Способ количественного определения регуляторов роста растений на основе четвертичных аммониевых солей

 

Изобретение касается аналитической химии, в частности количественного определения регуляторов роста растений на основе четвертичных аммониевых солей, и может быть использовано для определения в биологических объектах хлорхолинхлорида, хлорида морфола или морфонола. Повьпление селективности определения с помощью экстракции растворителем и пропускания экстракта через адсорбент достигается использованием другого растворителя для элюирования - 0,9-1,1%-ного раствора НС1 в воде и адсорбента - силикагеля, который перед элюированием обрабатывают 45-55%-ным водным раствором ацетона со скоростью 30-40 мл/мин. Далее элюат хроматографируют в тонком слое. Способ позволяет определять пике,хлор холинхлорид.и морфол в концентрации 0,5 мкг, а морфонол - 1 мкг. 5 табл. (Л С ;о ел СА: CAD о:

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (19) (11) (51) 4 G 01 N 30/04

Е,, f

СПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3856005/31-04 (22) 15.02.85 (46) 07.03.87, Бюл. N- 9 (7!) Московская сельскохозяйственная академия им. К.A. Тимирязева (72) И.К. Блиновский, В.П. Тучков, Г.Л. Соркина и 10.А. Бунятян (53) 543.54.42(088.8) (56) Determination of, DAS 083 (N,N-Dimethylpiperidinium chloride) residues

in cottonseeds, cotton forage, soil, cottonseed procese fractions, beef

tissues, chicken tissues, milk and

eggs ° — Analytical Method, N 823, October 3, 1977. Developed By: RMC Agricultural Chemicals Residue Laboratory, Paraippany, New Jorsey; BASF

Akstiengesellschaft, Agricultural Experiment Station, Limburgerhof, Vest

Germany.

Авторское свидетельство СССР

У 767639, кл. G 01 N 31/08, 1980. (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА РАСТЕНИЙ HA 0CHOBE ЧЕТВЕРТИЧНЫХ АММОНИЕВЫХ СОЛЕЙ (57) Изобретение касается аналитической химии, в частности количественного определения регуляторов роста растений на основе четвертичных аммониевых солей, и может быть использовано для определения в биологических объектах хлорхолинхлорида, хлорида морфола или морфонола. Повышение селективности определения с помощью экстракции растворителем и пропускания экстракта через адсорбент достигается использованием другого растворителя для элюирования — 0,9-1,1%-ного раствора НС1

I в воде и адсорбента — силикагеля, который перед элюированием обрабатывают 45-55%-ным водным раствором ацетона со скоростью 30-40 мл/мин, Далее злюат хроматографируют в тонком слое.

Способ позволяет определять пикс, хлорхолинхлорид.и морфол в концентрации

0,5 мкг, а морфонол " 1 мкг. 5 табл.

1295336

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к определению регуляторов роста растений методом твердожидкостной хроматографии, и может использоваться в химических и биохимических лабораториях для обнаружения и определения содержания в биологических объектах хлорхолинхлорида, N-диметилморфолиний (хлорида морфола), N,N-дигидро(оксиэтил)-морфолиний хлорида (морфонола) и N,N-диметилпиперкдиний хлорида (пикса).

Цель изобретения — повышение селективности способа.

Способ осуществляют следующим образом (концентрации растворов ацетона

I и этанола даны в объемных Х. в воде, концентрация всех других растворов дана в массовых % в воде). Навеску

50 г измельченного образца экстрагируют 80%-ным раствором этанола в воде при малом содержании углеводов и высоком липидов, например семян масличных культур, или 80%-ным раствором ацетона в воде при высоком содержании углеводов и малом липидов, например плодов фруктовых и ягодных культур, в анализируемом материале. Этанол и ацетон предварительно подкисляют со— ляной кислотой до рН 2,0. Экстракт в полном объеме очищают от липидов гексаном и пропускают через колонку с силикагелем со скоростью 2-3 мл/мин, Силикагель промывают от коэкстрактивI ных веществ 150 мл 45-55%-ного ацетона в воде со скоростью 30-40 мл/мин..

