Способ получения цитохрома с

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„42523

А1 (50 4 С 12 Р 1/06//(С 12 P 1/06, С 12 R 1:05) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ

Н А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3575412/28.— 14 (22) 24. 0 1,. 83. (46) 070786. Бюл. У 25 (7l) Институт биофизики СО АН СССР (72) А.В.Кондрасенко, О.А.Гуссейнов, И.Н.Трубачев и В.К.Филиппова (53) 577.158.8 (088.8) (56) Fang F,S., Burris R.Н. I.Bacteriology, 1968, 96, Ф 2, р. 298-305. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ .ЦИТОХРОМА С путем обработки биомассы Afcafigenes

entrephus с последуюпщм ступенчатым фракционированием полученного экстракта сульфатом аммония до 75 и

l0OX-ного насыщения и очисткой целевогс продукта ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе и КМ-целлюлозе, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, биомассу Afcafigenes

entrephus штамм Š— 1 подвергают

O автолизу при 20-40 С в течение 6-24 ч

У а перед хроматографией проводят гель-фильтрацию на сефадексе С 50.

Составитель Г. Смирнова

Техред О,Сопко

Корректор E.Ñèðîõìàí

Редактор В.Петраш

Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий

1.13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Заказ 3668/26.1роизводственно-полиграфическое предприятие, r.Óæãoðoä, ул. Проектная,4

1 124252

Изобретение относится к микробиологической промьппленности и касается получения цитохрома С из микроор" ганизмов.

Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта.

Пример i. Биомассу Afcaligenes entrophus, полученную на полупромьппленной установке, сепарируют до концентрации сухого вещества 10 и

80 г/л и выдерживают при 20-40 С в течение 6-24 ч при постоянном перемешивании. Полученную суспензию центрифугируют. К экстракту при энергичном перемешивании постелен- 15 но добавляют сульфат аммония до

75%-ного насьпцения. Осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают.

К жидкой фазе, которая содержит цитохром С, добавляют сульфат аммония до полного насыщения. Осадок, полученный в результате центрифугирования, суспендируют в 6 мл

0,005 М фосфатного буфера рН 7,5, содержащего 0,1 М NaCf, и наносят д на колонку с сефадексом С 50 . (3 Х100 см), предварительно уравновешенную тем же буфером. При гельфильтрации элюат выходит пятью пиками. Цитохром С находится во. фракциях второго пика,.которые собирают, диализируют против 0,005 M фосфатного буфера рН 7,5 и наносят на колонку с ДЭАЗ-целлюлозой (2,5 х х 30 см), уравновешенную тем же буфером. Цитохром С не сорбируется на

ДЭАЗ-целлюлозе и выходит с фронтом, растворителя. Фракции, содержащие цитохром С, собирают и наносят на колонку с КМ-.целлюлозой (2,5х30 см), 3 2 уравновешенную тем же. буфером. Цитохром С адсорбируется на целлюлозе.

Колонку промывают 500 мл 0,005 M фосфатного буфера рН 7,5. Сорбировавшиеся белки элюируют градиентом

NaC2 от О до 0,02 М в том же буфере.

Цитохром С элюируется при содержании NaCI 0,07-0,1 М °

Фракции, содержащие цитохром С, диализуют против буфера, не содержащего НаСЬ, и концентрируют рехро-. матографией на колонке (2х20см ) с

KM-целлюлозой. Элюируют цитохром С ь минимальным объемом 0,005 М фосфатного буфера рН 7,5, содержащего 0„1 М

NaCf.. Элюат диализуют и лиофильно сушат. Выход 300 мг из 1 кг биомассы (на сухой вес).

Пример 2. Биомассу Аьсаfigenes entrophus Zl, лиофильно высу- . шенную, диспергируют в воде до концентрации 50 г/л, добавляют толуол (0 02-1%) и выдерживают 24 ч при постоянном перемешивании. Осадок отделяют центрифугированием и супернатант фракционируют сульфатом аммония, как в примере 1.

Пример 3. Биомассу А1саfigenes entrophus Z-1, лиофильно вы . сушенную, диспергируют в воде до концентрации 100 г/л и далее осуществляют способ по примеру 1.

Выход целевого продукта 250-350 мг из 1 кг биомассы (на сухой вес).

Чистота получаемого продукта 92-98%.

По сравнению с известным способом увеличивается выход цитохрома С с 3% от суммарного содержания в исходном материале до 27%.