Способ получения антибиотика 2188 и штамм плесневого гриба реniсilliuм rugulоsuм ferm вр-142,используемый для получения антибиотика 2188

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано при производстве антибиотиков. Штамм-продуцент антибиотика 2188, поддерживаемый на косом агаре, инокулируют в посевной, а затем в ферментационной среде, содержащей органические источяики азота,источник углерода, минеральные соли и пеногаситель, в условиях аэрации и перемешивания при 24 С. Культуральную жидкость освобождают от мицелия; фильтрат культуральной жидкости экстрагируют этилацетатом. Получеиньй экстракт хромятографируют на колонке с активированным углем и элюируют целевой продукт смесью этилацетата и хлороформа. В элюат добавляют нгексан и кристаллизуют. Для осуществления способа используют штамм плесневого гриба Penicillium rugulosum FERM ВР-142. 2 с.п.ф.-лы. S СО

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (1 1) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3623650/28-13 (22) 22.07.83 (31) 128693/82 (32) 23.07.82 (33) JP (46) 23.08.88. Бюл.9 31 (71) Куреха Кагаку Когио Кабусики

Кайся (JP) (72) Кацухиса Охсуги, Юндзи Итида и Еисаку Такахаси (JP) (53) 615.779.932 (088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ AHTHEHOTHKA

2188 И ШТАММ ПЛЕСНЕВОГО ГРИБА PEMTCILLIUM RUGUL0SUM FERM BP-142, ИСПОЛЬЗУЕМЫИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

2188 (57) Изобретение относится к микробиологической промьппленности и может быть использовано при производстве (э)) 4 С 12 P 1/06 // (С 12 р 1/06, С 12 R 1:80) антибиотиков. Штамм-продуцент антибиотика 2188, поддерживаемый на косом агаре, инокулируют в посевной, а затем в ферментационной среде, содержащей органические источники азота,источник углерода, минеральные соли и пеногаситель, в условиях аэрации и о перемешивания при 24 С. Культуральную жидкость освобождают от мицелия; фильтрат культуральной жидкости экстрагируют этилацетатом. Полученный экстракт хроматографируют на колонке с активированным углем и элюируют целевой продукт смесью этипацетата и хлороформа. В элюат добавляют нгексан и кристаллизуют. Для осуществления способа используют штамм плесневого гриба Penicillium rupulosum

FERM BP-142. 2 с.п.ф.-лы.

1419521

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано в производстве антибиотиков.

Новый антибиотик 2188 представляет собой 3-(6-иэоциано-3,7-диоксатрицикло(4.1.0.0 j гепт-4-илпропеновую кислоту :ледующей формулы

H H CO0H

+ C=C

C=N

Н Н

Антибиотик 2188 получают иэ культуральной жидкости штамма Penicillium

rugulosum FERM BP-142.

Штамм выделен из почвы, депонирован в Институте исследования фермен- 20 тации Агентства промьппленных наук и техники Министерства международной торговли и промышленности в Японии под номером 142 (FERM ВР-142).

Культурально-морфологические приз- 25 наки. Колонии обычно бархатистые при

30 С и шерстистые при 20 С, тусклого желтовато-зеленого цвета, светло-зеленого, светлого серовато-зеленого или зелено-серого в зависимости от типа 30 культуральной среды, темные зеленые конидии, желтый или оранжево-желтый мицелий, обратная сторона колонии— желто-оранжевая или оранжево-красная.

При 37 С рост отсутствует. На ага- 35 ре солодового экстракта рост хороший.

На arape картофельной декстрозы рост хороший. На агаре Сабуро рост хороший. На агаре овсяной муки рост хороший. На глюкозном агаре с сухими 40 дрожжами рост хороший. На мукор-синтетической среде рост ограниченный.

На агаре Чапека рост плохой.

Конидиофоры: растут прямо из стелющихся или вьющихся Гифов и Воздуш 45 ных гифов, 2,5-3,0 х 100-300 мкм, поверхность стенок гладкая или слегка грубая. Пенициллюс (пучок щетинок, кисть): симметрический кольчаторасположенный. Метула: 2,5-3,5х7,5-15 мкм, пучок из 3-6 метул. Фиалида: типично ланцетовидная, 2,0-3,8х7,5-13 мкм, в скоплениях из 2-6 элементов в мутовке. Конидии: эллиптические,2,5-3х3-3,8 мкм, зеленые, гладкие, стенки, спутанные ипи параллельные цепи.