Хлорхолинхлорид и другие органические катионы, осевшие в микропорах силикагеля, элюируют из последнего 250 мл

0,9-1,1%-ного раствора соляной кислоты со скоростью 2-3 мл/мин. Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды и наносят микропипеткой 0,1 мл на хроматографическую пластинку с тонким слоем катионита. Осуществляют развитие хроматограммы восходящим потоком

21,0-25,0Х-ным раствором серной кислоты или 3,0-5,0%-ным раствором соляной кислоты. Для проявления разделенных четвертичных солей аммония хроматографическую пластину без просушки обрабатывают 10,0-12,0Х вЂ” ным раствором фосфорномолнбденовой кислоты и после промывки водой 0,8-1,2%-ным раствором двухлористого олова. После просушивания пластинки просветляют вазелиновым маслом и измеряют оптическую плотность окрашенных пятен солей аммония на спектрофотометре в проходящем свете прн 720-740 нм. Количество определяемых регуляторов

5 роста растений, являющихся «eтвертичными солями аммония, определяют по градуировочному графику, который строят в период проведения подготовительных операций, осуществляемых

fO следующим образом.

На аналитических весах взвешивают по 1,00 г химически чистых регуляторов роста с точностью до 0,01 r. Навески переносят в мерную колбу на

500 мл и растворяют в 0,2 н. соляной кислоте, доводят объем до метки. С помощью бюретки переносят в 4 мерные колбы на 500 мл соответственно 5, 15, 25 и 35 мл полученного стандартного маточного раствора и разбавляют до

500 мл дистиллированной водой.

На катионитовые пластины размерами

70х100 мм параллельно одной из мень25 ших сторон пластинок и на расстоянии

15 мм от края мягким карандашом про-. водят стартовую линию, на которую наносят с помощью микропипеток разбавленные стандартные растворы по 0,05 мл в порядке увеличения их концентрации, что соответствует количеству определяемых регуляторов роста по зонам соответственно 1,0:3,0; 5,0:7,0 мкг.

Этот процесс выполняют в трехкрат-. ной повторности {3 пластинки).

В хроматографическую камеру наливают 21,0-25Х-ный раствор серной кислоты и устанавливают в него катионитовые пластинки на ребро, вдоль которого нанесены определяемые регуляторы роста. После поднятия фронта раствора кислоты на высоту 80 мм от стартовой линии пластинки вынимают из камеры.

Для проявления хроматограмм опускают пластинки на 3/4 их высоты в

10,0-12,0Х-ный раствор фосфорномолибденовой кисло гы в воде, выдерживают

2-3 с и промывают в 6 порциях воды (первые 5 — водопроводная, а последняя — дистиллированная), выдерживая в них пластинки по 5 мин.

После промывки пластинки осушают фильтровальной бумагой, не касаясь катионита выше стартовой линии, и обрабатывают. 0,8-1,2% — ным раствором двухлористого олова в воде аналогично первой процедуре, увеличивая выдержку до полного развития окраски

1295 хроматограмм. Ela светло-голубом фоне образуются темно-синие пятна восста-, новленных солей фосфорномолибденовых определяемых регуляторов роста.

Проявленные хроматограммы высушивают под феном и просветляют вазелиновым маслом посредством мазков мягкой (беличьей} кисточкой не менее, чем за 1 ч до измерения их оптической плотности. Измеряют оптическую плотность проявленных пятен хроматограмм относительно окружающего фона пластин в проходящем или отраженном свете при 720,0-740,0 нм.

Строят градуировочный график, откладывая по абсциссе количества нанесенных на пластинку регуляторов рос— та в мкг, а по ординате — соответствующие им величины оптических плотностей пятен хроматограмм, и вычисля- 20 ют коэффициенты пропорциональности.

