Способ идентификации вирусов и бактерий

 

Изобретение относится к генной инженерии и касается способа идентификации вирусов и бактерий с помощью сэндвич-гибридизации нуклеиновых кислот. Цель изобретения - упрощение способа. Способ индентификации вирусов и бактерий заключается в том,. что контактирование пробы осуществляют с реагентом, нанесенным на нитроцеллюлозу , и с меченным 1 реагентом . 6 табл.

СО!ОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

0% (И) 31 АЗ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21 ) 3663405/28-13 (22) 15.11.83 (86) РСТ/FI 82/00038 (29.09.82) (3I) 813251 (32) 16.10.81 (33) FI (46) 30.03.88. Бюл. У 12 (71) Орион-Ихтюмя Ой (FI) (72) Туула Марьют Ранки и Ханс Эрик Седерлунд (ЕТ) .(53) 575.224.2:547.2(048)(088.8) (56) Cellulosa, 1977, 12, р. 23-36. (Ю4С12Q)8С! 00 (54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСОВ

И БАКТЕРИЙ (57) Изобретение относится к генной инженерии и касается способа идентификации вирусов и бактерий с помощью сэндвич-гибридизации нуклеиновых кислот. Цель изобретения — упрощение способа. Способ индентификации вирусов и бактерий заключается в том, . что контактирование пробы осуществляют с реагентом, нанесенным на нитроцеллюлозу, и с меченным I реа125 гентом. 6 табл.

1386031!

Изобретение относится к генной инженерии и касается способа идентификации вирусов и бактерий с помощью сэндвич-гибридизации нуклеиновых кис5 лот.

Цель изобретения — упрощение способа.

Упрощение способа обеспечивается за счет того, что контактирование пробы осуществляют одновременно с реагентом нанесенным на нитроцеллюлозу, и с меченным Т реагентом.

s2$

Способ подтверждается следующими !5 примерами.

H р и м е р 1. Реагенты.

Выращивают аденовирус типа 2(АТСС

UR-846 из KTL, т.е. Nat,iопа1 Public

Health Uhstitute Хальсинки), очищают 20 и выделяют ДНК далее будет называться Ad -ДНК) ДНК, переваривают с

ВатНТ-ограничительным ферментом на четыре фрагмента., Из этих четырех фрагментом два клонируют в BamHIcaum вектора pBR322 (BRL). Затем бактериальный хозяин (К.coli HBIOI (К12)

1а1, pro, leu, hrs, hrm, recA, str, F (полученный из КТЬ) трансформируют полученной плазмидной смесью. 30

Из числа трансформированных бактериальных клонов выбирают те, которые наиболее вероятно содержат рекомбинантную плазмидную ДНК, а именно стойкие к ампициллину и тетрациклину клоны. Однако бактерии, содержащие рекомбинантную плазмидную ДНК, чувствительны к тетрациклину, поскольку

caumBamHI находится в пределах тетрациклинового гена, и введение инород- 40 ной ДНК в эту зону разрушает ген.

Клоны, содержащие плазмиды, Ас1.2СpBR322, KTL Ф Е231 и Ad2D-pBR322, KTL-ÅÍ230, выращивают и очищают. Рекомбинантную плазмиду Ай 0-pBR322 45 используют в качестве фильтра-реагента. Согласно изобретения нет необходимости удалять плазмидную последовательность, поскольку данная проба не содержит последовательности

ðÂR322. Для радиоактивного мечения нуклеиновую кислоту отделяют от

pBR322 ÄÍÊ после вываривания с ВашН1 посредством электрофореза агарозного ,тела. С-фрагмент выделяют из ЬСТ-агарозы посредством экстракции фенолом или электроэлюирования и концентрируют путем осаждения этанолом.

Фиксация ДНК на фильтре.

