Питательная среда для выделения и отбора бактерий- продуцентов протеазы
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И рТБОРА БАКТЕРЮ - ПРОДУЦЕНТОВ ПРОТЕАЗЫ, включающая источник казеина , агар-агар и воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения точности выделения и отбора продуцентов, в качестве источника (сазеина она содержит окрашенный казеин ОКА-АС и дополнительно глюкозу. крахмал картофельный растворимый,натрий азотно-кислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий хлористый , магний серно-кислый и железо серно-кислое при следуннцем содержании компонентов,г/дм : Окрашенный казеин ОКА-АС 3,5-4,5 Глюкоза0,5-1,5 Крахмал картофельный раст8 ,0-15,0 воримый Натрий 1,5-2,5 азотно-кислый Калий фосфор- . j 0,5-1,5 но-кислый (Л однозамещенный 0,3-0,6 Калий хлористый Магний серно0 ,3-0,6 кислый Железо серно0 ,005-0,02 кислое 15,0-25,0 Агар-агар fc Остальное Вода Э5 :о
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИК (19) (II) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н ABTGPCHGMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ
8,0-15,0
0 5-1,5
0,3-0,6
ГОсудАРстВенный Комитет сссР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3760747/28-13 (22) 09.07.84 (46) 15 10.86.Бюл. И 38 (7i) Научно-производственное объединение "Фермент" (72) М-Ж.M.Ямонтене, В.Ю.Грибаускене, О.Ю.Бунявичене и Э.С.Стапчинскене (53) 663.14 (088.8) (56)"-Производство и применение микробных ферментных препаратов,вып.5, Вильнюс, 1981, с.8.
Лабинская А.С.Практикум по микробиологическим методам исследования.
М., 1963, с.433-434. (54) (57) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И,ОТБОРА БАКТЕРИЙ вЂ” ПРОДУЦЕНТОВ ПРОТЕАЗЫ, включающая источник казеина, агар-агар и воду, о т л и— чающая с я тем, что, с целью повышения точности выделения и отбора продуцентов, в качестве источника казенка она содержит окрашенный казеин ОКА-АС и дополнительно глюкозу, (51) 4 С 12 К 1/20, С 12 Q 1/04// (С 12 N 1/20, С 12 R 1:125) . крахмал картофельный растворимый,натрий азотно-кислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий хлористый, магний серно-кислый и железо серно-кислое при следующем содержании компонентов,г/дм :
Окрашенный казеин ОКА-АС 3 5-4,5
Глюкоза 0,5-!, Ь
Крахмал кар.— тофельный раст" воримый
Натрий азотно-кислый 1,5-2,5
Калий фосфор- . но-кислый однозамещенный
Калий хлористый 0,3-0 ° 6
Магний сернокислый
Железо сернокислое 0,005-0,02
Агар-агар 15,0-25,0
Вода Остальное
)26371) В табл.1 представлены средние количественные данные в пределах и за пределами компонентов предлагаемой питательной среды.
Для осуществления изобретения готовят питательные среды следующего з состава, г/дм воды:
Среда 1.
Агар-агар 15,0
Окрашенный казеин
Глюкоза
Крахмал картофельный растворимый б,О .
Натрий азотнокислый !ьо
Калий фосфорно-кислый однозамещенный 0,) 3,0
0,3
Изобретение относится к микробио логии и касается состава питательной среды для выделения, отбора и селекции или индуцированного мутагенеэа микроорганизмов — продуцентов протеаэ °
Цель изобретения — повышение точности выделения и отбора продуцентов протеазы.
Изобретение осуществляется следую. щим образом.
Приготовление питательной среды.
20 r порошка сухого питательного агар-агара, выпускаемого Дагестанским научно-исследовательским институтом питательных сред, размешивают в 300 см воды и кипятят 5 мин при з непрерывном перемешивании до полного растворения.
4 r сухого окрашенного казеина
ОКА-АС растворяют в 100 см дистил9 лированной воды при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке.
3 о
В 200 см подогретой до 70 С воды растворяют остальные компоненты питательной среды. После этого все компоненты перемешивают, корегируют рН до б 8, доводят общий объем до
1000 см и автоклавируют при 123 С в течение 30 мин. Далее среду охлажо э дают до 50 С и разливают по 20 см в стерильные чашки Петри. Для проверки на стерильность чашки со средой ,ставят в термостат при 37 С на 24ч.
