Способ получения обратной транскриптазы вируса саркомы рауса

 

Изобретение относится к генетической инженерии. Согласно предлагаемому способу кодирующий обратную транскриптазу pol-ген ДНК вируса саркомы Рауса встраивают в плазмидный вектор экспрессии, в частности в pUC 9, непосредственно за lac-промотором, полученные фрагменты используют для трансформации бактерий E.coli, после чего отбирают рекомбинантную ДНК, обладающую набором последовательностей, обеспечивающих репрессию и индукцию вирусного pol-гена, связывание его МРНК с рибосомой, а также последовательностью инициации и терминации трансляции. Полученной рекомбинантной ДНК трансформируют E.coli, клетки бактерий разрушают и фермент очищают ионообменной хроматографией.

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии, а именно к способу получения фермента - обратной транскриптазы вируса саркомы Рауса (RSV). Способ заключается в том, что кодирующий обратную транскриптазу pol-ген, выделенный из ДНК вируса саркомы Рауса, встраивают с помощью лигазы в плазмиду с большим числом копий таким образом, чтобы указанный ген находился в плазмиде непосредственно за lac-промотором, который может быть репрессирован и легко индуцирован. Полученной лигазной смесью затем трансформируют E.coli, после чего отбирают трансформированные клетки, несущие ДНК с набором последовательностей, обеспечивающих подавление и экспрессию вирусного pol-гена, связывание его МРНК с рибосомой, а также с последовательностями, обеспечивающими инициацию и терминацию трансляции. Рекомбинантной плазмидой трансформируют E.coli, бактериальные клетки после индукции разрушают и извлеченный сырой фермент - обратную транскриптазу подвергают очистке. П р и м е р 1. Получение плазмидной ДНК. 6 мкг ДНК плазмиды pSRA-2 подвергают последовательно обработке рестриктазами Xmal, XhoI и Pstl. Проверку эффективности расщепления электрофорезом в агарозном геле производят после каждого гидролиза. Также выполняют гидролиз ферментами Pstl и SalI 2 мкл ДНК pUC 9. Обе ДНК подвергают осаждению 96%-ным этанолом и трехкратной промывке 70% -ным этанолом. Каждую из двух осажденных фракций растворяют в 20 мкл лигирующего буфера. Смесь, приготовленную из 280 нг расщепленной ДНК pUC 9 и 1350 нг расщепленной ДНК pSRA-2, дополняют необходимыми компонентами и после добавления 10 единиц лигазы оставляют на ночь в холодильнике при 8^оС. С помощью лигазной смеси (5-10 мкл) проводят трансформацию клеток штамма бактерий E. coli HB 101, предварительно обработанных CaCl₂. Клетки растирают на агарных пластинках, приготовленных с питательной средой LB и дополненных 0,5% глюкозы и 20 мкл/мл ампициллина. После инкубации в течение 18 ч при 37^оС проводят анализ выращенных колоний, определяют размер содержащейся в них плазмиды. Отбирают штаммы, содержащие искомую плазмиду размером в 5,5 кв. (рМF 14). Эти клетки выращивают в жидкой питательной среде, содержащей глюкозу и ампициллин, затем производят выделение плазмиды. Плазмиду проверяют с помощью рестриктаз (Pstl, SaIl, BamHI, HInd III), а также их сочетаний и сопоставляют с оригинальной картой pol-гена. Отобранный клон далее используют для тестирования фермента, поступая при этом следующим образом. 2 мл культуры, выращенной за ночь на питательной среде LB с глюкозой и ампициллином, используют для посева в 20 мл указанной среды, и проводят инкубацию при энергичном встряхивании при 37^оС. При достижении плотности E₆₅₀ 1,0 к культуре добавляют свежеприготовленный водный раствор IPTG, доводя концентрацию последнего до 1 мМ, и продолжают инкубацию еще в течение 60 мин. Собранные центрифугированием клетки обрабатывают лизоцимом и лизирующим раствором. Лизирующий раствор: 1% Triton X-100 0,2% NP-40 1 мМ EDTA (этилендиаминтетраацетат) 2 мМ DTT (дитиотреитол) 2 мМ PMSF 10 мМ фосфата натрия (рН 8,0) Разрушают сферопласты. Прозрачную фракцию, полученную в количестве 200-400 мкл, непосредственно используют для тестирования ферментативной активности. Проверенный, продуцирующий обратную транскриптазу клон выращивают и индуцируют синтез белка, продукт из культуры выделяют с целью характеристики фермента. П р и м е р 2. Препаративное выделение обратной транскриптазы. 