Рекомбинантную плазмиду Айд?1рВН322 денатурируют до одноцепной формы и обрабатывают 0,2 í. Na0H (5 мин, 100 С), после чего ДНК охлаждают, перед переносом на фильтр нейтрализуют и вводят пипеткой в раствор, среда 4 SSC на льду ($$С=0,15 M NaC1, 0,0)5 М цитрат натрия). Фильтры (Schleicher u Shiill BA85 нитроцеллюлоза), тщательно смачивают в растворе 4"$$С (примерно 2 ч) до ввода ДНК.

ДНК фиксируют на фильтре в разбавленном растворе (0,5-1,0 мкгlмл) путем всасывания этого раствора через фильтр при слабом вакууме. Этот фильтр способен поглощать ДНК вплоть до !80 мкг/см . Используют концентра-:

2 ции ДНК в пределах от 0,5 мкг ДНК/

/2,5 см диаметра фильтра до 1,0 мкг/

/ДНК/0,7 см диаметра фильтра. После фильтрации ДНК фильтры промывают в

4"SSC, высушивают при комнатной температуре и прокаливают в вакуумной печи при 80 С в течение 2 ч.

Мечение радиоактивного фрагмента нуклеиновой кислоты.

Используемым для мечения радиоактивным индикатором является изотоп

I, Этот изотоп детектируют с ис—

125 пользованием 2счетчиков, которые наиболее доступны для лабораторных применений. Период полураспада этого изотопа составляет 60 дней, в результате чего срок использования меченых

I реагентов составляет примерно

4 мес.

Мечение путем И сК-трансляции.

В данной реакции ДНК становится радиоактивно меченой, когда раствор содержит меченую изотопом Т Дезоксинуклеозидную трифосфатазу (dCTP) в качестве субстрата, в данном случае называемую 125,-d-CTP (радиоактивный центр, Амершам: 1500 С2 /ммоль), При оптимальных условиях может быть достигнута удельная активность .!О отсч/мин/мкг ДНК. Меченую ДНК очищают от нуклеотидов, оставшихся в реакционной смеси, путем простой гель-фильтрации, например путем использования Биогеля Р30 (Биорадиактивного).

Другие способы мечения.

Реагент (одноцепная нуклеиновая кислота, продуцировапная М!3 шг-фагом) подвергают мечению путем химического иодирования, в Ко1 ро".1 актив

1386031 ный I ковалентно связан с нуклеиновой кислотой.

В случае PHK-содержащего вируса клонирование фрагментов генома осуще- ствляют таким образом, что сначала получается воспроизводимая копия ДНК (с ДНК) вируса PHK посредством обратной транскриптазы, а затем посредством ДНК-полимераэы воспроизводится вторая цепь ДНК.

Проведение испытания.

Обработка пробы.

Микробную нуклеиновую кислоту,подвергаемую исследованию, выделяют f5 из самого микроба, а также из зараженных клеток, после чего ее денатурируют до одноцепной формы. Вырусные геномы высвобождают путем обработки материала пробы 1Ж-ным додецилсульфатом натрия (SDS) и разрушают белки, защищающие посредством К-обработки протеиназой (1 мг/мл, 37 С, 60 мин).

Кроме того, бактериальные пробы разрушают с использованием обработки лизоцимом и этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЕДТА).

Если проба содержит большие количества вязкой высокомолекулярной кпеточной ДНК, то с целью уменьшения вязкости этой пробы воздействуют ультразвуком или путем продавливания пробы несколько раэ через .тонкое отверстие.

Гибридизация.

Гибридизацию осуществляют, например, в 507.-ном формамиде (деионизированный, выдержанный при — 20 С) в 4 SSC, раствор 1 Denhardt, содержащий IX SDS и 0,5 мг/мл ДНК (лососевая 4ц сперма или зобная железа теленка), о при 37 С и обычно в течение ночи (1620 ч). Выбранные для испытания фильтры термостатируют в соответствующем сосуде, в который вводится смесь гиб- 45 ридизации, и начинается гибридизация.