Физиолого-биохимические признаки.

Растет при 10-35 С, оптимум роста при 20-30 С. Утилизирует в качестве источника углерода глюкозу, мальтозу, декстрин, крахмал, лактоэу, сахарозу, глицерин. Утилизирует в качестве источника азота пептон, мясной экстракт, дрожжи, дрожжевой экстракт, соевую муку, муку земляного ореха, отбросы семян хлопка, жидкую кукурузную вытяжку, рисовые отруби, неорганический азот.

Продукт метаболизма штамма — антибиотик 2188 проявляет антибактериальную активность против различных грамположительных и грамотрицательных бактерий, не проявляет острой токсичности по отношению к мышам при внутрибрюшинном введении в количестве

100 мг/кг.

Пример 1. Культура штамма

Penicillium rugulosum FERM BP-142 с косого агара инокулируют в 100 мп среды Беннета (0,1X дрожжевого экстракта, 0 17. говяжьего экстракта, 0,27 N.Z. амина типа-А и 11 глюкозы, рН 7,2) в 300-миллилитровой колбе

Эрленмейера. 50 колб с культураль0 ной средой инкубируют при 248 С в течение 72 ч на вращающемся встряхивателе со скоростью 180 об/мин.

5 л полученной культуры инокулируют в 100 л стерилизованной среды в 200-литровом ферментере при 24 С в течение 60 ч при аэрации со скоростью 50 л/мин и перемешивании при

200 об/мин. Состав питательной среды,X: растворимый крахмал 1,5; глицерин 1,5; отходы семян хлопка 1,0; соевая мука 1,0; дрожжевой экстракт

1,0; KzHP04 0,7; МдБО4 7Н О 0,05;

СоС1 5Н О 0,001; пеногаситель (АДЕКАНОЛ G 126, Асахи Денка Когио

К.К.) 0,1.

Всю культуру (100 л) пропускают через "Шаплес" (тип ГР-U 122-1, Томое

Индижиниринг Ко.) и Делабал (тип

BPP X 309-355-60, Швеция) для удаления осадка мицелия. Прозрачный или чистый плавающий сверху слой доводят до рН 4 с помощью соляной кислоты и экстрагируют пятой частью по объему этилацетата с использованием непрерывнодействующего центробежного устройства для экстракции (тип С1333, фирма Хитачи Лтд). Экстракт концентрируют с помощью конденсатора, и концентрат затем подвергают обратHdA экстракции водным 17-ным раствором бикарбоната натрия. Водную фазу

1419521

55 доводят Io рН 4,0 соляной кислото1 и экстрагируют этилацетатом. Экстракт сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают при температуре менее

40 С под вакуумом для получения сырого (неочищенного) продукта.

Нео пппенный продукт пропускают через KOJIOHKV L BKTHBHpOBBHHbIM углем, помещенным на верхнюю часть колонки (диаметром 4 см и высотой 50 см), заполненной силикагелем (ВАКОГЕЛЬ Q 23, Вако Кемикалэ Ко.), и проявляют смесью этилацетата и хлороформа (1:19 по объему) для элюирования активной 15 фракции, к которой затем добавляют н-гексан. Получают 3 г белого порошка.

Полученный продукт имеет следующие физико-химические свойства. 20

Найдено,Т: С 56,35; H 3,49;

N 7,34; О 32,82 °

С Н1»Oq (моль.м. 193).

Т.пл. 135-136 Г (разложение),удельное вращение (oL)z = -128,8 (с = 1,01 25 в э тилаце тате ) .

УФ-спектр,ф „,„,(метанол): 215 нм (E. =14378).

ИК-спектр (KRr): 3450; 3000; 2150;

1700; 1665; 1425; 1330; 1090; 980; Зр

900; 875.

ЯРМ-спектр (дейтерированный ацетон)

S мд.: 2 55 (дд.,1Н. Г=16, Г = 1,0); 3,05 (д,д., 1Н, Г = 16

Г = 0,5); 3,98 (д. 1Н, Г = 1,0); 4,45 З5 (д. 1Н, Г = 05); 6,11 (д. 1Н, Г

16); 6, 71 (д. 1Н, Г = 16) . СЯМР-спектр(дейтерированньпт метанол) 3, м,д.: 168, 1(с) 1 1 65, 1(с);

141,9(д); 125,8(д); 66,4(д); 66, 1(д); 40

64,9(с); 62,5(с); 36,6(т).