Приготовление колонок с силикагелем. Из мелкопористого силикагеля марки МСМ выделяют фракцию 0,5-1,5 мм просеиванием. Закрепляют на штативе

25 стеклянные хроматографические Колонки высотой 300 и диаметром 11-13 мм.

Заполняют колонки на 1/2 высоты дистиллированной водой и затем через воронку засыпают силикагель, постуки30 вая по колонке стеклянной палочкой.

Высота уплотненной набивки силикагеля должна быть 145-155 мм.

Устанавливают на колонки питающие сосуды и промывают силикагель 1 л

2,0 н. соляной кислоты со скоростью

2-3 мл/мин, заполненные раствором кислоты колонки выдерживают I сут, а затем повторяют промывку в том же ре40 жиме. После кислотной промывки прово— дят промывку колонок дистиллированной водой до нейтрального показателя рН по индикаторной бумаге.

Смену промывочных жидкостей, а так45 же последующие внесения анализируемых растворов осуществляют при высоте предыдущей жидкости над слоем сорбента на 0,5-1,0 см. !

Устанавливают рабочие объемы аце- 50 тона (для промывки колонок и соляной кислоты (для вытеснения определяемых веществ), пропуская через колонки со скоростью 2-3 мл/мин 40 мл водного .раствора, содержащего по 80-100 мкг определяемых регуляторов роста. Проход "îáèðàþò в плоскодонные колбы на

250 мл. В том же режиме собирают 4 порции элюата по 50 мл 45,0-55,07-но336 4 го раствора ацетона в воде. Вымывают адсорбированные силикагелем регулято— ры роста О, 9-1, 1У.-ным раствором соляной кислоты, собирают в 250 мл, плоскодонные колбы со скоростью 23 мл/мин 4 порции: первая 150 мл и три последующих по 50 мл.

Собранные порции элюатов выпаривают досуха в ротационном испарителе.

Сухие остатки в колбе после охлаждения до комнатной температуры растворяют в 0,1-0,2 мл воды и в полном объеме наносят на катионитовые пластинки. Размер пластинок, нанесение и получение хроматограмм такие же, как при построении градуировочного графика.

На основании полученных результатов определяют рабочие объемы, например, для хлорхолинхлорила: первый для промывки колонок, (от коэкстрактивных веществ при выполнении анализов), равный сумме объемов порций 45-55Хного ацетона, в которых не обнаружены регуляторы роста, и второй для вытеснения адсорбированных регуляторов роста, равный сумме объемов порций

0,9-!,IX-ного раствора соляной кислоты, в которых обнаружены определяемые регуляторы роста. Например, в 45-55Хном ацетоне обнаружен препарат в четвертой порции, а в 0,9-1,1Х-ном растворе кислоты — в 1,2 и 3 порциях.

Следовательно, промывать колонки от коэкстрактивных веществ нужно объемом не более 150 мл 45,0-55,0X — ного ацетона, а вытеснять адсорбированные препараты — объемом не менее 250 мл

0,9-1,1Х-ной соляной кислоты. Первая порция прохода воды при внесении раствора препарата в колонку нужна для контроля полноты адсорбции силикагелем определяемых регуляторов роста.

Колонки, промытые дистиллированной водой от соляной кислоты, готовы к работе. Подготовленные и апробированные таким образом колонки с силикагелем могут использоваться постоянно без замены набивки, но не реже 2 раз в год проверяют и уточняют рабочие объемы для промывки и вытеснения определяемых регуляторов роста.

Пример 1. 50 г анализируемой средней пробы, измельченной на гомогенизаторе до размера частиц не более 1 мм, вносят в экстрактор, заливают 200 мл 807-ного этанола или

1295336

80Х-ного ацетона, подкисленных до рН 2 по индикаторной бумаге,и осуществляют процесс экстрагирования в течение 6 ч. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в делительную воронку на 500 мл и смешивают с 50 мл гексана путем энергичного встряхивания в течение 5 мин. После расслоения нижнюю фазу сливают в другую делительную воронку и повторяют процесс 10 очистки новой порцией гексана. Операцию повторяют до получения бесцветного гексанового слоя.