Эта смесь гибридизации содержит предварительно обработанную пробу, в которую вводится радиоактивная нуклеиновая кислота (или кислоты) в качестве реагента, которая денатурирова50 на совместно с этой пробой путем кипячения в течение 5 мин с последующим быстрым охлаждением при 0 С; концентрированные растворы формамида, SSC и Denhardt, которые вводят пипеткой в денатурированную и охлажденную смесь нуклеиновых кислот. После смешивания смесь гибридизации вводят пипеткой на фильтры в сосуде гибридизации. После гибридизации фильтры осторожно промывают и в отдельности подвергают замеру в р-счетчике.

Детектирование аденовируса методом сэндвич-гибридизации (табл. 1).

Среду гибридизации измеряют в испытательной пробирке, содержащей лишь фильтр и меченую нуклеиновую кислоту . в качестве реагента, без пробы. Среду гибридизации создают последовательностями pBR322, находящимися в меченой нуклеиновой кислоте (реагента).

Эти последовательности гибридизируют непосредственно с фильтром без участия пробы. Фильтры, содержащие зобную железу теленка и не содержащие

ДНК, используют в данном испытании как контрольные, показывая, на специфичность гибридизации и на уровень неспецифической среды, создаваемой, например, при недостаточной промывке.

В табл. 1 среду, обусловленную реагентами, отделяют от cpm, гибридизированных с фильтрами.

Меченая нуклеиновая кислота в качестве реагента.

Ad -ВалН1, С вЂ” фрагмент, очищенный, удельная активность 90 1О отсч/

/мин/мкг (200000 отсч/мин I /реакция).

Гибридизация: 507.-ный формамид, 4 ББС. Раствор Denhardt, содержащий

0,5 мг/мл ДНК спермы лосося и IX SDS, 37 С, 16 ч.

Промывка: 0,1Х Я$С, комнатная температура, 40 мин.

Пробы: ДНК Аденовируса типа 2 (BRL).

Заражают аденовирусом типа 2 клетки Heha. Эти клетки затем разрушают путем обработки 1X SDS с последующим вывариванием 1 мг/мл протеиназы-Кфермента (сигма) в течение 30 мин о при 37 С. Перед денатурированием пробу пропускают через тонкое отверстие.

Значения, приведенные в табл. 1 были рассчитаны путем выделения среды реагента, полученной при осуществлении аналогичной гибридизации, но без пробы.

Пример 2. Детектирование PHKвируса посредством сэндвич-гибридизации (табл. 2).

Используют модель РНК-вируса, а именно штамм Semlike-Forest (прототипный штамм, полученный в Лондонской школе гигиены и местной медициk

1386031 ны), который является одноцепочной

PHK. Получают ДНК, которую клонируют в точку PstI плазмида pBR322. Получают рекомбинантную плаэмиду рКТН312

KTL Ф ЕН232. Клон бактерий, содержа5 щих эту плазмиду, имеет длину, составляющую примерно 1400 нуклеотидов со структурной белковой частью, примерно от нуклеотида 200 до нуклеотида 1600, когда нумерация ведется от начала структурных генов. Для продуцирования реагентов рекомбинантную плазмидную ДНК рКТН312 обрабатывают с ограничительным ферментом EcoRI (BRL) (последовательность, происходящая от вируса Semlike Forest, не содержит. точек распознавания для фермента EcoRI), и эту линейно вытянутую плазмиду разделяют на два фермен- 20 та с использованием фермента XhoI (BRL). Точка распознавания последнего расположена внутри вирусной последовательности Semlike-Forest.

Фрагмент А ЕсоВХ-Xhcrl большего разме-2 ра (примерно 3900 основных пар) фиксируют на фильтре, и фрагмент В меньшего размера (примерно 1850 основных пар) подвергают мечению изотопом

I с использованием метода ник

30 трансляции. В данном испытании используют как свободный вирус Беш1ЖеForest, так и зараженные вирусом клетки. В обоих случаях специфические нуклеиновые кислоты вируса данной пробы состоят полностью из PHK.

Меченные нуклеиновые кислоты в качестве реагентов EcoRI-XhoI — фрагмент В плазмида рКТН312, удельная активность 90 .10 отсч/мкг ДНК (200000 отсч/мин Т реакция).

