Способ получения полиадениловой и полиинозиновой кислот

 

Использование: в химической промышленности. Сущность изобретения: в качестве субстрата используют смесь АМФ и АТФ в молярном соотношении (0,9-1,3):1, при этом в него дополнительно вводят ферментативный комплекс из клеток штамма МРЕ 600, содержащий аденилаткиназу и ацетаткиназу, а ферментативную реакцию ведут при температуре 12-15°С и пЕ 7,3-7,5.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЦЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4238461/28-13 (22) 28.04,87 (46) 07.04.89. Бюл. Ф 13 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ (72) В,П.Гурьев и В,Ф.Подгорный (53) 663.15 (088.8) (56) Smite Е.А.; Eglais V ° О,, Ruklisa M.P., Viesturs U E. Biosynthesis of Polyribonuclectide phosphorylase and Polyribonucleotides

Sy Е.coli. — Acta Biotechnologica.

1982, 2,4,359368.

Авторское свидетельство СССР

У 744004, кл. С 07 Н 21/00, 1980, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИАДВНИЛОВОЙ И ПОЛИИНОЗИНОВОЙ КИСЛОТ (57) Изобретение относится к биохи- мии и биотехнологии и может быть использовано для получения полиадениловой и полиинозиновой кислот, широко

Изобретение относится к биотехнологии и касается ферментативного синтеза высокополимерных гомополирибонуклеотидов и может быть использовано в медицине, генетике и молекулярной биологии.

Целью изобретения является снижение себестоимости и улучшение качества за счет повышения биологической активности целевых продуктов.

Способ заключается в том,: что

I используют смесь аденозин-5 -моноI фосфата (АИФ) и аденозин-5 -трифос(19) 3 (ш 1 (Ю 4 С 07 Н 21/00//С 12 Р 19/34 применяемых в медицине, генетике и молекулярной биологии. Целью изобретения является снижение себестоимости и улучшение качества за счет повышения биологической активности целевых продуктов. Изобретение заключается н реакции поликонденсации

I смеси аденозин-5 -монофосфата и

1 аденозин-5 -трифосфата н молярном соотношении (О, 9-1, 3): 1 полинуклеотидфосфорилазой н присутствии ферментной фракции клеток E.cali, ацетилфосфата, ионов магния и буфера трис-НС1 рН 7,3-7,5, при температуО ре 12-15 С с последующим отделением белка смесью хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 2,5:1 и выделением целевого продукта трехкратным переосаждением калиевой соли полинуклеотида одним объемом этанола из буферного раствора фосфата калия. фата (АТФ) в молярном соотношении (0,9-1,3):1, при этом процесс проводят в присутствии ферментной фракции Е.coli содержащей аценилаткиназу и ацетаткиназу при температуре

12-15 С, рН 7,5-7,3. Выделение целевого продукта осуществляют преимущественно трехкратным переосаждением калиевой соли полинуклеотида одним объемом этанола из буферного раствора фосфата калия, что позволяет упростить процесс выделения полиадениловой кислоты (поли-А) за счет сок1470738 ращения числа стадий с 5 и до 3 и уменьшить трудоемкость способа. Остановку реакции осуществляют преиму.— щественно добавлением в реакционную смесь хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 2,5:1, что позволяет сохранить. высокую полимерность образовавшегося полинуклеотида, тем самым повысить качество целевого про- 10 дукта.

Предлагаемый способ получения высокомолекулярных поли-А и полиинозиновой кислот (поли-И) заключается в следующем. Готовят реакционную 15 смесь, содержащую АМФ и АТФ в молярном соотношении (0,9-1,3):1, я также ионы магния, буфер трис-НС1 рН

7,3-7,5, ацетилфосфат, ферментную фракцию E.cali и полинуклеотидфосфорилазу (ПНФазу). Реакцию проводят при 12-15 С. Остановку реакции ocyd ществляют преимущественно добавлением смеси хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 2,5:1. Выделение 25 готового продукта осуществляют трехкратным осаждением калиевой соли одним объемом зтанола из буферного раствора фосфата калия. Для получения поли-.И полиадениловую кислоту, содержа-30 щуюся в реакционной смеси, подвергают дезаминированию известным способом.

Непрореагировавшие мономеры АМФ и

АТФ после регенерации (отделения неорганического фосфятя), например, на смоле АВ17 2 могут быть вновь использованы для синтеза поли-А).

В результате получают препарат поли-А с мол.массой 200-250 тыс.Дальтон (коэффициент седиментации 40

14,8+0,3 S) общий выход полинуклеотида составляет 5б-58%.

Известно использование ферментных фракций Е,coli для синтеза различных компонентов нуклеиновых кис- 45 лот, однако в предлагаемом способе ферментная фракция используется по другому функциональному назначению, а именно для осуществления сопряженных ферментативных фракций, ведущих к образованию поли-А из смеси

АХФ и АТФ, что позволяет получить новый неочевидный положительный эфУ фект, заключающийся в повышении степени поликонденсации и, следователь- . но, к повышению молярной массы целе55 вого продукта.

Пример 1. Приготовление фермгнтной фракции E со1 . 10 r клеток E.coli MR E600 суспендируют в 45 мл буфера А (0,05 моль/л трис-НСl рН 7,5, 2 ммоль/л ДТТ, 0,1 ммоль/л ЭДТА) и добавляют 20 мг лизоцима, растворенного в 1,5 мл буфера А. Смесь пе-, ремешивают 45 мин при 4+2 С и клетки разрушают в течение 3 мин с помощью ультразвукового дезинтегратора. Затем в смесь добавляют 2,5 мл 20%ного раствора декстрана (мол.масса=

=500 тыс.) и 5 мл 40%-ного раствора полиэтиленгликоля (мол.масса = 6 тыс.) смесь перемешивают 20 мин и центрифугируют в течение 15 мин при

3 тыс.об/мин. Верхнюю фазу сливают и замеряют концентрацию белка спектрофотометрическим методом. Обычно концентрация белка составляет

14 мг/мл. Выход ферментной фракции

50 мл или 700 мг белка. Этого количества достаточно для получения

370 г поли-А.