Очищенный гексаном экстракт (нижняя фаза) пропускают через колонку 15 с силикагелем со скоростью 2-3 мл/

/мин. Промывают колонку со скоростью

30-40 мл/мин 50%-ным раствором ацетона в воде с объемом, который установлен при апробации колонки. Погло- 20 щенные силикагелем регуляторы роста элюируют I,OX-ным раствором соляной кислоты со скоростью 2-3 мл/мин объемом, который также установлен при апробации колонки. Солянокислый элюат собирают в плоскодонную колбу на

250 мл и выпаривают досуха (например, на ротационном испарителе).

Сухой остаток растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды, и 0,1 мл по- 30 лученного раствора с помощью микропипеток в двукратной повторности наносят на катионитовую хроматографическую пластинку. Нанесение и все дальнейшие операции выполняют так, как при получении градуировочного графика.

Содержание остаточных количеств регуляторов роста в анализируемой пробе вычисляют по формуле 40

С„ = 5 A " И где С вЂ” содержание в пробе хлорхох линхлорида мг/кг или мг/л;

5 — коэффициент, .равный отношению объема раствора сухого 4> остатка экстракта (0,5 мл) к объему этого раствора, нанесенного на хроматографическую пластинку (О,! мл);

А — количество хлорхолинхлорида, о обнаруженное на хроматограмме, мкг по градуировочному графику;

N — масса или объем анализируемой пробы, г или мл.

Ь

Пример 2. Определение проводят аналогично примеру 1, но промывку колонок осуществляют 45% †н раствором ацетона в воде и 0,9%-ным раствором соляной кислоты. Пример 3. Анализ проводят, используя 55%-ный раствор ацетона и

I,IX-ный раствор соляной кислоты.

Результаты влияния концентрации ацетона в промывочном растворе на уменьшение содержания загрязняющих коэкстрактивных веществ (г) в элюате четвертичных солей аммония приведены в табл. 1.

В табл. 2 приведены результаты влияния концентрации хлористоводородной кислоты на активность вымывания с 250 мл элюата адсорбированных силикагелем четвертичных солей (%).

Результаты определения препаратов четвертичных солей аммония и коэффициенты их поцвижности приведены в табл. 3 и 4.

П р е р 4. Проводят анализ аналогично примерам 1 — 3, определяя стабильность и воспроизводимость результатов определений. Данные о стабильности сорбции мелкопористым силикагелем определяемых регуляторов роста при многократном использовании ()200 определений) приведены в табл.5.

Ф о р м у л а изобретения

Способ количественного определения регуляторов роста растений на основе четвертичных аммониевых солей путем экстракции их органическим растворителем, пропусканием экстракта через колонку с адсорбентом, элюированием растворителем с последующим тонкослойным хроматографированием элюата, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности и селективности определения, в качестве адсорбента используют силикагель, перед элюированием адсорбент обрабатывают

45-55 об.X раствором ацетона и в качестве растворителя используют 0,91,1 мас.%. раствор соляной кислоты в воде.

1295336

Таблица 1

Анализ ируемый материал

Концентрация ацетона, об.7.