Гибридизация. Как описано в: табл. 1.

Промывка. Как описано в табл. 1.

Пробы. До проведения испытания вирус Semlike-Forest, (30 мкг) разрушают посредством SDS. Зараженные клетки подвергают обработке, как указано в табл. 1. Заражение вирусом

Semlike-Forest осуществляют на клетках ВНК-21.

Данные, приведенные в табл. 2, рассчитывают с учетом среды реагента, полученной при аналогичной гибридизации, без пробы.

Пример 3. Проба вируса, в ко- 55 торой вирусный передатчик PHK детектируется посредством метода сзндвичгибридизации (табл. 3).

Реагенты сэндвич-гибридизации получают иэ ДНК вируса SV 40 (BRL) путем разделения ДНК на две части с использованием PstI-фермента. Эти фрагменты выделяют и очищают посред-. ством электрофореза на агарозном геле. Фрагмент А (4000 основных пар) подвергают радиоактивному мечению путем "ник" трансляции I " "и фрагмент

1 2Ю

В (1220 основных пар) фиксируют на фильтре .

Фрагменты.ДНК выбирают таким образом, что каждый содержит гены, кодирующие как ранние, так и поздние передатчики инфекции. Так, например, фрагмент В содержит примерно 700 основных пар от структурного белкового гена VPl и более 600 основных пар от гена более ранних передатчиков инфекции. Поскольку ДНК вируса SV 40 сама по себе представляет собой кольцо с ковалентной связью, то она не может быть детектирована в данном . испытании до линейного выравнивания.

Следовательно, при использовании эа— раженных клеток в качестве пробы можно проверить, насколько предлагаемый способ пригоден для детектирования воспроизведенных молекул PHK вирусного генома. Как видно из результатов, приведенных в табл. 3, данное испыта1 ние пригодно для исследования зараенных клеток. В табл. 3 также показано, что одни и те же реагенты используют для исследования как вирусной ДНК, так и полученной из нее ш

PHK (информационной PHK).

Меченая нуклеиновая кислота, используемая в качестве реагента.

Более длинный А-фрагмент Pst ДНК вируса БЧ 40, удельная активность

28 1О отсч/мкг ДНК (200000 отсч/мин

I реакция).

12 5

Гибридизация. Как описано в табл. 1. Продолжительность гибридизации 40 ч.

Промывка. Как описано в табл. 1.

Пробы. Для вируса SV-40 (BRL) обрабатывают ограничительным ферментом

EcoRI (BRL). Клетки С Vl заражают вирусом SV 40 и собирают через 40 ч после заражения. Обработка пробы осуществляется как описано в табл. I.

Данные рассчитаны с учетом среды реагента, полученной при аналогичной гибридизации, осуществляемой без пробы.

1386031

Пример 4. Детектирование

Bacillus amyloliquefaciens посредством сэндвич-гибридизации.

Данные реагенты представляют со5 бой фрагменты 1-амилазного гена

В.amyloliquefaciens E. 18, которые выделяют для данного испытания из рекомбинантной плазмиды рКТН10 путем обработки ограничительным ферментом 10 и последующего электрофореза агарозного геля. Фрагменты, используемые для данного испытания, представляют собой фрагментные участки CIaI-EcoRI о -амилазного гена (460 основных пар) . (CIaI Boehringer Mannheim) и фрагмент EcoRI ВашНЕ (1500 основных пар). Фрагмент EcoRI-BamHI фиксируют на фильтре, и фрагмент CIaI-EcoRI подвергают радиоактивному мечению 20 изотопом I методом ник" трансляции.

Как видно из табл. 4, В.amyloliquefaciens в пробе идентифицируется путем сэндвич-гибридизации на основе 25 одного d-амилазного гена. Е.coli дает отрицательный результат в данном испытании (неотличим от среды).

Меченая нуклеиновая кислота в качестве реагента.