За пределами указанных значений о ,компонентов питательная среда не оказывает ожидаемого эффекта.
Калий хлористый
Магний серно кислыи
Железо .сернокислое
Среда 2
Агар-агар
Окрашенный каэеин
Глюкоза
Крахмал картофельный растворимый
Натрий азотнокислый
Калий фосфорнокислый однозамещенный
Калий хлористый
Иагний серно-кислый
Железо сернокислое
0,2
0,2
О, 002
25,0
5,0
2,0
20,0
3,0
2,0
0,8
0,8
Данные, представленные в табл.), показывают, что за пределами соотношения компонентов полученные данные близки к данным оптимальной среды, поэтому нецелесообразно применение питательной среды с повышенной концентрацией компонентов.
При применении значений компонентов ниже предлагаемых полученные дан35 ные тоже немного отличаются от предлагаемой среди, однако выявляется тенденция к уменьшению эоны .гидролиза казеина, что ведет к неточности при отборе бактерий — продуцентов протеазы.
Установлена прямая зависимость между соотношением величины зоны гидролиза казеина и диаметра колонии и протеолитической активностью, что от сутствует при использовании твердой питательной среды с неокрашенным казеином.
В табл.2 представлены результаты выращивания продуцентов пцотеазы на
59 твердой среде с неокрашенным казенном и на жидкой среде.
По-видимому каэеин ОКА-АС необходим для биосинтеза протеазы, так как он стабилизирует рост клетки продуцентов.
Пример. Для осуществления изобретения питательную среду гото3 вят следующего состава, г/дм воды:
126371) 15,0
Агар-агар
Окрашенный каз еии
Глюкоза
Крахмал картофельный растворимый
Натрий азотнокислый
Калий фосфорно-кислый одиозамещенный
Калий хлористый
Магний сернокис;лый
Железо сернокислс е
3 5
0,5
8,0
0,5
0,3
0,3
0,005
Крахмал картофельный нерастворимый
Кукурузный экстракт
Пивные дрожжи
Аммоний фосфорно-кислый двузамещенный
Кальций хлористый
Натрий хлористый
239,00
11,43
2,19
8,40
0,45
0,29
Выделение и отбор продуцентов протеазы.
Стерильные чашки Петри со средой засевают суспензией вегетативных клеток штамма Васй1из subtilis 65, подвергнутых воздействию нитрозогуанидина, и помещают в термостат при
37 С на 36 ч. Варианты, продуцирующие протеазу, оценивают по величине зои гидролиза казеина вокруг колоний.
Зоны гидролиза казеина выражены четко, прозрачны на желтовато-оранжевом фоне.
Измеряют диаметры колоний и зон гидролиза казеина и вычисляют их соотношение.
Выросшие варианты с различной величиной зон гидролиза казеина стерильно микробиологической петлей переносят в пробирки с ломтиком картофеля, а потом засевают биологические пробирки диаметром 18-20 мм с жидкой
Питательной средой следующего соста- 40
sa г/дм воды: э
Калий сернокислый 2,87
Магний сернокислый 0,14
Медь сернокислая 0,0036
Перед добавлением крахмала картофельного нерастворимого в среду производят его осахаривание. 239 r крахмала заливают 500 см водопроводной воды, добавляют 150 мг амилосубтилио„ на, нагревают до 70 С и выдерживают при постоянном перемешивании 20 мин.
Раствор аммония фосфорно-кислого о стерилизуют отдельно при 120 С в течение 30 мин.
В 200 см подогретой до 65 С воды з о растворяют остальные компоненты питательной среды. После этого все компоненты. перемешивают, корегируют рН до 7,0, доводят общий объем до
1000 см и автоклавируют при 123 С в течение 30 мин.
Выращивание проводят глубинным способом на качалке в течение 48—
72 ч при 37 С.
Протеолитическую активность в культуральной жидкости определяют по
ГОСТУ 20264.2-74.
Проверена протеолитическая активность 50 вариантов с различным соотношением реэмеров зоны гидролиза казеина и колонии (табл.3).
Установлена прямая зависимость между соотношением размеров зон гидролиэа казеина и колоний и протеолитической активностью.
В табл.3 даны результаты выращивания продуцентов протеаэы на твердой и жидкой средах.
Полученные данные свидете1п ствуют о точности выделения и отбора бактерий — продуцентов протеазы на предлагаемой питательной среде, а также .о наличии прямой зависимости между соотношением величины эоны гидролиза казеина и диаметра колонии и протеолитической активностью.
