Способ защиты культур echerichia coli от лизиса бактериофагами, рекомбинантная плазмида pil 323, обеспечивающая устойчивость культур e.coli к фаголизису

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии рекомбинантных ДНК, и позволяет защитить культуры E.coli - продуценты белков, гормонов, незаменимых аминокислот и т.п. при крупномасштабных ферментациях от случайных фаговых инфекций, приводящих к лизису клеток и потере целевого продукта. С целью повышения устойчивости культур E.coli к различным бактериофагам проводят трансформацию клеток E.coli рекомбинантными плазмидами, содержащими фрагмент ДНК области иммунитета фага лямбда с интактными генами rex AB, ts 857, мутацией в гене cz и мутацией в структурной части гена cro, обеспечивающий в составе плазмиды повышенную экспрессию генов rex AB фага лямбда по сравнению с лизогенной культурой. Повышенная экспрессия генов rex AB подавляет развитие различных бактериофагов в клетках вплоть до абортивной инфекции. Сконструирована защитная плазмида pIL 323 с репликоном p15A группы несовместимости incY, содержащая Bgl II-фрагмент ДНК области иммунитета фага лямбда. В качестве средств, обеспечивающих повышение устойчивости к колифагам , используются рекомбинантная плазмида pIL R 8 и Bgl II-фрагмент ДНК области иммунитета фага лямбда. 1 з.п.ф-лы, 2 с.п.ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и микробиологической промышленности и представляет собой способ защиты от фаголизиса культур Escherichia coli, ряд объектов для его осуществления. Целью предлагаемого изобретения является повышение устойчивости культур E. coli к различным бактериофагам, в том числе к бактериофагам, обладающим антирестрикционным механизмом. Клетки трансформируют рекомбинантными плазмидами, содержащими Bgl II-фрагмент ДНК области иммунитета фага лямбда, обеспечивающий повышенный уровень экспрессии генов rex AB и вследствие этого устойчивость клеток к колифагам. Для осуществления способа сконструирована рекомбинантная плазмида pIL 323 с областью иммунитета фага лямбда, содержащая репликон плазмиды р15А. В способе применяется рекомбинантная плазмида pIL RV8, содержащая область иммунитета фага лямбда с интактными генами rex AB и генами, кодирующими систему рестрикции-модификации EcoRV, обеспечивающую дополнительную устойчивость к бактериофагам. В рекомбинантных плазмидах, применяемых в способе, используется Bgl II-фрагмент ДНК области иммунитета фага лямбда, который в составе рекомбинантной ДНК определяет повышенную резистентность культур к фаголизису. П р и м е р 1. Конструирование плазмиды pIL 323 из ДНК плазмиды pACУC 184 и ДНК фага лямбда с 1857. Клетки бактерий E.coli К 802, содержащие плазмидную ДНК рАСУС 184, выращивают в 10 мл бульона LB при 37^оС до титра 1х10⁸ кл/мл и выделяют из них плазмидную ДНК по следующему методу. Клетки осаждают центрифугированием (5000 g, 5 мин 4^оС) и ресуспендируют в 0,1 мл лизирующего раствора (лизоцим 2 мкг/мл, трис-НСl25 мМ, рН 8,0, ЭДТА 10 мМ, глюкоза 50 мМ, выдерживают 5 мин при 0^оС. Далее прибавляют 0,2 мл раствора (0,2 М додецилсульфат натрия, 1%) и перемешивают до осветления лизатов. 150 мкл раствора 3 М ацетата калия (рН 4,8) вносят в осветленные лизаты, осторожно перемешивают до заметного снижения вязкости раствора, выдерживают 1 ч при 4^оС и образовавшиеся осадки удаляют центрифугированием (15000 g, 5 мин 4^оС). К полученным супернатантам добавляют 2,5 объема охлажденного при -20^оС этилового спирта и выдерживают 2 ч при -20^оС. Образовавшиеся осадки собирают центрифугированием (1500 g, 5 мин, 120^оС) и суспендируют в 0,2 мл буфера (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА). Полученные препараты ДНК используют для конструирования плазмид. ДНК фага лямбда выделяют по методике, описанной ранее. Конструирование плазмид проводят следующим образом: ДНК плазмиды раСУС 184 и ДНК фага лямбда смешивают в соотношении 1:20 (1 мкг и 20 мкг) в 100 мкл раствора и смесь ДНК (21 мкг) гидролизуют одновременно эндонуклеазами Bgl II и BamHI (по 10 ед соответственно) в растворе, содержащем 50 мМ трис-HCl, рН 7,6; 10 мМ MgCl₂ мМ 2-меркаптоэтанола; 50 мМ NaCl, при 37^оС 1 ч. После прогревания реакционной смеси при 65^оС в течение 10 мин проводят соединения фрагментов ДНК ДНК-лидазой фага Т4 в присутствии АТФ (500 мкм) при 10^оС в течение 8 ч. Смесью образовавшихся молекул ДНК трансформируют клетки E.coli DH 1 следующим образом. 