Способ получения носителей для твердофазного синтеза олигонуклеотидов

 

Изобретение относится к химии полимеров и позволяет получать носители для твердофазного синтеза олигонуклеотидов, содержащие 0,310 - 0,450 ммоль иммобилизованного нуклеозида на Г г носителя. Носители получают последовательной обработкой кремнезема 5-16%-ным водным раствором D-маннита, -2%-ным раствором эпоксидной смолы ДЭГ-1 в диоксане и нуклеозидом, 1 табл. (Л 4 00 ;о

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (И>

А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4097252/23-05 (22) 11.05.86 (46) 23.11.88. Бюл. N 43 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии (72) С. И. Ястребов, Ю. А. Горбунов, А. И. Ломакин, Н. Н. Карпышев и С. Г. Попов (53) 678.837.13(088.8) (56) Koster Н., Burnat J., Manus J.Ìñ., et а1 Polymer support oligonucleotide

synthesis — XIV. Synthesis of oligodeoxynucleotides on controlled pore

glass (CPG) using phosphate and à nev

phoshite triester approach..- Tetrahedron, 1984, V. 40, II 1, р. 103-112.

Minganti С., Ganesh К. N. et al.

Comparison of controlled роге glass

and KieseIguhrpolidimethy lacrylamide

as supports for solid-phase synthesis

of 23-residue oligodeoxyribonucleotides in milligram amounts, — Biochem, 1985, v. 147, р. 63-74. (gI) 4 С 07 Н 21/00 //С 12 N 11/14 (54) СПОСОВ ПОЛУ 1ЕНИЯ НОСИТЕЛЕЙ

ТВЕРДОФАЗНОГО СИНТЕЗА ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ (57) Изобретение относится к химии полимеров и позволяет получать носители для твердофазного синтеза олигонуклеотидов, содержащие 0,310—

0,450 ммоль иммобилизованного нуклеозида на I г носителя ° Носители получают последовательной обработкой кремнезема 5-16Х-ным водным раствором D-маннита, 1-2Х-ным раствором эпоксидной смолы ДЭГ-1 в диоксане и нуклеозидом. 1 табл.

1439108

Изобретение относится к химии полимерон, а именно к способу получения носителей для твердофазного синтеза олигонуклеотидов и может быть исполь5 зовано в биоорганической химии и био-технологии для синтеза олигонуклеотидов как в ручном, так и в автоматическом режиме.

Целью изобретения является поны- 10 шение количества иммобилизуемого нуклеозида.

Пример 1. К 1 r пористого стекла СРС-10 (удельная поверхность о

17 м /г, диаметр пор 2200 А, размер частиц 120-20 мк) добавляют 30 мл концентрированной азотной кислоты, ныдер>кивают 2-3 ч, отмывают водой до нейтрального рН. Затем добавляют

10 мл 10%-ного водного раствора П вЂ” 20 маннита (ч.д.а.), дегазируют, перемешивают в течение 1 ч, дважды опынают на пористом стеклянном фильтре 10 мл воды и трижды 10 мл диоксана.

Далее добавляют 20 мл диоксана, 25

0,2 мл C4Hqp 0 ° BFg (w), перемешивают

5 мин дооанляют О, 2 MJI эпоксидной смолы ДЭГ-1 (динамическая вязкость не более 15-30 сП, мол.масса 240

260, содержание эпоксидной группы 30 >24%) и интенсивно перемешивают н течение 40 мин при комнатной температуре, затем отмывают диоксаном„ водой, пиридином. К О,1 г обработанного таким образом стекла добавляют

О 1 ммоль 5 -о-диметокситритил-NЭ

-изо-бутирилгуанозина-3 -о-сукцината (DNTrGiBu), 0,3 ммоль TPSCT, 0,9 ммоль

NeIm и 0,2 мл абс. пиридина, осторож но перемешивают н течение i ч. После 10 этого носитель промывают пиридином, хлороформбм, ацетоном и сушат, Емкость по нуклеозиду (количество иммобилизованного нуклеотида) на носителе определяют спектрофотометриче- 45 ски по диметокситритилкарбинолу (ЭИТгОН) после снятия с носителя диметокситритильной группы обработкой раствором хлорной кислоты и этилоном спирте (3:? V/V) при,цлине волны

499 нм, коэффициент экстинции DMTrOH

71,7 ммоль см

Расчет содержания нуклеозида на носителе проводят по формуле 55

П ю

1000 Е ш 1 где С вЂ” содержание нуклеозида — содержание диметокситритильной группы на носителе, ммоль/г;

D — - общая оптическая плотность элюата с И1ТгОН;

V — - объем элюата, мл;

Š— коэффициент экстинции DNTrOH при 499 нм;

m — навеска носителя, г;

1 — 1 см — длина оптического пути кюветы, н которой измеряют оптическую плотность.

Определение содержания нуклеозида на полученном чосителе. К 0,01 r носителя, содержащего DNTrGiBu-группы, добавляют 2 мл.раствора хлорной кислоты в этаноле, раствор приобретает оранжевый цвет, выдерживают 1-2 мин, отфильтровывают, операцию повторяют.