Фрагмент CIaI-EcoRI И-амилазного гена от плазмиды рКТН10, удельная активность 35 10 отсч/мин/мкг

4 (200000 отсч/мин I /реакция).

Гибридизация. Как описано в табл. 1.

Промывка. Как описано в табл. 1, Пробы., Бактериальные пробы обрабатывают лизоцимом (67 мкг/мл) в тече-, ние 30 мин при 37 С; в пробы E.coli 4р вводят также 5 ммоль ЕДТА. После такой обработки во все пробы вводят

SDS (до конечной концентрации 2X), затем их дважды пропускают через очень тонкое отверстие с целью сниже- 45 ния вязкости, после чего их подвергают денатурированию путем кипячения, как описано в тексте, относящемся к обработке проб.

Данные, приведенные в табл. 4, рассчитаны с учетом среды реагента, полученной при аналогичной гибридизации без пробы.

Пример 5. Пример получения системы комбинаций реагента на основе метода сэндвич-гибридизации

55 (табл. 5).

Пробы, исследуемые в данном испытании, представляют собой клетки, зараженные тремя вирусами (аденовирус, вирус SV 40 и тетраплоидный вирус Herpes, имеющий лишь один определенный детерминантный ген), и пробу, содержащую бактерии Bacillus

amyloliquefaricus В каждую пробу вводят одновременно следующие реагенты: пять фильтров, каждый из которых содержит один тип ДНК от вируса SV 40, аденовируса, d-амилазного гена Bacillus атпу1о1щ еГaricu и зобной железы теленка, а также фильтр, не содержащий ДНК; кроме того, вводят 200000 отсч/мин каждого из следующих меченых нуклеиновокислотных реагентов: ДНК вЂ” реагент вируса SV 40, аденовируса и -амилазного гена.

Данный пример показывает, что можно без разделения разбавленного раствора пробы исследовать одновременно соответствующие серии микробов путем ввода в пробу комбинации реа- гентов. Такая проба может содержать как вирусную, так и бактериальную нуклеиновую кислоту. Данные фильтры могут быть помечены определенным обозначением (марка, метка), которая определяет содержание в них реагентов и какой микроб фиксирован (гибридизирован) с ними. Эта метка может быть представлена в виде цифр или букв, например 1 или SV 40 2 или Ad u т.д., или могут быть приняты другие обозначения, например для SV 40 или Л для AD или 0 для Bacillus

Меченые нуклеинокислотные реагенты. Вирус SV 40 как и в табл. 3. Аденовирус как и в табл.1. -амилазный ген как и в табл. 4.

Гибридизация, Как в табл.1.

Промывка. Как в табл 1.

Пробы. Клеточные пробы, зараженные вирусом SV 40 и аденовирусом, были описаны соответственно в табл.3 и 1.

Клетки Vего 10 заражают вирусом

Herpes (тетраплоидом, имеющим лишь один определенный детерминантный ген) типа 1. Клетки собирают через 20 ч после заражения, поскольку может иметь место фагоцитарный эффект. Пробу обрабатывают таким же образом, как описано для клеток, зараженных аденовирусом (табл. 1). при концентрации 7 ммоль NaOH npu

100 С, 5 мин.

Клетки обрабатывают лизоцимом (500 мкг/мл), ЕДТА (70 ммоль, 37 С, 30 мин), SDS (0,257., 65 С) и свободную ДНК денатурируют путем кипячения при концентрации NaOH 14 ммоль, при

100 С, 5 мин.

Данные; представленные в табл. 6, откорректированы на среду реагента, полученную при аналогичной гибридизации, без пробы.

Способ идентификации вирусов и бактерий, основанный на сэндвичгибридизации нуклеиновых кислот, включающий последовательное контактирование пробы нуклеиновой кислоты с нуклеиново-кислотным реагентом, нанесенным на твердый носитель, и меченым нуклеиново-кислотным реагентом, с последующим радиоактивным анализом, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, контактирование пробы осуществляют одновременно с реагентом, нанесенным на твердый носитель, с последующей промывкой полученного гибрида, при этом для идентификации аденовирусов в качестве реагента, нанесенного на твердый носитель, используют Ad

pBR322 размером 47000 п.о., а в качестве меченого реагента-фрагмент

Adq BamHI размером 6200 п.о., для идентификации вируса Semlike-Forest фрагмент EcoRI-XhoI размером 3900 п.о плазмиды рКТН312 и фрагмент EcoRIXhoI плазмиды рКТН312 размером !