Продукт растворим в метаноле, этаноле, ацетоне, этилацетате, хлороформе и бензоле, нерастворим в гексане и петролейном эфире.

Тонкослойная хроматография с использованием силикагеля: только одно пятно при К =0,62 в смеси хлороформэтилацетат-уксусная кислота (10:10:1);

R =0 44 в смеси хлороформ-этилацетат1 50 уксусная кислота (10:10:0,2); R<=

0,79 в смеси и-бутанол-уксусная кислота — вода (4:1:1).

Реверсивная тонкослойная хроматография с rtn;!n! í КС-18: только одно пятно пр.< R.=O 86 в смеси метанол-воi да (4:1); !,,=0,94 в смеси пропанолнода (4:1).

Пример 2. Пять колб Эрленмейера емкостью по 300 ш, содержащих соответственно 100 мл среды с рН 7,2, которая включает 17 глюкозы, О,lr, дрожжевого экстракта, 0,17 говяжьего экстракта и 0,27. полипептона, стерилизуют под давлением. Споры из культу" ры косого агара плесени инокулируют в среду в колбах и культивируют при

26 С в течение 70 ч при встряхивании со скоростью 180 об/мин. Полученную культуру (500 мл) инокулируют в 15 л стерилизованной среды с рН 7,0 в

30-литровом ферментере и культивируо ют при 26 С в течение 60 ч при аэрировании очищенным воздухом со скоростью 15 л/мин и перемешивании при

300 об/мин. Состав стерилизованной среды следующий, .: нитрат натрия

0,3; К НРО4 0,1; гептагидрат сульфата магния 0,05; хлористый калий

0,05; гептагидрат сульфата железа (II) 0,001; сахароза 3; дрожжевой экстракт 1; пеногаситель (АДЕKAHOJI ZG

109) 0,1.

Полученную в результате культуру фильтруют с использованием в качестве фильтровального средства Целита

545. Фильтрат адсорбируют на колонке диаметром 4 см и высотой 50 см, заполненной смолой Диапон НР 20, промывают водой и элюируют 607-ным метанолом. Элюат кон ентрируют в вакууме о при температуре менее 40 С. Концентрированный материал экстрагируют этилацетатом, и экстракт сушат безводным сульфатом натрия и далее концентрируют под вакуумом при темпера0 туре менее 40 С.

Полученный жидкий материал пропускают через колонку (диаметр 1,5 см, высота 30 см), запо .:енную активированным уг ; . Активную фракцию ко центрируют в вакууме, концентриро ванный материал наносят на колонку (20 х 300 мм) из силикзгеля (КАКОГЕЛЬ С 200) и промь1вают хлороформом.

Колонку проявляют смесью этилацетатхлороформ (1:19 по объему) дпя элюи" рования активной фракции, к которой добавляют н-гексан. Получают 200 мг белого порошка. Полученньп продукт проявляет те же физико-химические и биологические свойства, что и продукт по примеру 1.

Таким образом, использование изобретения позволит получать новый анти1419521 биотик широкого антимикробного спектра действия. о р м у л а изобретения

1. Способ получения антибиотика

2188 общей формулы

Н К СООН

С=М С=С

О О

Н Н

Составитель Г.Смирнова

Техред М.Ходанич Корректор М.Демчик

Редактор В.Петраш

Заказ 4 170/58

Тирам 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 5-35, Раушская наб,, д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Умгород, ул. Проектная, 4

15 заключающийся в том, что штамм Peni—

cillium rugulosum ГЕКИ BP-142 культивируют в питательной среде, содержащей органические источники азота и углерода, минеральные соли и пеногаситель, в условиях аэрации и перемешивания, экстрагируют отделенный фильтрат культуральной мидкости этилацетатом с последующим пропусканием экстракта через колонку с активированным углем, элюированием смесью этилацетата и хлороформа и кристаллизацией целевого продукта в присутствии в элюате н-гексана.

2. Штамм ппесневого гриба Penicillium rugulosum FERM BP-142, используемый для получения антибиотика

2188.