800 мл культуры E. coli HB 101, содержащей плазмиду pMF 14, выращивают на питательной среде LB с добавленной глюкозой (0,5%) и ампициллином (100 мкг/мл) до достижения плотности 2,2. После центрифугирования клетки суспендируют в 50 мл питательной среды М9, не содержащей глюкозы, но содержащей ампициллин. После инкубации с энергичным встряхиванием в течение 30 мин добавляют IPTG до достижения концентрации 10 мМ, затем продолжают инкубацию еще в течение 90 мин. Собранные центрифугированием клетки замораживают жидким азотом и до обработки хранят при -20^оС. Все операции по выделению фермента проводят при 4^оС. Замороженные клетки суспендируют в 8 мл 10%-ного раствора сахарозы, содержащего 10 мМ фосфата натрия (рН 8,0), и к суспензии добавляют 2 мл раствора лизоцима в этом же фосфатном буфере с концентрацией 20 мг/мл. Спустя 10 мин наслаивают 11 мл лизирующего раствора и два слоя осторожно перемешивают. Полученный раствор подвергают центрифугированию при 100000 g в течение 1 ч, затем к верхнему слою добавляют пятимолярный раствор NaCl до достижения конечной концентрации 0,1 М (в данном примере для этого к 43,5 мл верхнего слоя следует добавить 870 мкл 5 М раствора NaCl) и этот раствор наносят на колонку с DE 32 размерами 2х12 см, уравновешенную буфером А (10% глицерина, 5% сахарозы, 0,2% NP-40, 10 мМ фосфата натрия, рН 8,0, 1 мМ DTT, 0,5 мМ ЭDТА, 0,1 мМ PMSF, 0,1 м NaCl). Бета-субъединица обратной транскриптазы не сорбируется на носителе, в то время как значительная часть ДНК-полимеразы, а также нуклеиновые кислоты, мешающие последующим хроматографическим разделениям, оказываются соpбированными. Колонку промывают буфером А до тех пор, пока несорбируемое вещество полностью смывается (экстинкция элюата А₂₈₀ 0,1), и пропущенный раствор (140 мл) подвергают диализу трижды по 4 ч против 1 л буфера Б. Буфер Б: 10% глицерина 0,2% NP-40 (нонидет Р-40)
10 мМ фосфата натрия (рН 8,0)
1 мМ DTT
0,5 мМ EDTA
0,1 мМ PMSF
Полученный после диализа продукт наносят на колонку с фосфоцеллюлозой Р11 размерами 2х20 см. Колонку промывают буфером Б до снижения экстинкции до А₂₈₀ 0,1 (в данном примере на это потребуется 200 мл буфера), затем через колонку пропускают градиент буфера Б в режиме 0,01-1,0 М, собирая фракции объемом 4 мл. Из каждой фракции отбирают пробу объемом 3 мкл для определения активности обратной транскриптазы. Активные фракции, элюированные в интервале 0,25-0,33 М, собирают и объединенный элюат подвергают диализу в течение 3х8 ч против 3х2 л буфера В. Буфер В:
10% глицерина
0,2% NP-40
1 мМ DTT
0,5 мМ EDTA
10 мМ фосфата калия (рН 8,0)
После диализа вещество наносят на колонку с DE 32 размерами 1х5 см, несорбируемые вещества смывают буфером В. Обратную транскриптазу затем элюируют буфером В, содержащим 0,5 М KCl, собирают фракции объемом 0,4 мл. Активность обратной транскриптазы во фракциях определяют, отбирая из них пробу объемом 1 мкл. Объединенные активные фракции (около 3 мл) подвергают диализу в течение 18 ч против буфера Г. Буфер Г:
50% глицерина
50 мМ фосфата калия (рН 8,0)
50 мМ KCl
1 мМ DTT
0,5 мМ EDTA
В результате описанных процедур очистки получается 1 мл раствора обратной транскриптазы, обладающего активностью 20 ед/мкл. Суммарное количество фермента, вырабатываемого из 800 мл исходной бактериальной культуры, составляет таким образом около 20000 ед. П р и м е р 3. Препарат в состоянии поддерживать синтез ДНК в стандартной реакционной смеси в течение не менее 2 ч. Денатурирующий гельэлектрофорез РНК не показывает изменений при инкубации РНК с препаратом, полученным согласно предлагаемому способу, в течение 4 ч. Это доказывает, что очищенная рекомбинантная обратная транскриптаза не содержит неспецифических нуклеаз. Рекомбинантная обратная транскриптаза синтезирует поли dT в системе затравка - матрица rA/dT₄₅ как в присутствии ионов Mg⁺⁺, так и в присутствии ионов Mn⁺⁺. Оптимальная концентрация этих ионов составляет 3 и 2 мМ соответственно. Наличие этих ионов в концентрации 6 мМ приводит к незначительному снижению скорости реакции. Фермент выполняет свои функции так же в системе затравка - матрица поли rCm/олиго^dG, но лишь в присутствии Mn^++. Активность фермента на этом субстрате составляет около 25% от активности, измеряемой на классическом субстрате поли rA/dT. В системе поли А⁺ мPHK/олиго dT (т.е. при синтезе кДНК) оптимальная для фермента концентрации Mg⁺⁺ составляет 6 мМ, тогда как концентрация Mn⁺⁺ составляет 2 мМ, 7,5 ед.акт. фермента включают [3H]g ТТФ в количестве, соответствующем образованию 0,8-1,6 нмоль кДНК. Размер получаемого продукта составляет 200-1600 нуклеотидов в случае поли А⁺ мPHK дрозофиллы и 400-7000 нуклеотидов в случае значительно более длинной гетерогенной ядерной поли А⁺ РНК печени крысы.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПТАЗЫ ВИРУСА САРКОМЫ РАУСА, заключающийся в том, что в плазмиду pUC9 непосредственно за Iac-промотором с помощью лигазы встраивают Pst - XhoI-фрагменты плазмиды pSRA-2, полученной смесью ДНК трансформируют клетки E.coli, после чего по устойчивости к антибиотику отбирают трансформированные клетки, из которых выделяют ДНК, затем из них по молекулярной массе отбирают ДНК, которая содержит набор последовательностей, обеспечивают репрессию и экспрессию вирусного pol-гена и связывание его мРНК с рибосомой, а также последовательности, инициирующие и терминирующие трансляцию, затем выделенной рекомбинантной ДНК трансформируют клетки E. coli HB 101, после культивирования бактериальные клетки разрушают и выделяют обратную транскриптазу ионообменной хроматографией.