Получение поли-A. Готовят реакционную смесь, содержащую 1,3 ммоль

АМФ, 1,2 ммоль АТФ (соотношение

1,08:1) . 0,02 моль трис-НС1 рН 7,4, 0,05 ммоль ацетилфосфятя, 1 ммоль хлористого мягния, 20 мг азида натрия, 50 мкл ферментной фракции (приготовленной кяк описано выше) н

0,5 мл препарата ПНФазы (150 ед.акт ° )

Добавляют дистиллированную воду до объема 100 мл и смесь инкубнруют при

14 С, Степень превращения мономеров в полинуклеотид контролируют гельфильтрацией на колонке с сефарозой

4В. При достижении максимального превращения реакцию останавливают добавлением смеси хлороформа с иэоамиловым спиртом.в соотношении 2,5:1 и интенсивно перемешивают в течение

30 мин. После центрнфугирования смеси и отделения водного слоя к нему добавляют 1 моль/л калийфосфатного буфера до конечной концентрации

0,1 мбль/л и поли-А высаживают одним объемом охлажденного этанола. Переосяждение калиевой соли поли-A из калийфосфятног0 буфера повторяют дважды, затем поли-А растворяют в воде и лнофильно высушивают. Выход составляет 1,1 мысль включенных в полинуклеотид (поли-А) мономеров или

480 мг. Спиртовый супернатянт> содержащий непрореягировавшне мономеры, упаривяют ня ротационном испярителе и регенерир ют на колонке ео

0738 ровавших мономеров и растворяют в

10 мл буфера 0,1 моль/л трис-НС1 и рН 7,5, содержащего 1 ммоль/л хлористого магния и 1 ммоль/л ЭДТА, и добавляют 1,2 мл ледяной уксусной кислоты. При непрерывном перемешивании небольшими порциями в течение 23 ч прибавляют 1,2 r сухого нитрита натрия, Перемешивание продолжают до достижения отношения оптических плотностей D /D 1,6-1,7. После чего смесь охлаждают до температуры о (0-2) С, добавляют 1 моль/л фосфата калия рН 7,0 и полинуклеотид осаждают одним объемом спирта (этанола).

Дважды переосаждают поли-И из буферного раствора фосфата калия одним объемом этанола. В результате получают 1,39 ммоль поли-И с молярной массой. 200-260 тыс.Дальтон, 5

Формула изобретения

Составитель В. Варламов

Техред Л.Сердюкова

Корректор 0 ° Кравцова

Редактор Н.Гунько

Заказ 1434/27

Тираж 339

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета .по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

5 147 смолой АВ17 2, Получают смесь АТФ, АДФ, АМФ и после добавления ЛМФ (обычно 0,4 ммоль) до первоначального соотношения ЛМФ:АТФ, соответственно, 1,08:1 вновь используют в реакции биосинтеза поли-А. Дополнительно получают 0,64 ммоль поли-А. Общий выход поли-А составляет 58Х к исходным мономерам ° Молярная масса поли-А 200-250 тыс. Дальтон, Коэф Э фициент седиментации равен 14,8+0,3S.

Пример 2. Готовят реакционную смесь аналогично примеру 1 за исключением того, что исходные мономеры АМФ и ЛТФ берут в соотношении

0,9:1, а реакцию проводят при 12 С, при рН 7,3. В результате получают

1,730 ммоль поли-А (выход 567) с молярной массой 200-250 тыс.Дальтон.

Пример 3. Поли-А получают из смеси АМФ и АТФ аналогично приме. ру 1 за исключением того, что исходные АМФ и ЛТФ берут в соотношении

1,3:1, а реакцию проводят при 15 С и при рН 7,5. В результате получают

1,733 ммоль поли-А (выход 577) с молярной массой 200-240 тыс. Дальтон.

Пример 4. Поли-А получают аналогично примеру 1 за исключением того, что исходные ЛМФ и АТФ берут в соотношении 0,8:1, а реакцию прово. дят при 8 С, при рН 7,0. В результате получают 1,470 ммоль поли-А (выход 49Е) с молярной массой 150200 тыс. Дальтон.

Пример 5. Поли-А получают аналогично примеру 1 за исключением того, что исходные АМФ и АТФ берут в соотношении 1,6:1, а реакцию проводят при 18 С и при рН результате получают 1,290 ммоль поли-Л (выход 43K) с молярной массо" 180220 тыс,Дальтон.

Пример 6, Получение поли-И.

Получают поли-А аналогично примеру 1. Отделяют поли†A от непрореагиСпособ получения полиадениловой и полиинозиновой кислот, предусматривающий проведение ферментативной реакции из исходного субстрата-нуклеотида с помощью полинуклеотидфосфорилазы с последующей ее остановкой смесью хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 2,5:1, и выделении елевого продукта осаждением полинуклеотида этанолом, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью снижения себестоимости и улучшения качества за счет повышения биологической активности целевых продуктов, в качестве субстрата используют смесь

ЛМФ и АТФ в молярном соотношении (0,9-1,3):1, при этом в него дополнительно вводят ферментативный комплекс из клеток штамма Eschrichia, coli MRE 600, содержащий аденилаткиназу и ацетаткиназу, а ферментативную реакцию ведут при температуре 12-15 С и рН 7,3-7,5.