Способ получения l-пролина
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН (19) (1!) А1
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н АВТОРСКОМ .Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3884279/28-13 (22) 11. 05. 85. (46) 15. 07. 88. Бюл. !(26 (71) Научно-исследовательский технологический институт аминокислот (72) Ш.N. Кочарян, Ж.В. Карапетян, С. К. Келешян, А. Г. Азизян, Э.М. Акопян, А.В. Арушанян и А.А. Амбарцумян (53} 668. 394 (088. 8) (56) Патент США Р 4224409, кл. 435-107, опублик. 1980. (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ПРОЛИНА путем ферментации с использованием мутантов микроорганизмов, относящихся к роду BrevibacLerium в питательной . среде, содержащей усвояемые источники углерода, азота, неорганические соли и стимуляторы роста с последующим вы(5!) 4 С 12 Р 3/24//(С 12 Р 13/24, С 12 R 1: 13) делением целевого продукта, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода L-пролина, используют мутанты Brevibacterium flavum, устойчивые одновременно к аналогам пролина и к повышенному осмотическому давлению среды и неспособные, катализировать Ь-пролин.
2. Способ по п. 1, о т л и ч аю шийся тем, что в качестве мутантов используют штаммы бактерий
Brevibacterium flavum АР 111 или
Brevibacrerium flavum АР 112.
3. Способ по п. 1, о т л и ч аю шийся тем, что в качестве му тантов используют штаммы бактерий
Brevibacterium flavum .АР 110 или Brevibacterium flavum AP 113.
14Щ65
Изобретение относится к микробио логической промышленности и касается получения 1.-пролина при помощи ферентации с использованием мутантов икроорганизмов, продуцнрующих L-пролин, что является одной из важнейих аминокислот, и используется в едицине.
Цель изобретения — повышение вы- 19 хода с L-пролина.
Цель достигается путем использоваия мутантов Вrevibacterium flavum устойчивых одновременно к 3,4-дегидро-Р,L-пролину (далее именуется ДП) 15 и повышенному осмотическому давлению среды и неспособных катаболизировать
-пролин. Причем, мутации сообщающие бактериям устойчивость к ДП и повы— енному осмотическому давлению среды 20 мутации, сообщающие бактериям неспособность катаболизировать L-проин, как и комбинации этих мутаций ,обладают положительным эффектом в отношении увеличения уровня выхода L-- 25 пролина также в сочетании с иными мутациями, способствующими прЬдукции
-пролина, например мутациями ауксотрофности по L-изолейцину.
Примерами штаммов — продуцентов
1L-пролина, использованных в предлагаемом изобретении и хранящихся в Центральном музее промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенстика"
7 под соответствующими номерами ЦМПМ В, являются следующие мутанты Brevibacterium flavum штамм АР111 (ЦМПМ В3258), ° штамм АР110 (ЦМПМ В-3318) штамм AP1 12 (ЦМПМ В-3258) и штамм 40 АР113 (ЦМПМ В-3260). Указанные новые
ытаммы получены генетико-селекционными приемами из штамма Brevibacterium
Х1avum АТСС14067. Штаммы АР111 и
АР112 являются мутантами : устойчивыми одновременно к ДП и повышенному осмотическому давлению среды, а штаммы АР110 и АТ113 — мутанты, устойчивые одновременно к ДП и повышенному осмотическому давлению и неспособные катаболизировать L-пролин. Кроме того, штаммы АР111, АР112 и АР113 являются также мутантами, нуждающимися в L-изолейцине для роста. Штаммы
АР110, АР111 и АР112 и АР113 сходны, 55 за исключением перечисленных признаков и пролинпродуцирующей способности, по своим культурально-морфологическим, культуральным и физиологическим признакам со штаммом Вгеч1bacterium f1avum АТСС 14067.
Мутации устойчивости к ДП и повышенномуу о смо тиче скому давлению среды, неспособности катаболизировать
L-пролин и ауксотрофности по Ь-изолейцину могут быть получены поэтапНо и в любом порядке с помощью мутагенизации бактерий любым известным способом (например, обработкой N-метил-N -нитро-N-нитрозогуанидином или ультрафиолетовым облучением) на каждом этапе и последующей идентификацией соответствующих мутантов. Указанные мутации могут быть также получены у разных штаммов и совмещены в одном геноме с использованием какоголибо способа генетического обмена, например, слияния протопластов, В качестве соединений повышающих осмотическое давление среды могут быть использованы сахароза или хлорнды щелочных металлов, например, хлорид натрия.
Штаммы-продуценты L — пролина, использованные в предлагаемом изобретении получают следующим образом.
Получение штамма Brevibacterium
f1avum АР110.