Элюаты объединяют и измеряют оптическу>о плотность на спектрофотометре:

D = 55 56, V = 4 мл, m = 0,01, содержание нуклеозида С = 0 310 ммоль/г.

Пример 2. К 0,1 г СРС 10, обработанному В-маннитом и ДЭГ-1, к как описано н примере 1, добавляют

О, 1 мысль 5 -о-диметокситритилтимиt дин-3 -о-сукцината, 0.3 ммоль ТРSС1, 0,9 жюль NeIm, 0,2 мл абс. пиридина, осторо>кно перемешивают в течение

1 ч. Затем промывают пиридином, хлороформом, ацетоном н сушат. Содержание нуклеозида определяют как н примере 1. D = 80,66, m = 0,01 r, V = 4 мл, С = 0,450 ммоль/г.

Пример 3. К 1 r пористого стекла МПС 2000 (S» -- 15 20 мг/г9

d = 2000 А, й„, = .00-300 мк), оор прибавляют 10 мл 5%-ного раствора

D-маннита, дегазируют и перемешивают в течение l ч. Дальнейшую обработку проводят, как в примере 1. Содержание нуклеозида на носителе определяют как в примере 1, D = 54,85, V = 4 мл, m = 001 г, С вЂ” 0,306 ммоль/г.

Пример 4. 1 r пористого стекла NIIC 2000 обрабатывают аналогично примеру 1, только вместо 10%ного раствора D-маннита берут 16%-ный раствор. Содержание нуклеозида определяют как н примере 1. D = 75,46, V -= -4 мл, m -=-0,,01 г, С = 0,421 ммоль/г.

1I р и м е р 5. 1 г пористого стекла CPG 10 обрабатывают аналогично примеру 1, только вместо 0„2 мл

ДЭГ-1 добавляют 0,4 мл эпоксидной

d пор, А

$,д, мlг количество иммобилиаоааниого .нуклеоеила, юдоль/г

Обработка

Матрица

Пример

О-маинит, Колнчестно и ДЭГ-I, мг/г носителя

CPG 10

0,310 ao DHTrGIBu

0,450 ло ЖттТ

0,306 ло 2812 GlBu

2200

0,2.и

0,2

15-20

1800-2600

МПС 2000

0,421

0,2

0,352

l0

0,4

2200

CrG 1O

6 (коитрольный) 1800-2600

0 126

ИПС 2000

15-20

0,2

0,150

0,1

10!

2200

7, (контрольный) 0,003

0,4

15-25

8 (контрольный) 1300

Силохром ..С 2О МК

9 (иевестный) Kuselquhr 2000-3000 15-20 Пептид Полялиметил- 0,08 - 0> 2 акр ил амин

Подписное

Тираж 348

ВНИИПИ Заказ 6038/24

Произв.-полигр. пр-тие, r. Ужгород, ул. Проектная, з 14 смолы. Содержание нуклеозида на носителе составляет 0,352 ммоль/г.

Пример 6 (контрольный).

1 г пористого стекла MIIC 2000 обрабатывают аналогично примеру 1, только вместо 10K-ного. раствора D-маннита берут 2Х-ный раствор. Содержание нуклеозида, определенного аналогично примеру 1; 0,126 ммоль/г.

Пример 7 (контрольный). l г пористого стекла CPG 10 обрабатывают аналогично примеру 1, только вместо

0,2 мл ДЭГ-1 берут 0,1 мл эпоксидной смолы. Содержание нуклеозида

0,150 ммоль/г.

Пример 8. 1 r силохрома

С-20 ($ = 15-25 мг/г, dïîp

1300 А, d„„, 315-500 мк) обрабатывают азотной кислотой, отмывают водой до нейтрального рН как в примере 1, затем промывают диоксаном, добавляют 20 мл диоксана, 0,2 мл эфирата трехфтористого бора, перемешивают

5 мин, добавляют 0,4 мл ДЭГ-1, интенсивно перемешивают 40 мин при комнатной температуре, затем отмывают диоксаном, водой, пиридином. К обработанному таким образом кремнезему (0,1) присоединяют нуклеозид аналогично описанному в примере 1. Содержание нуклеозида 0,003 ммоль/г.

39) 08

На носителе, полученном в примере 2, синтезируют октадекадезоксирибонуклеотид d (AAAATACTCCATCACCCT) фосфотриэфирным методом. Средний выход на стадию ло DMTrOH 847., а общий выход после хроматографического выделения 1,20Х от теоретического..На носителе, полученном в примере 2, ð синтезируют октадезоксирибонуклеотид

d (СССССТАС) фссфитным методом. Средний выход на стадию по DMTrOH 907, а общий выход после хроматографического выделения 20% от теоретического.

15 Характеристики предлагаемых и известных носителей приведены в таблице.

Формула изобретения °

Способ получения носителей для твердофазного синтеза олигонуклеотидов, включающий обработку кремнезема полимером и нуклеозидом, о т л и— ч а ю ш и и с я тем, что, с целью повышения количества иммобилизуемого нуклеозида, кремнезем перед нанесением нуклеозида предварительно обрабатывают 5-167-ным водным раствором

30 D-маннита и 1-27-ным раствором в диоксане эпоксидной смолы на основе полиола и эпихлоргидрина в присутствии трехфтористого бора..