0,1 мл суспензии клеток E.coli вносят в 10 мл питательного бульона и выращивают до титра 3х10⁸ кл/мл. После 10 мин охлаждения (0^оС) клетки собирают центрифугированием (15000 g, 10 мин, 0^оС), суспендируют в 10 мл 0,1 М раствора CaCl₂ и выдерживают при 0^оС 1 ч. Клетки повторно центрифугируют (5000 g, 10 мин, 0^оС), затем суспендируют в 0,5 мл 0,1 М CaCl₂ (0^oC) и используют для трансформации. Смесь соединенных фрагментов ДНК инкубируют с компонентными (обработанными CaCl₂) клетками 1 ч при 0^оС и 10 мин при комнатной температуре. После десятикратного разбавления бульоном LB клетки подращивают 2 ч и высевают на агаризованную среду LB, содержащую 30 мкг/мл хлорамфеникола, устойчивость к которому определяют векторная плазмида рАСУС 184. Выросшие трансформанты проверяют в spot-тесте на наличие иммунитета к фагу λ 126 и на чувствительность к тетрациклину, так как вставка чужеродного фрагмента в Bam HI-сайт рАСУС 184 приводит к инактивации гена, определяющего устойчивость к тетрациклину. Из клеток клонов, резистентных к хлорамфениколу, иммунных к фагу лямбда с126 и чувствительных к тетрациклину, выделяют ДНК по описанной выше методике и анализируют с помощью эндонуклеазы рестрикции Hind II. Этот анализ позволяет определить, что фрагмент Bg1 II (2,392 пар оснований) встроился в обеих ориентациях. Вариант плазмиды, в которой направления тетрациклинового промотора и промотора фага лямбда Pr противоположны, был назван pIL 323. П р и м е р 2. Способ защиты клеток E.coli В 834 от фаговой инфекции. Клетки E.coli В 834 выращивают в 10 мл мясопептонного бульона (МПБ) до плотности 4х10⁸ кл/мл, осаждают центрифугированием 10 мин при 0^оС (К-23, 6000 об/мин), промывают дважды 20 мл холодного раствора, содержащего трис-HCl 0,01 М, рН 7,7; CaCl₂ 0,1М, ресуспендируют в 10 мл этого раствора и выдерживают 20 мин в ледяной бане, ресуспендируют в 1 мл раствора. К 0,3 мл суспензии клеток добавляют 20 мкл раствора ДНК плазмиды pIL 323 с концентрацией 50 мкг/мл, инкубируют 50 мин при 0^оС, 5 мин при 42^оС, добавляют два объема среды LB, выдерживают 30 мин при 37^оС и высевают на агар LB, содержащий 30 мкг/мл хлорамфеникола. Выросшие клоны отбирают и определяют им устойчивость к бактериофагам. А. Бактериофаг Т5⁺, выращенный на культуре E.coli В 834, высевают на газон культуры E.coli В 834, трансформированной плазмидой pIL 323. К 2 мл мягкого агара. приготовленного на среде LB с добавкой 10 мМ CaCl₂, добавляют при 37^оС 1 х 10⁸ свежих клеток в 0,2 мл среды и по 10² частиц фага Т5⁺ на первые две чашки, по 10^4- на вторые две чашки и по 10^7- на третьи две чашки. Для контроля фаг Т5 высевают аналогично на чашки с газоном культуры E. coli В 834 без плазмиды. Чашки инкубируют при 37^оС 16 ч и определяют эффективность высева фага в опытных чашках и контрольных. На газоне в опытных чашках не видно негативных колоний фага Т5. Трансформированные клетки устойчивы к фагу Т5. По аналогичной схеме проверяют культуру E.coli В 834, трансформированную плазмидой рIL 323 на устойчивость к бактериофагам Т4, Т7, Т3, ⊘ 80 , Р2 и λ_imm 434. В результате проведенного анализа показано, что плазмида pIL 323 обеспечивает полную устойчивость к фагам ⊘ 80 , Р22, Т4, Т5, частичную к фагам Т3 и Т7 (размер негативных колоний на чашках уменьшается с 10 мм (контроль) до 1 мм (опыт) и не обеспечивает устойчивости к фагу лямбда i 