Способ количественного определения микроорганизмов

 

Изобретение относится к микробиологии и позволяет сократить время исследования и повысить точность определения микроорганизмов. Анализируемую жидкость смешивают с иммуносорбентом, инкубируют, сорбент промывают фосфатным буфером. Иммуносорбент со связанными клетками обрабатывают щелочным раствором додецилсульфата натрия в концентрации . Хемилюминесцентным методом с помощью люминола и перекиси водорода определяют выделенный гемин. Количество клеток в образце определяют по калибровочной кривой зависимости интенсивности излучения от содержания клеток в стандартных растворах. i (Л to дЭ

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

0120 А1 (19) (11) (51) 4 С 01 N 33/543

OllHCAHHE ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3960911/28-14 (22) 30.09.85 (46) 15,02.87. Бюл. Р 6 (71) МГУ им. M.В.Ломоносова (72) С.Б.Власенко, Е.М.Гаврилова, А.M.Åãoðoâ, Е.И.Райнина и Н.Н.Тарасевич (53) 576.8.093(088.8) (56) Карулин А.Ю., Степина Л.Ю. и др.

Использование ИФА для определения посторонней микрофлоры в микробиологическом производстве. — Прикладная биохимия и микробиология. 1985, Ф 4. (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ (57) Изобретение относится к микробиологии и позволяет сократить время исследования и повысить точность определения микроорганизмов. Анализируемую жидкость смешивают с иммуносорбентом, инкубируют, сорбент промывают фосфатным буфером. Иммуносорбент со связанными клетками обрабатывают щелочным раствором додецилсульфата натрия в концентрации 10 5 — 10 М. Хемилюминесцентным методом с помощью люминола и перекиси водорода определяют выделенный гемин. Количество клеток в образце определяют по калибровочной кривой зависимости интенсивности излучения от содержания клеток в стандартных растворах.

1 12901

Изобретение относится к способам измерения, использующим биологически активные вещества, а именно специфическому способу определения количества бактериальных клеток в биологических жидкостях и культуральной среде, и может быть использовано в клинической микробиологии, микробиологической промышленности, и в других отраслях промышленности, где необходим контроль биозараженности.

Известен способ количественного

1 определения микроорганизмов, предусматривающий связывание их со специфическими антителами, сорбированными на поверхности твердой фазы. Для проведения анализа по известному способу анализируемый образец, содержащий клетки микроорганизмов, инкубируют с иммобилизованными на твердом носи- 20 теле антителами, специфическими к поверхностным детерминантам клетки (40-60 мин). Затем иммуносорбент, связавший клетки, несколько раз по

5-10 мин промывают и инкубируют с ан- 25 тителами, мечеными ферментом.

Продолжительность второй инкубации

40-60 мин. После этого сорбент тщательно отмывают (4 — 5 раз в течение

10 мин) от несвязавшегося конъюгата антител с ферментом, и фермент, связанный с носителем. выявляют, определяя его активность. Для этого к отмытому носителю добавляют смесь субстратов (о-фенилен-диамин и перекись

35 водорода). Конечный результат регистрируют измерением оптической плотности окрашенного продукта реакции, нарабатываемого в течение 30 мин. Общее время анализа около 3-4 ч. Пре- 40 дел обнаружения .5 ° 10 кл/мл.

Известный способ обладает следующими недостатками: определяются не только целые клетки, но и их фрагменты, что существенно влияет на пра45 вильность получаемых результатов, длительность анализа.

Цель изобретения — ускорение процесса и и повышение точности определения микроорганизмов.

Поставленная цель достигается тем, .1то согласно способу количественного определения микроорганизмов, предусматривающему связывание их со специфическими антителами, сорбированными на поверхности твердой фазы, связанные микроорганизмы обрабатывают щелочным раствором, содержащим

10 -10 M додецилсульфата натрия

-т

70 (ДСН), с последующим определением в полученной смеси люминесцентным методом концентрации выделившегося из клеток гемина, по которой с помощью калибровочной кривой определяют концентрацию микроорганизмов.

Способ осуществляют следующим образом.

Пробу анализируемой жидкости, содержащую бактериальные клетки, смешивают с иммуносорбентом. Соотношение объема пробы и объема иммуносорбента варьируется в зависимости от типа используемого сорбента и составляет

100 мкл;50 мкл-100 мкл:400 мкл. После инкубации в течение 40-60 мин, необходимой для связывания клеток с иммобилизованными антителами, сорбент промшвают три раза 0,01 M Кфосфатным буфером (рН 7,4), содержа-. щим 0,15 М ИаСХ и 0,057 тритона

Х-100. После этого образец иммуносорбента со связанными клетками подвергается обработке 0,2 M раствором

Na0H, содержащим 10 -10 М ДСН в течение 3-5 мин. В процессе этой обработки происходит разрушение клеточной оболочки и осуществляется перевод гемина с твердой фазы в раствор. Аликвота раствора затем вносится в пробирку кюветного отделения люминометра, в которую добавляются люминол и перекись водорода.

Гемин катализирует реакцию окисления люминола Н 0, сопровождающуюся излучением света. Интенсивность люминесценции пропорциональна концентрации гемина и, следовательно, количеству клеток, связавшихся с иммуносорбентом. Количество, клеток в образце определяют по калибровочной кривой зависимости интенсивности излучения от содержания клеток в стандартных растворах.