Штамм Brevibacterium flavum АТСС
1 4067 выращив ают в мясо-пе п тонном бульоне (далее МПБ) при 30 С с аэрацйей до достижения титра 10 клеток/мл, Клетки отмывают от МПБ центрифугированием, промывают цитратным буфером, рН 5,6, вновь осаждают центрифугированием и ресуспендируют в цитратном буфере, рН 5,5. К полученной суспензии добавляют N-метил-N -нитро-N-нитрозогуанидин (далее НГ) до конечной концентрации 300 мкг/мл и инкубируют с аэрацией в течение 20 мин при 30 С.
Затем клетки отмывают от мутагена охлажденным МПБ, переносят в пробирки с 10 мл МПБ и инкубируют 18 ч с аэрацией при 30 С. Полученную мутагенизированную НГ культуру осаждают центрифугированием и переносят в пробирки Со средой ¹ 1 состава, мг/мл: сахароза 250; Na КН РО 1; МяБО 7Н О 0„1; ИН С1 5; NH+NO 1 МпБО<, 5Н О 1 10 PeS04 х 7Н О 1. 10; биотин 2 ° 10; тиамина хлорид 10" и ДП 1,5, рН 7,4 с таким расчетом, чтобы начальный титр культуры был равен 10 клеток/мл. Культуру в пробирках выращивают с о аэрацией при 30 С до помутнения (481409659 72 ч), затем рассеивают на поверхности среды М 1, содержащей 27. агар-агара и инкубируют 48 ч при 30 С. Один из Bblpocøèõ на этой среде мутантов вновь подвергают мутагенезу НГ как это описано и высеивают на поверхность агаризованной среды У 2 состава, мг/мл: глюкоза 20; Na S04 2; K HPO 3; KH PO4 1; NH Cl 3; NH NO 1; HgSOg 7Н О 0»1; МпБО 5H O I 10 +, Ге$04к 7Н,О 1 1О ; биотин 5 1 О ; тиамина хлорид 1 10 и агар arap 20; рН 7,4. Отдельные колонии, выросшие на этой среде через 48 ч инкубации при 30 С, проверяют на способность к,росту на среде У 3, которая содержит L-пролин в качестве единственного источника углерода и азота для роста, cocтав среды и 3, мг/мл: Ь-пролин 10; Иа БО 2; К<НРО< 3; KH РО 1; MgSO4 7H O О 1 MnS04-5Н О 1 ° 10 FeS0 ° 7Н О 1 ° 10 4 ; биотин 5 ° 10 ; тиамина хлорид 1 10 .и агар-агар 20, рН 7,4. Колонии, неспособные к росту на среде М 3 через 96 ч инкубации .при о 30 С, проверяют на пролинпродуцирующую способность в условиях, указанных в примере 1. Один из отобранных таким образом мутантов обозначен Brevibacter ium flavum АР110. Получение штамма Вге iЬасг.егium f. lavum АР111. Мутагенизированную культуру штамма А СС 14067 (условия мутагенеза такие же, как выше при получении штамма АР 110) высевают на среду Р 2, которая содержит дополнительно L-изолейцин в концентрации 0 5 мг/мл, Среди колоний, выросших на этой среде через 48 ч инкубации при 30 С отбирают мутант, неспособный к росту на среде Ф 2, которая не содержит L-изолейцин. Полученный изолейциновый ауксотроф вновь мутагенизировали Н7 и отбирают мутанты, устойчивые к ДП и повышенному осмотическому давлению среды, как описано при получении, штамма АР110, но с той разницей что в среду Р 1 вносят вместо 250 мг/мл сахарозы 20 мг/мл глюкозы и 28 мг/мл NaCl a также 0,5 мг/мл L-изолейцина. Один из отобранных таким образом мутантов, продуцирующий повышенные количества L-пролина, обозначен Brevibacterium flavum AP111, Получение штамма Brevibacterium flavum AP 112. зы, с помощью приемов, описанных для 25 получения штамма АР110. У полученно30 55 (10 Изолешпновый ауксотроф штамма ATCC 14067,индуцированный НГ, как описано при получении штамма AP111,вновь обрабатывают НГ и отбирают мутанты, устойчивые к ДП и повышенной концентрации сахарозы на среде Ф 1, как описано, для получения штамма АР!10 с той разницей,что среда N - 1 содержит 0,5 мг/мл L-изолейцина. Один из отобранных таким образом мутантов, продуцирующий повышенные количества Ь-пролина, обозначен Brevibacterium flavum AP112. Получение штамма Brevibacterium flavum AP113. У штамма АТСС 14067 отбирают мутант, неспособный катаболиэировать L-пролин с помощью приемов, описанных при получении штамма АР110. На следующем этапе у полученного штамма, неспособного катаболизировать Ь-пролин, отбирают мутант, устойчивый к ДП и повышенной концентрации сахарого двойного мутанта, который неспособен катаболизировать Ь-пролин и устойчив к ДП и повышенному осмотическому давлению среды, отбирают мутант, нуждающийся в L-изолейцине для роста, приемами, описанными при получении штамма АР 111. Один из полученных таким образом мутантов, продуцирующий повышенные количества L-пролина, обозн-weH Brevibacterium flavum AP 113. Отличительные признаки