Способ спектрального определения активности пептидаз
Изобретение относится к анализу пептидаз по флюоресценции продуктов реакции. Цель изобретения - повышение точности и чувствительности определения пептидазной активности ферментов. В качестве субстратов предложено использовать 1-аминоациламинонафталин-5-сульфокислоты. Продукт ферментативной реакции - 1-аминонафталин-5-сульфокислоту определяют по флюоресценции /98л<SB POS="POST">в</SB>озб 360 нм,98л*<SB POS="POST">ф</SB>л 505 нм/ непосредственно в реакционной смеси. Флюоресценция субстрата /λ<SB POS="POST">в</SB>озб 340 нм,λ<SB POS="POST">ф</SB>л 420 нм/ не мешает определению. 1 з.п.ф-лы,1 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
„„SU„„1470766 А1 у11 4 C 12 0.1/00, G 01 N 33/52
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
H А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ субстратов-1-(аминоацил)-аминонафталин-5-сульфокислот.
Для проведения анализа согласно способу. целесообразно использовать для возбуждения флюоресценции источник длиной волны 360 нм, а продукт реакции — 1-нафтиламин-5-сульфокислоту — определять при . 505 нм„ при этом флюоресценция субстрата (, -340 нм, 9, 420 нм) полностью исключается. К реакционной смеси, содержащей субстрат, буферные добавки, вещества, необходимые для нормальной работы фермента (например, комплексоны, ионы магния и пр.), добавляют известное количество определяемого фермента, смесь инкубируют при постоянной температуре, наблюдая за увеличением флюоресценции при
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ .И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 4106664/31-13 (22) 05. 06. 86 (46) 07.04.89. Бюл. N - 13 (71) Институт молекулярной генетики
АН СССР (72) А.А.Недоспасов и В.Н.Незавибатько (53) 655.4 (088.8) (56) Hemker Н,С. Handbook of Synthetic Substrabes for the Coagulation
and Fibrinolytic System. — М. Nijhoff Publ ° 1983 °
Авторское свидетельство СССР
М- 1359283, кл. С 12 N 9/50, С 07 С 143/60, 14.06.86.
Изобретение относится к биохимии, конкретнее к способам определения ферментов, гидролизующих амидные связи, и может быть использовано в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, пищевой, гидролизной, фото- и микробиологической промышленности для анализа пептидаз.
Целью изобретения является повышение точности и чувствительности определения пептидазной активности ферментов.
На чертеже приведен график определения чувствительности пептидаз.
Целесообразно использовать метод флюоресценции для количественной регистрации продукта ферментативной реакции — 1-нафтиламин-5-сульфокислоты, образующейся при гидролизе (54) СПОСОБ СПЕКТРАЛЬНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПЕПТИДАЗ (57) Изобретение относится к анализу пептидаз по флюоресценции продуктов реакции. Цель изобретения — повышение точности и чувствительности определения пептндазной активности ферментов. В качестве субстратов предложено использовать 1-аминоациламинонафталин-5-сульфокислоты. Продукт ферментативной реакции — 1-аминонафталин-5-сульфокислоту определяют по флюоресценции (> 360 нм, 505 нм) непосредственно в реакционной смеси. Флюоресценция субстрата (9 340 нм, % „ 420 нм) не Я мешает определению. 1 з.п. ф-лы, 1 ил, 1 табл.
1470766
Опыт Фермент
Буферный раствор
Время инкубации, позволяюВремя инкубации по прототипу, с
Субстрат щее выявить фермент визуально, с
Проназа Ю- е" - н 0,05 тРис-НС1ь 25 600
О О рН 7,6 оун
Как в примере 1 25 600
2 Трипсин Тозил
-g1y-Pro-Arg-NH
3 Папаин Как в примере 1
0,05М трис-НС1, рН 8,0, 0,001М, ЭДТА, 0,001 М дитиотреит
Как в примере 1
0,066 трис-НС1, 0,05 М СаС1, 0,05 И NaC1 25 600 35
37 1800 120
4 Тромбин
5 Комплекс А фпротеаз О О сыворотки о,н
60 крови
6 Комплекс Pro-Рпепротеаз Аг NH
То же
so> н
505 нм. По интенсивности роста флюоресценции судят о количестве фер/ мента. Можно также проводить измере ния "по конечной точке", определяя флюоресценцию однократно по истечении определенного промежутка времени.
Пример 1. Определение активности трипсина по флюоресценции 1-нафтиламин-5-сульфокислоты. 10
2 мл реакционной смеси, содержащей 5 10 M 1-(N-карбобензоксиаргиHHJI)-аминонафталин-5-сульфокислоты в 0,05 M трис-НС1 буфере, рН 8,2, помещают в кювету спектрофлюориметра, 15 добавляют 10 мкл исследуемого фермента и проводят измерение флюорес ценции при 505 нм, -> 360 нм, по отношению прироста интенсивности фпюоресценции к временному интервалу 20 судят о количестве фермента, используя в качестве эталона стандартную кривую, снятую в тех же условиях при известных концентрациях стандартного раствора трипсина.
Пример 2. Определение активного тромбина по флюоресценции
1-аминонафталин-5-сульфокислоты. 2мл
2 ° 10 М раствора тозилглицил-1-пролил-1-аргинил-аминонафталин-5-сульфокислоты в 0,05 М трис-НС1 буфере, рН 8,2 помещают в кювету спектрофлюориметра, добавляют 10 мкл исследуемого образца тромбина, перемешивают и регистрируют рост интенсивности флюоресценции при 505 нм (Э о .
360 нм) во времени. Активность фермента определяют по тангенсу наклона касательной и кривой зависимости интенсивности флюоресценции от времени.
Аналогичным образом может быть проведен анализ других пептидаэ, приведенных в таблице.
0,8
500 в00
300
Составитель И.Привалова
Техред .Л. Сердюкова
Редактор Н.Рогулич
Корректор С.Черни
Заказ 1551/29 Тираж 501 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óàãîðîä, ул. Гагарина,101 е 14707
Как видно из чертежа, максимумы чувствительности определения приходятся на длину волны эмиссии 505 нм, при возбуждении 360 нм отклонение от .
5 максимумов понижает чувствительность определения.
Формула изобретения
1. Способ спектрального определения активности пептидаз, предусматривающий измерение скорости ферментативного гидролиза аминоацильных производных 1-аминонафталин-5-сульI
66 е фокислоты с количественной регистрацией изменения спектральных характеристик реакционной смеси, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повьппения точности и чувствительности определения пептидазной активности ферментов, количественную регистрацию проводят путем измерения интенсивности флюоресценции.
2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что интенсивность флюоресценции измеряют на длине волны 505 нм при использовании источника возбуждения с Э 360 нм.