434 (см. табл. 1). Б. Зависимость устойчивости клеток E.coli В 834/pIL 323 к бактериофагам от температуры культивирования. Способ осуществляют аналогично примеру 2, используя клетки E.coli В 834, трансформированные плазмидой pIL 323, чашки с высеянным фагом Т5 инкубируют при температуре 26, 32 и 38^оС. При 26^оС культура E.coli частично устойчива к фагу Т5. На газоне опытных чашек - мелкие негативные колонии фага в количестве около 10% от числа колоний в контрольных чашках с культурой E.coli В 834, не содержащей плазмиды pIL 323. При 32^оС культура E.coli частично устойчива к фагу Т5. На газоне опытных чашек видны очень мелкие колонии фага (около 0,1% от числа колоний на контрольных чашках). При 38^оС культура E.coli устойчива к фагу т/5. На газонах опытных чашек не видно колоний фага т5. При анализе зависимости устойчивости клеток E.coli В 834 pIL 323 к бактериофагу Т4 от температуры культивирования показано, что по сравнению с контрольными чашками при 26^оС на газоне опытных чашек наблюдают 10% мелких фаговых колоний, при 32^оС около 3% очень мелких, при 38^оС колонии не видны. В. Определение устойчивости клеток E.coli В 834/pIL 323 к бактериофагам при культивировании в жидкой среде. К культуре клеток E.coli В 834, трансформированных плазмидой pIL 323, с плотностью 5х10⁷ кл/мл в МПБ добавляют фаг Т5⁺ с множественностью 0,3 и инкубируют при 37^оС в условиях интенсивной аэрации 5 ч. За это время культура выходит в стационарную фазу, лизиса культуры не наблюдают так как клетки устойчивы к бактериофагу Т5. Аналогично проводят определение устойчивости клеток E.coli к фагам Т4, Т3, Т7, ⊘ 80 . Р22, λ_imm 434. В случае фагов Т4. ⊘ 80 и Р22 лизиса не наблюдают, так как клетки устойчивы к перечисленным бактериофагам. В случае фагов Т3 и Т7 лизис культуры E.coli В 834, трансформированной плазмидой pIL 323, наступает значительно позднее, чем лизис незащищенной плазмидой культуры E.coli В 834, из-за частичной устойчивости клеток. В случае фага λ_imm 434 наблюдают обычный лизис культуры. П р и м е р 3. Трансформацию клеток E.coli С 600 плазмидой pIL 323 проводят аналогично трансформации клеток E.coli В 834, как описано в примере 2. А. Определение устойчивости клеток E.coli С 600/pIL 323 к бактериофагам на агаризированной среде проводят, как описано в примере 2. пункт А. В результате анализа показано, что клетки E.coli C 600/pIL 323 устойчивы к фагам Т4 и Р22, частично устойчивы к фагам Т3 и Т7,к фагу λ_imm 434 клетки не устойчивы. Чувствительность клеток С 600/pIL 323 к бактериофагам Т5 и ⊘ 80 не анализировали, так как клетки E.coli С 600 устойчивы к этим фагам за счет ton A мутации. Б. зависимости устойчивости клеток E.coli С 600/pIL 323 к бактериофагам Т4, Т7 и Р22 от температуры культивирования, проводимой, как описано в примере 2, пункт Б показано, что 37^оС является оптимальной температурой культивирования, при которой клетки E.coli C 600/pIL 323 наиболее устойчивы к бактериофагам Т4, Т3, Т7 и Р22. В. При определении устойчивости клеток E.coli С 600/pIL 323 к фаговой инфекции в жидкой среде, которая определялась, как описано в примере 2, пункт В, показано, что культура устойчива к бактериофагам Р22, Т4, частично устойчива к фагам Т3 и Т7 и не устойчива к фагу λ_imm434. П р и м е р 4. Способ осуществляют аналогично способу, описанному в примере 2, используя вместо клеток E.coli В 834 клетки E.coli C. Проведенный анализ позволяет заключить, что культура E.coli C/pIL 323 устойчива к бактериофагам Т4, Т22, Т5, ⊘ 80 , частично устойчива к фагам Т7 и Т3 и чувствительна к бактериофагу λ_imm 434 при культивировании на агаризованной среде, а также и в жидкой среде. П р и м е р 5. Способ осуществляют аналогично способу, описанному в примере 2, используя вместо плазмиды pIL 323 плазмиду pIL RV8. А. Проведенный анализ позволяет заключить, что культура E.coli В 834/pIL RV8 устойчива ко всем используемым