Способ получения сорбента для выделения целлюлаз и ксилиназ

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СО).)ИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) А1 д1) 4 С 12 N 9/42

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

С:

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3807621/28-! 3 (22) 30 ° 10.84 (46) 23.08.86. Бюл. В 31 (71) Научно-производственное обьединение "Биохимреактив" и Ордена Ленина институт биохимии им. А. Н. Баха (72) Г. Х. Голдштейнс, M. Л. Раби" нович, А. А. Клесов, В, А. Мартьянов и А. К. Аренс (53) 577.15(088.8) (56) Nummi М. Niku — Paavola И. — Z., Enari T. М., Raunio Ч. Isolation

of ccllulases fy means of biospecifie sorption on amorphous ceHulose.

Anal. Biochem., 1981, v, 116, В 1, рр. 137-141 °

Авторское свидетельство СССР

Р 975796, кл. С 12 N 9/42, 1984. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕННЯ СОРБЕНТА

ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЛ10ЛАЗ И КСИЛАНАЗ, заключающийся в механической и физико-химической обработках натуральных целлюлоэосодераащих материалов, отличающийся тем, что, с целью повышения сорбционной емкости целевого продукта и улучшения его гидродинамических характеристик, сорбент дополнительно обрабатывают деградирующими целлюлозу ферментнымн препаратами — целловиридином ГЗХ или целлокандином, которые затем удаляют термообработкой при 30— о

100 С и отмыванием.

1252337

Изобретение относится к способам приготовления аффинных сорбентов для выделения и очистки ферментов и может быть использовано для получения высокоочищенных препаратов целлюлазы и ксиланазы, применяемых в пищевой, целлюлозно-бумажной и микробиологической промышленности, медицине и в научных исследованиях.

Цель изобретения — повышение сорбционной емкости целевого продукта и улучшение его гидродинамических характеристик.

Сущность изобретения заключается в том, что сорбенты, приготовленные из натуральных целлюлозосодержащих материалов, подвергают обработке деградирующими целлюлозу ферментами. Такая обработка приводит к увеличению сорбционной емкости сорбента в 5 и более раз (с 30 - 50 до 150 — 200 ед. фермента на 1 г носителя).

Существенным преимуществом предлагаемого способа является то, что целлюлозы, используемые для предварительной обработки сорбента, могут быть затем выделены иэ раствора в высокоочищенном виде на сорбенте, полученном с их помощью. Это позволяет свести к минимуму потери ферментного препарата на обработку носителя.

Предлагаем@ способ обработки позволяет сократить время измельчения носителя и испольэовать носитель с более крупным размером частиц без ухудшения его сорбционной емкости.

Так, в случае измельченного хлопкового линта, размер,его частиц может быть увеличен с 20 до 50 — 100 мкм и, несмотря на это, ферментативная обработка гарантирует такому носителю высокую сорбционную емкость.

Кроме того, преимуществом предлагаемого метода обработки носителя является то, что десорбированный с него водный раствор очищенных ферментов (целлюлоз) не содержит осадка, который образуется при использовании для очистки необработанного сорбента.

Это позволяет исключить дополнительную стадию центри41гирования очищенного раствора фермента для удаления неактивного осадка и непосредственно после десорбции проводить его сушку или осакдение.

1О

1S

2

Дополнительная термообработка сорQ бента при 30-100 С после его отмывания от ферментов, использованных для обработки, может проводиться в о двух режимах. Обработка при 30 - 50 С водой в течение 1-6 ч вызывает отмывание наиболее прочно адсорбированных ферментов в активной форме (примерно 2 — 57 общего количества, взятого для обработки). Это позволяет уменьшить потери сорбента за счет

его разрушения при хранении и с другой стороны, максимально сэкономить ферменты на стадии обработки сорбента. С другой стороны последующее промывание носителя при 50-!00 С воо дой с многократной декантацией полностью удаляет с носителя остатки адсорбированных белков и исключает возможность его разрушения и инифицирования в ходе длительного хранения. Кипячение сорбента после ферментативной обработки с декантацией окрашенного надосадочного раствора приводит к получению носителя, обладающего отличными гидродинамическими характеристиками и позволяет обеспечить четкий фронт при смене элюентов, а также высокую скорость элюирования водой активных целлюлазных фракций. В результате значительно улучшается концентрирование ксиланаз и целлюлаз в элюируемых фракциях, а также разделение этих ферментов при выделении их из препаратов одного продуцента. Описанную процедуру термообработки носителя производят не только на стадии его приготовления, но и после каждой процедуры очистки. Это позволяет сохранить высокие гидродннамические характеристики, тогда как сорбент, приготовленный по известному методу и не подвергающийся термообработке, существенно ухудшает фильтрующие свойства после второго — третьего использования.

Пример 1. 15 г измельченного хлопкового линта (средний размер частиц 75 мкм) обрабатывают при перемешивании 250 мл 1ОХ-ным раствором целловиридина ГЗХ (удельная активность 30 ед/г), затем фильтруют и тщательно промывают 0,1 М фосфатным буфером рН 7,0 — 7,5 (определен универсальным индикатором).

Обработанный лиит заливают водой, инкубируют в течение 1 ч при 35+5 С

)252337

55 и декантируют. Затем повторно заливают водой и кипятят н течение 1015 мин. Декантируют и дополнительно отмывают водой до исчезновения желтой окраски в надосадочной жидкости.

Полученный сорбент вносят в колонку размером 300х50 мм с водяной рубашкой для термостатирования и используют для выделения целлюлаэ из целловиридина ГЗХ. Для этого на колонку, уравновешенную 0,1 М ацетатным буфером рН 4,5 при 5 С наносят 750 мл )OX-ного раствора препарата со скоростью потока 500 мл/ч, затем промывают 300 мл О,) M фосфатного буфера рН 7,0 для десорбции нецеллолитических ферментов, Адсорбированные целлюлазы смывают 250 мл воды, Фракция целлюлаэ объемом 200 мл имеет активность 10 ед/мл. Сорбционная емкость обработанного линта составляет )50 e H ) r носителя ° Выход фермента 907. Линейная скорость элюции 25 см/ч.

Пример 2. 20 г хлопкового пинта, обработанного как в примере 1, вносят в колонку (300х50 мм) для отделения ксиланаэ из культуральной жидкости целлюлазного продуцента.

Колонку охлаждают до 4-10 С и о наносят 200 мл культуральной жидкости с удельной ксиланазной активностью 0,8 ед/мл и целлюлазной активностью 2,0 ед/мл. Далее проводят элюцию ксиланаз О,! М фосфатным буфером рН 7,0. Полученная фракция обладает ксиланаэной активностью

0,2 ед/мп. Степень очистки ксиланаэ от целлюлаз по отношению к культуральной жидкости составляет 30 раз.

Пример 3. 18 г измельченного хлопкового линта (размер частиц 20-50 мкм) обрабатывают 200 мл

5Х-ным раствором целлокандина (целлюлолитическая активность 100 ед/г).

Приготовленный линт декантируют и промывают 300 мл 0,1 М фосфатным буфером рН 7,0. Осадок пинта заливают

500 мл воды и кипятят 15 мин, после чего охлаждают и отмывают двумя порциями по 300 мп воды.

Полученный сорбент суспендируют в O,l М ацетатном буфере рН 4,5 и заполняют колонку (200x25 мм), охлажденную водяной рубашкой до 4-6 С.

700 мл раствора целокандина Г10Х с удельной активностью 6 ед/мл наносят на колонку со скоростью свободного тока ° Затем промывают 800 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,0 и пропуска" ют 500 мл воды для промывания адсорбированных целлюлаз.

Емкость сорбента составляет ие менее 200 ед/г и при десорбции фермент выходит острым пиком. Выход фермента 857.

Для предотвращения разрушения сорбента прочно адсорбированными остатками целлюлаэ и регенерации его кипятят и потом отмывают водой декантацией, пока поглощение при 280 нм в кварцевом кювете толщиной 1 см не станет меньше 0,05 оптических ед.

Пятикратное использование сорбента с последующей регенерацией показывает, что его гидродинамические и сорбционные свойства не ухудшаются.

Пример 4. 50 r микрокристаллической целлюлозы для колоночной хроматографии обрабатывают 200 мл

)ОХ-ного раствора целловиридина ГЗХ в течение 30 мин. Суспензию декантируют, отмывают 500 мл О,l М фосфатного буфера рН 7,0 и после повторной декантацией осадок заливают 500 мл воды и инкубируют при 50 С в течение 2 ч. Насадочные жидкости объединяют и в дальнейшем используют для выделения целлюлаз. Осадок микрокристалической целлюлазы заливают

300 мл воды и кипятят в течение 20мин.

Приготовленный сорбент охлаждают и заполняют колонку 300х50 мм. При выделении целлюлазы элюрование проводят свободным током при гидростатическом давлении 1 м. Линейная скорость протока в данном случае составляет 60 см/ч по сравнению с указанной фильтрующей способностью в спецификации микрокристаллической целлюлозы 42 см/ч.

Технико-экономический эффект предлагаемого изобретения заключается в следующем.

Способ позволяет увеличить сорбционную емкость сорбентов на основании измельченного целлюлозного материала, что снижает затраты носителя на единицу фермента в 2 — 5 pas и влечет за собой увеличение степени очистки в 3 — 6 раз. Термообработка сорбента снижает его гидродинамическое сопротивление. Это позволяет сократить затраты времени на очистку за

1252337

Составитель В. Муронец

Редактор И. Дербак Техред Л.Сердюкова Корректор Е. Сирохман

Заказ 4588/27 Тирам 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

ll3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 счет увеличения скорости разделения и экономит энергию. упомянутые преимущества этого способа дают возможность приготовления аффинного сорбента,пригодного для крупномасштабного получения ферментов микробного происхо кдения, сорбирующнх на целлюлозе (целлолаз, кснланаз).