мутантных штаммов, использованных в предлагаеI мом изобретении, в сравнении друг с другом и штаммом АТСС 14067 даны в табл. 1. Способность к катаболизму L-пролина определяют по появлению роста в зоне нанесения капель суспензий штаммов, указанных в табл. 1, на поверхности агаризованной среды N - 3 (состав среды Р 3 указан) после 96 ч инкуба., ции при 30 С. Появление роста обозначено знаком "+", а отсутствие роста знаком Для определения устойчивости к ДП и повышенному осмотическому давлению среды бактерий штаммов, укаэанных в табл. 1, вносят из расчета 10 кле5 ток/мл в пробирки с жидкой средой У 1 (состав среды 9 1 указан), содержащей 250 Mr/мп сахарозы и различные концентрации ДП (в случае штаммов АР111, АР112 и АР113 среда 9 1 содержит L-изолейцин в концентрации 1409659 т с р о р L т т 3 ч ц Ь д р ( м в д Та блица 1 Штамм Brevibacterium flavum Относительный рост, % Способность к Концентрация ДП, мг/мл росту на сре де с пролином как 1,5 2,0 О 0,75 1,0 источником углерода и азота 100 13 12 12 8 100 76 67 53 46 АТСС 14067 ! ) АР110 (ЦМПМ В-3317) 5 мг/мл). Пробирки инкубнруют в тение 24 ч при 30 С с аэрацией, а зам определяют оптическую плотность льтур при 540 мкм. Представленные табл. 1 данные выражены в проценх от оптической плотности культур, ащенных в среде Р 1, которая не держала ДП. Для накопления L-пролина в культуьной жидкости мутантов, предлагаев данном изобретении, могут быть пользованы любые питательные среды, держащие усвояемые источники угледа, азота, неорганические соли и ганические вещества, стимулирующие ст микроорганизмов и продукцию нролина. Накопление L-пролина имеет место и культивировании в аэробных усяоях в достаточно широком диапазоне мператур и значений рН, хотя опмальными являются температуры 28С, а значения рН 6,5-8,5. Появление L-пролина наблюдается рез 8-10 ч после начала ферментаи. Однако, максимальный уровень пролина в культуральной жидкости стигается в результате полного потбления источника углерода и энергии ерез 36 ч и более после начала фернтации в зависимости от использонной концентрации источника углерои энергии). Содержание L-пролина в культуральй жидкости определяют с помощью меда бумажной хроматографии и окрашиния иэатином. Накопленный L-пролин может быть щелен из культуральной жидкости любым известным способом, таким как удаление бактерий и нерастворимых частиц проточным центрифугированием или фильтрацией, посадка L-пролина на ионообменные смолы с последующими элюцией, концентрированием и кристаллизацией Ь-пролина. Пример 1, В ферментационные 10 колбы объемом 250 мл асептически разливают по 10 мл простерилизованной ферментационной среды следующего состава, r/л: сахароза 150; (NH +) S0< 55; КН Р04 1; 1gSOg 7Н 0 10; СаСОз 1Б 50; FeSO ° 7Н О 0,01; МпЯО+ 5Н О О, 01; Zn S0< 7Н <О О, 01; био тин О, 0005; тиамина хлорид 0,0005; рН 8,0. Колбы инокулируют штаммом Brevibacterium flavum АР 110 и инкубируют на качалке 20 в течение 72 ч при 30 С. В полученной после инкубации культуральной жидкости выход L-пролина составляет 40,5 г/л. В этих же условиях штамм Brevibacterium flavum АТСС 14067 продуцировал 3,4 г/л L-пролина, П р е р 2. Условия фермента. ции и состав ферментационной среды, как указано в примере 1, с тем исключением, что в состав среды вносят так30 же L-изолейцин в концентрации 0,15 г/л и различные колбы инокулируют штаммами Brevibacterium flavum АР111, Brevibacterium flavum АР 112 и Brevibac— егдшп flavum АР113. Выход L-пролина в культуральных жидкостях, полученных после ферментации указан в табл. 2. В аналогичных условиях выход 1.— пролина у изолейциновых ауксотрофов штамма Brevibacterium flavum АТСС 14067 не превышает 20 г/л. 1409659 - Продолжение табл. 1 тельный рост Х Штамм Br terium Е1 трация ДП, мг/мл ,0,75 1, сточ АР 111 (ЦМПМ В-3258) + Таблица 2 L-пролин, г/л Штамм Brevibacterium flavum 56,6 АР111 76,5 АР 112 АР113 97,5 Составитель Н. Афанасьева Техред Л.Олийнык Корректор В.Гирняк Редактор И. Сегляник Заказ 3446/26 Тираж 520 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР ло делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 ость осту а сре е с проли- ом ка иком глер а и зота АР112 (ЦМПМ В-3259) + АР113 (ЦМПМ В-3260) 100 35 30 28 20 100 80 79 76 41 100 64 53 44 31
