мл) добавляют 6,4 мл буфера А. Далее проводят фракционирование сульфатом аммония. К 8,15 мл раствора белка добавляют 7,34 мл насыщенного при комнатной температуре раствора сульфата аммония. Смесь перемешивают на

23445

Составитель Л. Падюков

Редактор А. Ушакова ТехредМ.Моргентал Корректор М. Шароши

Заказ 5268/2 Тираж 660 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035» Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие,г.ужгород,ул.Проектная, 4

12 холоде в течение 40 мин и оставляют при 4 С на ночь. Осадок отделяют центрифугированием при 15000 об/мин на центрифуге К-24, растворяют в

0,3 мл буфера Б (0,02 М трис-НС1, 0,04 М NaC1, рН 7,9) и диалиэуют против 150 об.буфера Б.

Отдиализованный раствор наносят на колонку (3,5 см/0,85 см ) с ДЭАЭ- целлюлозой, уравновешенной буфером

Б. Колонку промывают буфером Б до полного выхода белка, не связанного ионнообменником.

Антитела к гормону роста человека выходят при этом одним пиком, что

;показано путем связывания антител с иммобилизированным гормоном и ана4 лизом препарата в электрофорезе в денатурирующем геле полиакриламида.

Выход очищенного препарата анти.тел составил по белку 3,4-9,2Х, а

6 титр антител 2,5 10 — 10, в то время как по прототипу титр антиз тел равен 10

Продуцируемые штаммом гибридомы моноклональные антитела могут быть

10 использованы при выявлении гормона роста человека в медицинских и генно-инженерных исследованиях, очистке гормона роста человека, полученного генно-инженерным способом иммунофер t5 ментным методом, показано связывание антител с гормоном, полученным этим способом.