Пример 1. Построение калибровочного графика и определение количества клеток Е.cori.

Культуральную жидкость, содержащую

10 клеток/мл Е.cori разводят 0,01 М

К-фосфатным буфером, содержащим

0,15 М ИаСХ в следующих соотношениях: 1:10, 1:100, 1:200, 1:500, 1:2000.

Затем 0,5 мл раствора каждого разведения смешивают с 400 мкл суспензии

CNBr-сефарозы с иммобилизованными антителами к Е.coli. Смесь инкубируют при 37 С в течение 30 мин, после чего иммуносорбент промывают 0,01 M

К-фосфатным буфером (рН 7,4), содер3 1?901 жащим 0,057. тритона Х-100. Пробирки центрифугируют, удаляют надосадок и добавляют в каждую из них 1500 мкл

0,2 М раствора NaOH, содержащего

5 10 М ДСН и перемешивают. После

7 инкубации в течение 3 мин из каждой из них отбирают 960 мкл раствора и помещают в кювету люминометра. Затем в эту же кювету автоматически вносят

20 мкл раствора люминола (10 M) и 10 после 10 с инкубации реакцию инициируют добавлением 20 мкл Н 02 (5 х

2 2 х 10 M), измеряют интенсивность хемлюминесценции и строят калибровочный график зависимости интенсивности излучения от количества клеток, используемых в стандартных образцах.

Содержание .клеток в стандартном.о6разце контролируют методом световой микроскопии. Содержание клеток в неизвестном образце (N) определяют по калибровочному графику. Предел обнаружения клеток Е. co I i — 10 клеток/мл.

Пример 2. Построение калибро— вочного графика и определение биомассы актиномицетов Streptomyces

chrysomaIIus.

Прямой подсчет клеток актиномицетов является затруднительным из-за образования агрегатов клеток неопределенного состава, поэтому определение ведут по сухому весу. Из суспензии микроорганизмов 1:2, 1;3, 1:5, 1:8, 1:10 готовят разведения (по

12 мл). Бумажные фильтры (5 шт) вы сушивают при 80 С до постоянного веса, затем на них наносят 3 мл суспензии клеток, фильтруют, фильтры высушивают в эксикаторе над CaCt2.

Фильтры помещают на 1 ч в сушильный о 40 шкаф при 80 С, взвешивают, при этом разница в весе после нанесения суспензии клеток и чистого фильтра соответствует сухому весу биомассы в

3 мл клеточной суспензии.

Для определения биомассы 3 мл со45 ответствующего разведения суспензии микроорганизмов инкубируют с иммобилизованными антителами к Streptomyces chrysomaIIus. Далее способ осуществляют согласно примеру 1. Предел обнаружения — 5 мг/мл.

Пример 3. Определение клеток

Е.coIi в смеси микроорганизмов.

Суспензию, содержащую Е.coIi u б

10 клеток/мл BaciIIus subtiIis разводят 0,01 М К-фосфатным буфером, содержащим 0,15 M NaCI в следующих соотношениях: 1:10, 1:100, 1:200, 70

1:500, 1:2000. Затем 0,5 мл раствора каждого разведения смешивают с

400 мкл суспензии СИВг-сефарозы с иммобилизованными антителами к

Е.coIi. Инкубацию с иммуносорбентом, последующую экстракцию гемина и on— ределение интенсивности хемлюминесценции проводят, KBK B примере 1.

Затем строят график зависимости интенсивности хемлюминесценции от количества клеток в пробе . Образец среды, содержащей неизвестное количество клеток, разводят 1:100, после чего 0 5 мл раствора разведения инкубируют с 400 мкл иммуносорбента, отмывают, измеряют сигнал хемлюминесценции.

Определение количества клеток

Е.coIi проводят по калибровочному графику, полученному для стандартных концентраций Е.coIi (как в примере

1). Количество клеток Е.coIi, опрецеленное в смеси с клетками BaciIIus

subtiIis соответствует количеству клеток, найденному по стандартному раствору в отсутствии второго микроорганизма.

Оценка эффективности экстракции гемина из микроорганизмов от концентрации додецилсульфата натрия подтверждается следующими данными:

Концентрация

ДСН (М) 10

10 5.10 10 10

Величина сигнала (v) 4,9 8,7 8,6 5,9 2,9

Таким образом, использование предлагаемого способа количественного определения микроорганизмов (по сравнению с известным) сокрашает время определения с 3-4 ч до 1-1,5 ч, повышает точность анализа за счет определения только целых клеток, а также увеличивает предел обнаружения клеток.

Формула и з о б р е т ения

Способ количественного определения микроорганизмов путем связывания их со специфическими антителами, сорбированными на поверхности твердой фазы, отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса и повышения точности определения, связанные микроорганизмы обрабатывают щеСоставитель С. Еремин

Техред Л. Сердюкова

Корректор Е.Сирохман

Редактор А.Ревин

Закаэ 7893/39 Тираж -798

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Проиэводственно-полиграфическое предприятие, г ° Ужгород, ул..Проектная, 4

5 1290170 6 лочным раствором додецилсульфата нат- делением его хемлюминесцентным мето6 -7 рия в концентрации 10 -10 М, с дом с помощью люминола и перекиси вопоследующим выделением гемина и опре- дорода °