в данной работе бактериофагам, в том числе и к λ_imm 434 и к Т3, и частично устойчива к Т7 (менее 50% мелких колоний с диаметром около 1 мм). Ограничение фагов Т3 и λ_imm 434 определяется наличием в плазмиде генов системы рестрикции-модификации EcoRV и присутствием сайтов, узнаваемых этой эндонуклеазой, на ДНК этих бактериофагов. Фаг Т3 ограничивается активностью генов rex AB фага лямбда и системой рестрикции EcoRV, фаг Т7, который не имеет на своей ДНК сайтов EcoRV, только активностью генов rex AB, а фаг λ_imm 434 ограничивается только активностью гена, кодирующего эндонуклеазу рестрикции EcoRV. Б. Зависимость устойчивости культур E.coli В 834/pIL RV8 к бактериофагам от температуры определяли, как описано в примере 2, пункт Б. Показано, что при 26^оС на агаризованной среде падение титра фага Т5 оставляет около 90%, при 32^оС падение титра достигает 99,9%, при 38^оС культура полностью устойчива к фагу Т5. В. Определение устойчивости клеток E.coli D 834/pIL RV8 к бактериофагам в жидкой среде проводят, как описано в примере 2 пункт В. Показано, что клетки E.coli B 834/pIL RV8 устойчивы к фагам Т4, Т5, Т3, ⊘ 80 , λ_imm 434, Р22. Г. Определение урожая фага Т5. Клетки E. coli B 834/pIL RV8 выращивают в 10 мл МПБ до плотности 3х10⁸ кл/мл, осаждают центрифугированием (6000g, 2^oC 10 мин) и ресуспендируют в 1 мл МПБ. В суспензию клеток добавляют фаг Т5 с множ. 0,5-0,8 и проводят адсорбцию фага 10 мин при 10^оС. В этих условиях на клетках адсорбируется свыше 90% всего фага (в среднем 95%). Затем быстро делают разведения клеток в 10⁶ раз в пробирках с холодным МПБ (10^оС) так, чтобы в последней пробирке было 3х103 кл/мл. Из этой пробирки отбирают аликвоты по 0,1 мл для титрования фага (титр 1) на газоне E.coli В 834 при 37^оС, затем содержимое пробирки делят пополам, нагревают на водяной бане одну пробу до 30^оС, вторую - до 37^оС и инкубируют пробы при указанной температуре и усиленной аэрации 1,5 ч. Затем отбирают аликвоты по 0,1 мл из проб для второго титрования (титр 2). Титр 1 равен сумме инфицированных клеток, дающих фаговое потомство, и неадсорбированных инфекционных фаговых частиц. Титр 2 соответствует урожаю фага из инфицированных клеток. Отношение титр 2/титр 1 приближенно характеризует выход фага на 1 клетку. Результаты одного из трех независимых опытов представлены в табл. 2, в которой приведены также данные, полученные при анализе урожая фагов Т4 и Т7, а также при анализе урожая фагов Т5, Т4 и Т7, выросших на культуре E.coli В 834 без плазмиды и с плазмидой pIL 203, которая содержит область иммунитета фага лямбда с интактными генами rex AB и мутантными генами репрессоров с 1857 и croam6. Из данных табл. 2 следуют выводы. 1. В клетках E.coli B 834, трансформированных плазмидами с повышенной активностью генов rex AВ, выход фагового потомства значительно ниже, чем в бесплазмидных клетках. 2. При повышении температуры культивирования с 30 до 37^оС выход фага из клеток E.coli В 834, трансформированных плазмидами pIL 203, pIL RV8, значительно снижается. 3. При инфицировании клеток E.coli B 834, трансформированных плазмидой pIL RV8, фагами Т4 или Т5 при 37^оС инфицированные клетки не дают фагового потомства, т.е. инфекция в этих условиях протекает абортивно. 4. Плазмида pIL RV8 сильнее подавляет рост фагов по сравнению с pIL 203, что возможно объясняется слабой супрессией мутации am 6 гена cro в штамме E.coli B 834. П р и м е р 6. Способ осуществляют аналогично способу, описанному в примере 5, используя вместо клеток E.coli B 834 клетки E.coli с 600. Проведенный анализ позволяет заключить, что клетки E.coli C600/pIL RV8 устойчивы к бактериофагам Т4, Т5, ⊘ 80 , Т3, Р22, λ_imm 434, к фагу Т7 наблюдают частичную устойчивость при выращивании культур на агаризованной и жидких средах. Урожай бактериофагов Т5, Т4 и Т7 падает соответственно в 100, 1000 и 10 раз. П р и м е р 7. Способ осуществляют аналогично способу, описанному в примере 5, используя вместо клеток E.coli В 834 клетки E.coli C. Приведенный анализ позволяет заключить, что культура E.coli C/pIL RV8 устойчива ко всем используемым бактериофагам, кроме фага Т7 при культивировании как в жидкой среде, так и на агаризованной сpеде. К фагу Т7 наблюдают частичную устойчивость. Эффективность защиты от фаголизиса зависит от температуры, оптимальная температура для осуществления способа 37-38^оС. Урожай бактериофагов при росте на культуре E.coli C/pIL RV8 резко понижен по сpавнению с урожаем при росте на бесплазмидном штамме. П р и м е p 8. Способ осуществляют аналогично способу, описанному в примере 2, используя вместо плазмиды pIL 323 плазмиду pFRD 35. Трансформацию клеток E.coli В 834 плазмидой pFR 35 проводят, как описано в примере 2. Селективная среда содержит 20 мкг/кг ампициллина. Плазмида pFR 35 размером 7,85 т.п.о. содержит BamHI-фрагмент ДНК рВR 322, BgL II-фрагмент ДНК области иммунитета фага лямбда с 1857 размером 2,39 т.п.о., Hind III-фрагмент ДНК фага Т4 размером 1,1 т.п.о с геном frd, кодирующим дигидрофолатредуктазу, которая определяют устойчивость клеток к триметаприму, ген беталактамазы, определяющий устойчивость клеток к ампициллину, репликон pMBI. Направление транскрипции с промторов Pr и Pfrd конвергентно. Проведенный анализ показал, что клетки E.coli B 834 достаточно устойчивы при температуре 37^оС к бактериофагам Т5, Т4, ⊘ 80 и Р22, частично устойчивы к фагам Т7 и Т3 при росте как в жидкой, так и на твердой среде при наличии в клетках плазмиды PFRL 35. П р и м е р 9. Способ осуществляют аналогично способу, описанному в примере 2, используя вместо плазмиды pIL 323 плазмиду pIL 203. Проведенный анализ показал, что эта плазмида повышает устойчивость клеток к фаговой инфекции. Урожай фагов при росте на E.coli В 834/pIL 203 при 37^оС в среднем приблизительно в 100 раз ниже урожая при росте на бесплазмидном штамме в случае фагов Т4 и Т5 и в 10-20 раз ниже в случае фага Т7 (см. табл. 2).

Формула изобретения

1. Способ защиты культур Escherichia coli от лизиса бактериофагами, включающий трансформацию клеток E.coli рекомбинантными плазмидами и культивирование клеток, отличающийся тем, что, с целью повышения устойчивости культур E. coli к различным колифагам, клетки E.coli трансформируют рекомбинантными плазмидами, содержащими Bgl II-фрагмент ДНК области иммунитета фага лямбда с интактными генами rex AB, ts 857, мутацией в гене cI и мутацией в структурной части гена cro и отбирают для последующего культивирования целевые клоны по способности к росту на селективных средах. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетки E.coli трансформируют рекомбинантными плазмидами, содержащими фрагмент ДНК области иммунитета фага лямбда с интактными генами rex AB, ts 857 мутацией в гене cI и мутацией в структурной части гена cro и ген, обеспечивающий синтез целевого продукта. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетки E.coli, содержащие плазмиды, обеспечивающие синтез целевого продукта, трансформируют плазмидами, содержащими репликон плазмиды другой группы несовместимости. 4. Рекомбинантная плазмида pIL 323, обеспечивающая устойчивость клеток к фаголизису, размером 6.4 т.п.н., содержащая - Bgl II-фрагмент ДНК области иммунитета фага лямбда, ограниченной сайтами Bgl II с координатами на ДНК фага лямбда 35711 и 38103 п.н., - Bam HI-фрагмент плазмиды pACYC 184, - уникальные сайты рестрикации EcoRI, EcoRV, SalI, ClaI, - четыре сайта для Hind III, разделяющие плазмиду на фрагменты 125, 564, 990, 4700 п.н., - гены rex AB фага лямбда, - ген Cl с термочувствительной мутацией 857, - генетический маркер - ген хромфениколацетилтрансферазы, определяющий резистентность к хлорамфениколу, - репликон p15A со строгим контролем группы несовместимости.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2