Таким образом, предлагаемая питательная среда по сравнению с известной позволяет осуществить более глубокий гидролиз каэеина, зоны гидролиза выражаются четко и являются стабильными.
126371!
Ь
Таблица l
Соотношение зоны
Вариант среды
4,5
11,5
Оптимальные значения
3,9
10 5
3,0
11,0
Запредельные значения
4,4
11,4
Т а б л и ц а 2
Протеолитическая активность, ед/см
Соотношение
Колонии
3 пассаж
4 пассаж
2 пассаж
1 пассаж
l0,4
3 ° 2 15 5
3 5 17,3
10,3
10,0
10,0
8,5
8,2
8,3
2,4 19 3
8,0
8,2 7,9
8,1
10,0
3,9 7,1
10,4
10,3
1,8
11,0
9,4
5 4,2 23,4
9,0
9,7
9,0
6,4
6 5
6,0 6,3
10,4 1090
13,9 12,9
6,6
27,1
6 4,1
10,7
10,1
7 32 200
8 5 0 14,0
12,3
12,5
l4,9
15,6
15,1
l5 0
5в1 10в2
3,4 14,2
2вО 12
15,8
16,7
l5,5
16,0
12,5
12,7
12,9
6,2
Размер колонийвмм
Размер зон гидролиза казеина,мм зон Гид ролиза с размером колоний,мм
Протеолитнческаяактивность, ед/см гидролиза с размером колонии
1263711
СоотноРазмер колоний,мм
Колонии пассам
ll,3
10,7 11,0
9,3 10,2
4,1
19 7
12 4,8
13 3,1
9,1
10,2
4,9
15,2
10,2
10,0
10,1
10,2
7,7
2,4
18,4
14. 9,9
10,0
9,7 9,9
5,7
20,0
15 3,5
16 3,2 18,0
13,3
13,1
12,9
13,2
5,6
8,2
8,1
8,2
8 ° 3
19,6
7,3
7,3
7 7
7,4
8,2!
7,3
6,6
6,4 6 5
9,0
18,1
9,1
9;0
9,4
7,8
9,0.
24,3
21 2,5
22 4,1
8,3
S 4
8,5
8,9
19,1
10,7
lO ° 3
10,9
10,3
6,1
25,1
9,6 10,0
9,8
10,1
5,6
17,3
12,0
12,1
12,7
12,3
7,9
15,9
11,4
10,8
20,5
11,3
10,0 7,1
7,3 7,5
7,0
30 ° 0
26 2,7
9,1
9,3
9,2
9,0
5,4
25,3
27 4,7
28 5,2 . 21,8
10,1
10,2
10,7
10,3
4,0
11В2
11,3
10,9
4 1
17,3
29 4,3
30 3,2
10,2
10,0
10,4
10,7
7,2
23,1
ll 2
10 9
4,2 20,1
ll 7
11,3
4,8
12,2
I2 3
Ф
12,0
l2 1
12,3
27,4
32 4,9
12,1
12,5
12,3
9,1
19,2
2,1
11,3
11,7
ll 3
10,9
8,1
15,3
1,9
1,8
12,1
12,0
12,2 12,0
5,8
10,4
17 2,5
1 8 2., 1
1 9 2, 0
20 3, 1
23 3,1
24 2,0
25 1,9
Размер эон гидролиза каэеина,мм шение зон гид ролиза с разме ром колоний,мм
Продолжение табл.2
Протеолитическая активность, ед/см! 2 3 пассам пассаа пассах
1263711
Продолжение табл.2 теолитическак активность, ед/си
Ь зиер олоний«ии
2 . 3 ссаФ пасс
3,2
Зб
9,8
9,3
9,2
9,1
Ъ
13,7
8,9
8,2
6,7
4,2
19,2
6,2
14,3
3,9
11,3
10,9
16,1
3,8
13,1
13,2
2,4 15,4
12,9
13 1
12,7
12,9
42 2,7
14,2
14,1
25,7
14,0
9,5
?.3
7,2
7,6
1 5
l1 6
11,2
11 9
5 0 10,7
10,0
10,2
10,9
32,1
46 2,5
7,9
7,6
7,5
7,8
8,2
20,4
3,7
10,4
10,3
5,1
19,0
8,7
8,9
16,3
3,1
10,3
5,1
10„9
I0 9
10,9
20,4
4,0
11,3
1213
12,1
1192
7,8
l7,9
2,3
Таблица 3