850 п.о., для идентификации вируса

SV 40-PstI — фрагмент вируса SV 40 размером 1220 п.о., для идеитифика ции бактерий Bacillus amyloliquefaciens — фрагменты EcoRI-BamHI плазмиды рКТН10 размером 1500 п.о. и ClalEcoBX плазмиды рКТН10 размером

4600 п.о., для идентификации Escherichia соli — плазмиду рКТН45 размером 740 п.о. и рекомбинантный фаг

mKTHl207 размером 1700 п.о., для одновременной идентификации аденовирусов, SV 40, Мш1Ые-Forest, В ашу1о1 с иеГас епз и Е.coIi используют все описанные выше реагенты одновременно.

Меченые нуклеинокислотяые реагенты m КТН1207, удельная активность

8.10 отсч/мин/мкг ДНК (200000 отсч/

/мин/реакция).

Гибридизация. 4 БС$ раствор liDenЬагй1 без BSA (альбумин бычьей сыворотки, 0,25X SDS 200 мкг/мл ДНК спермы Herring 17,5 ч 65 С.

Промывка. Как описано в табл. l.

Пробы. ДНК клеток Е.coli К 12

HB10l выделяют, ДНК денатурнруют

9 138603 10

Проба Bacillus amyloliquefaciens.

Как в табл. 4.

Данные, приведенные в табл. 5, рассчитаны с учетом среды реагента, полученной при осуществлении аналогичной гибридизации без пробы.

Пример 6. Детектирование

Escherichia coli путем сэндвич-гибридизации (табл. 6). !О

Реагенты получают из omp-А-гена (А — ген наружного мембранного белка)

Escherichia coli.

Гибридные плазмиды рКТН40 и рКТН45, используемые в качестве ис- 15 Ф о р м у л а и з î б р е т е н и я ходного материала, приготавливают иэ плазмиды pTUIOO.

Плазмиду рКТН45 (находящуюся на хранении как КТЬ, в институте Natio. nal Public Health Хельсинки, под но- 20 мером EM254),. используемую в качестве фильтра-реагента, состоит из 740

f основных пар от 5 -концевого звена гена ompA, введенного в плазмид

pBR322. 25

Плазмида рКТН40 содержит 300 осF новных пар от 3 -концевого звена гена ompA, после чего следует 1400 основных пар от генома Е.coli. Плазмиду рКТН40 расщепляют ограничительным ферментом BamHI до получения фрагмента ДНК Е.coli, который содержит

1700 основных пар, как указано вышее.

Этот фрагмент переносят в одноцепной бактериофаг M13mp7. Рекомбинантный фаг КТН1207 (обозначаемый как KTJi

9 EH256) подвергают мечению изотопом

I и используют в качестве инди125

"катора в способе сэндвич-гибридизаЦИИ. 40

ДНК от разрушенных клеток Е.coli, а также выделенная и очищенная ДНК от клеток Е.coli детектируют посредством сэндвич-гибридизации, как показано в табл. 6 °

138603 1

Таблица1

Испытание с аденовирусом

Проба

Адено

Зобная Холосжелеза тое истеленка "+ пыта-Ф,Ф фЕ ние

2-ДНК аденовирусного типа {BRL) (500 нг) 49

9000

8200

Ad.gD — рВБ322 плазмиды, 2 мкг.

ДНК зобной железы теленка, 1 мкг (Boehvinger Manheim).

++У

Холостое испытание (отсутствие

ДНК).