10,0 20,0 30,0 40,0 45,0 50,0 55,0 60,0 70,0

1,32 0,96 0,68 0,56 0,54 0,48 0,48 0,49 0,64

2,24 1,64 1,24 0,92 0,89 0,84 0,90 1,04 1,36

1,80 1,28 0,96 0,72 0,70 0,64 0,71 0,76 0,97

Картофель

Яблоки

Томаты

Таблица 2

Концентрация кислоты, мас.X

Соли аммония

0,20 0,40 0,60 0,80 0,90 1,00 1,!О 1,20 1,40

94

Морфол

53 64 75 86 89 91 92 92 92

61 70 81 84 88 90 91 90 90

Пикс

Морфонол

Таблица 3

Внесено мкг

Обнаружено, мкг

Препарат

Известный способ

Предлагаемый способ блоки Томаты Ж обнаруже- Яблоки Томаты 7. обнаружения ния

0,0

10,0 Н/о H/о

8,3

8,9

Пикс

20,0 Следы Следы 0,0

17,1

18,4

10,0 8,7

81-87

8,1

8,2

8,7

Хлорхолинхлорид

84-86

45-53

40-47

16,9

20,0 17,3 16,8

10,0 4,5 5,3

16,1

9,2

Морфол

17,8

20,0

18,3

7,9 9,4

10,0 Н/о Н/о

20,0 Н/о Н/о

8,1

7,9

0,0

Морфонол

16,2 17,1

0,0

Хлорхолинхлорид 60 69 81 89 90 93 93 94

67 75 83 9! 91 94 94 94

8,3-8,9

86-92

82-87

80-84

84-92

89-91

79-81

81-85

1295336

Та блица 4

Коэффициент подвижности

Вещество

N,N-Диметилпиперидиний хлорид (пикс) 0,13-0,15

2-Хлорэтилтриметиламмоний хлорид (хлорхолинхлорид) 0,21-0,25

N-Диметилморфолиний хлорид (морфол) 0,29-0,31

0 35-0,37

Холин

Триметиламин хлоргидрат 0,36-0,38

П р и м е ч а н и е ° Пределы обнаружения для пикса, хлорхолинхлорида и морфола равны 0,5 мкг, а для морфонола 1,0 мкг.

Таблица 5

Расхождение„ Х

Сорбцня силикагепя после 200 определений орбцня свежим силикагелем

Объем 45-55Хобъема

45-55%ного ацетона до начала выхода вещества, мл ного ацетона лоты

2-Хлорэтилтриметиламмоний хлорид

8,1-9,7 150-250

-3,4

100-200

24,9-29,1

-3,7

4l,8-38,4

+2,0

N-Диме тилморфолиний хлорид

250-350 8,7 -7,9

+20 -6,4

-7,9

200-300

21 21,2-25,4

39,6-47,4

+6,1

N, N-Дигидро- (оксиэ тип) морфолиний хлорид

450-550

+3,7

450-550 7,2- 9,0

22,1-24,5

40,8-48,4

+2,4

Количество введенного вещества в ко лонку с силикагелем, мкг бъем 45-55Хого ацетона о начала выода вещества, Выход вещества с 0,9l,1Х-ной соляной кислотой {250 мл), мкг

7, 1-8,4

23,4-27,2

37,3«44,7

Выход вещества с

0,9-1,1Хной соляной кислотой (250 мл) мкг

7,8-9,4 +30

23,3-28,7

42,5-49,5

7,7-9,1 41,2"25,0

42,5-48,9 выхода вещестм. в 250 мл

0,9-1,1Хной кис12

1295336

Продолжение табл. 5

Расхождение, X

Сорбция свежим силикагелем

Сарбция силикагеля после 200 определений

Объем 45-55ХОбъем 45-55Хобъема

45-55X" ного ного ацетона да начала выхода вещества, мл ного ацетона до начала выхода вещества, мл ацетона

N,N"ÄèìåòèëïèïåðèäHíèé хлорид

450-550 895-9,9 450-550

1О

26,0-29,2

45,1-50,5

Составитель С. Хованская

Редактор О. Бугир Техред А.Кравчук Корректор А. Зимокосов

Заказ 613/52 Тираж 777 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Количество введенного вещества в ка ланку с силикагелем, мкг

Выход вещества с 0,91,1%-най соляной кислотой (250 мл), мкг

Выход вещества с

0,9-1,1Хной соляной кислотой (250 мл) мкг

8,0-9,4

24,1-28,3

41,4-48,2 выхода вещестю в 250 мл

0,9-1,1%ной кислоты

«5

-1,4

-7,3