Протеолитическая активность,ед/си
Размер колоний,мм
Колонии
4 пас3 пас2 пас1 пас1 4,0
6,,5
2РО
10 : 3,3
3,0
Размер зЪн гид« ролиза казейна,ии
44 5,4 33,4
Размер зон гидролиэа казеина, мм
Соотиоаение зон Гид» ролиза с рази ром ко лоний, оотноение зон идролиза размером олоний,мм
12,94
15,05
10,40
13,10 12,89
15,00 15,00
10,58 10,15
13,20
14,93
10,ч7
1263711
КолоРазмер зон гид ролиза казенка, мм
Размер колоний,мм
Соотношение зон гидролиза с размером колоний,мм нни
4 пас3 пассаж
2 пас1 пас10,35
10,15
10,20
10,05
10,00
10,00
9,64
3,0
10,54
10,00
9,94
2,7
10, 34
9,98
3,0
8,46
8,48
8,50
8,30
2 0
9,10 8,54
9,00
8,58
2,0
10,30
9,90
10,00
9,95
3,0
8,60
8 ° 30 8720
8,75
2,2
8,10
8,00
8,30
7,05
8,40
2,1
1,6
7,05
7,00
7,20
8,00
8,15
8,35
2,0
13 2,0
2,0
8,00
8 ° 30
8,64
8,44
14 50
15 4,0
10,20 10,80
l4 90 14 10
9,90 10,10
13 97. 14,90
l0 20
10,21
3,0
14,10 14,50
9,60 10,50
5 0
2,9
12,94
10,15
10,32
13,54
13,10
10,10
11,20
13,00
4,5
10,35
11,60
10,00
3,0
11900
3,7
14,90 13,50
13,20 13,60
13,10
14,00
4,8
2,0
7,90
8,00
8,35
8,30
8,40
7 ° 50
8,00
7,98
1 9
12,15
12,90
12,30
13, 50
12,70
13,00
12,00
S 1
4,Ь .
12 ° 50 13,90
12,96 13,30
5,0
14,54
15,70
14,90
15,40
6,0
4 3,0
5 3,0
6 3 0
7 2,0
8 3,0
9 4,0
10 4,5
11 4,8
12 3,2
l6 2,0 10
17 3,5 9,0
18 20 90
19 3,0 .9,0
20 4,0 15,0
21 20 90
22 21 106
23 4,2 8,4
24 3,2 6,0
25 2,1 . 10,2
26 3 2 12 8
27 2,3 11,6
28 2,4 14, 4,Продолжение табл.3 з
Протеолитическая активность,ед(см
1263711
Продолжение табл.3
Протеолитическая активность,ед/см
Соотношение зон гидролнза с размером колоний,мм
Размер зон гид» ролиза казеина, ми
Коло- Размер сии. коло" иий,мм
3 пасса% саи
}2,00
l2,00
12,30
8,00
10,0
8,54
8,94
8 9 54
9,4
5 30
1,8
5,00
5,90
6,00
16,55
13,15
7,2
16,00
12,90
16,05
13, 70
4,4
9,00
9,20
10,2
9,20
35 2„5 10,9
13,00
14,00
l 3,84
13,20
14920
14,10
13,9
12,50 12,30
12,40 12 00
12,3
9,84!
10,00
11,90
9,90
9,0
9,30
9,90 9,70
Il97O 1!930
9,84
12,30
8,5О
3,1
2,0
2,0
7,30
7,50
7,30
9,20
8,90
2,6
3,8
9,9
2,9
12, 00
12,5
2„0
2,5
5,0
10, И)
I4,О0
10,50
13,90
5 О
1О,2
8,70 8,50
8 50
11,50
12,70 11,70!
}930
129
5,0
8,00
8,30
8,30
8,70
29 аНиИПИ Заказ 5497/26 тира 490 Подписное
Произв.-полигр. цр-тие, г.. Укгород, ул. Проектнаи, 4
29 3,0
30 4,7
31 5,2
32 2,3
33 3,0
34 4,4
36 2,6
37 2,8
38 3,0
39 3,2
16,42
13,00
9,00
12,90
13,65
9,35 9,10
12,00 12,40
7,90 7,70
10,70 10,30
13,70 13,30