Т а блица 2

Детектирование вируса Semlike-Forest посредством метода сэндвичгибридизации

Проба

Зобная железа

ХолосВирус

Sem1ikeForest " тое испытание" телен++ ка

Вирус Semlike-Forest

30 мкг

3340

2698

Незараженные клетки 10 Фрагмент А ZcoRI-XhoI (1,2 мкг) плазмиды рКТН312.

ДНК зобной железы теленка, 1 мкг.

+ + Холостое испытание (отсутствие

ДНК) .

НеЬа-клетки (6 10 ), зараженные аденовирусом

Клетки, зараженные вирусом

SemlikeForest (5 .10 ) Фильтры (срш), отсч/мин

Фильтры (срш), отсч/мин!

1386031

Таблица4

Бактериальная диагностика посредством сэндвич-гибридизации

Фильтры (cpm), Проба отсч/мин

Проба с(-амилаэа

Зобная желез а

ХолосSV 40" Зобная

Холостое исжелеза теленка+ тое испыта 10 ние"" теленка+ пытание

Испытание 1

104

5773 47

20061 159

Беэ пробы

Беэ пробы

Испытание 2

Е.coli

НВ101

25 (10 ) 30

3377

30814 294

580

Bacillus

amyloliquefari-.

cus (I0 ) 2871

EcoRI-BamHI фрагмент a(-амилазного гена из плаэмиды PKTHIG, 0,35 мкг. .ДНК зобной железы теленка, мкг.

Холостое испытание (без ДНК).

3ЮФ

Таблица3

Детектирование вируса SV 40 посредством сэндвич-гибридизации

Вирусная

ДНК SV 40 (50 нг), вытянутая в линию

Клетки С

Vl, зараженные вирусом SV 40, черз 40 ч после заражения (10 клеток) Незараженные клетки

Ф

Более короткий фрагмент Pstl В (0,2 мкг) ДНК кольцевого вируса;

SV-40, вываренный с PstI — ограничительным ферментом 40 *

ДНК эобной железы теленка, I мкг.

+ФФ

Холостое испытание (отсутствие ДНК) ДНК плазмиды

pKTHI0 (вытянутая в линию)

1 мкг

Bacillus

amyloliguei aricus (310 ) Фильтры (отсч/мин) cpm

15! 386031

Таблица5

Фильтры !",отсч/мин) cpm

Проба

SU 40 Адено"" î -амилаза+ »

Холостое исЗобная железа телен" ка «+ » пытание к+» к»

Клетки, зараженные вирусом SV 40

13 (!0 ) 1 8390 2

31

Клетки, зараженные аденовирусом типа

2 (6 10 ) 8750 . 5

Клетки, зараженные вирусом Herpes (тетраплоидом) 13

Bacillus amyloliquefaciens 15

6500

Незараженные клетки

+ Как описано в табл. 3.

Как и в табл. 1.

« Как и в табл. 4, ++++

"«ДНК зобной железы теленка, 1 мкг.

+ -+ +

Холостое испытание (отсутствие ДИК).

Таблицаб

Детектирование путем сэндвич-гибридизации

Фильтры (отсч/мин) cpm

Проба ошр А

Холостой опыт м

Зобная железа теленка »

ДНК от

Е.coli

К 12

НВ!01 а) 2 10

282

ДНК от

Е.coli

К !2

HB10 I а) 2 -1Ое

2206

I 38603 1

Проба

Фильтры (отсч/мин) cpm

omp А

Зобная железа

Холос- той опыт " теленаа»+

Клетки

Е.coli

К12НВ101 б) 2 10

11 13

Клетки

Е.С611

К12НВ!О! б) 2 10

2327 12 а) Ряд молекул ДНК б) Ряд клеток

Плазмида рКТН45, 1,088 мкг (2 1О 1 молекул).

»+

ДНК зобной железы теленка, 1 088 мкг

» » Холостое испытание (отсутствие ДНК) Составитель Н, Кузенкова

Редактор Н. Киштулинец Техред М.Ходанич Корректор М. Демчик

Заказ 1426/57 Тираж 520 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Произвопсгвеиио-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проек1нв», 4