Штамм бактерий соrynевастеriuм sереdоniсuм - продуцент полисахарида, обладающего митогенной активностью

 

Изобретение относится к микробиологии и касается нового штамма бактерий GоRYNевастеRIUм SереDоNIсUм ВНИИА N4834 - продуцента полисахарида, обладающего митогенной активностью. Цель - повышение безвредности митогенного препарата и экономичности, а также снижение трудоемкости его получения. Штамм выделен из больных клубней картофеля, хранится на косяках картофельного агара. Полисахарид получают выращиванием культуры на жидкой среде, содержащей глюкозу и хлорид аммония в качестве источников углерода и азота соответственно, при 25±3°С, рН 7,0-7,2 в течение 31-35 с ч последующим выделением из клеток щелочным гидролизом. Выход 1-2% от С, 3-4% от биомассы. Полисахарид состоит из повторяющихся единиц, содержащих четыре остатка рамнозы и по одному остатку фруктозы и гексуроновой кислоты. Мол.м.70000 Д. Митогенная активность 23,75± 0,75%, митогенный индекс 70,6±0,8.

СОЮЗ СО8ЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) 51) 4 С 12 P 19/04//(С 12 P 19/04, С 12 R 1:15) ОЛИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМ ./ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4293386/31-13 (22) 03.08.87 (46) 15.07.89. Бюл. К- 26 (71) Институт микробиологии и вирусологии им.Д.К.Заболотного (72) Л.Д.Варбанец,И.Я.Захарова, P.È.Ãâîçäÿê, В.А.Мурас, А.Ф.Фролов, С.Л.Рыбалко, С.Т.Дядюн, И.Л.Маричев и Ю.П.Галагуэа (53) 663.18 ($88 8) (56) Патент Великобритании У 1174322, кл. С 12 P 1969.

Федоровская Е.А., Калинина Н.А. и др. Митогенные свойства липополисахаридов, выделенных из различных сероваров Eseherichia coli. — Микробиологический журнал, 1984, 46, М 4, с.26-29. (54) ШТАИИ БАКТЕРИЙ CORYNEBACTERIVM

SEPED0NICVN — ПРОДУЦЕНТ ПОЛИСАХАРИДА, ОБЛАДАЮЩЕГО МИТОГЕННОЙ АКТИВНОСТВЮ (57) Изобретение относится к микробиологии и касается нового штамма

Изобретение относится к микробиологии и касается нового штамма бактерий Corynebacterium sepedonicum— продуцента полисахарида, обладающего митогенной активностью.

Цель изобретения — повышение безвредности митогенного препарата, а также повышение экономичности и снижение трудоемкости его получения.

Штамм депонирован в коллекции культур микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института

2 бактерий Corynebacteri um sepedonicum

ВНИИА Р 1834 — продуцента полисахарида, обладающего митогенной активностью. Цель — повышение безвредности митогенного препарата и экономичности, а также снижение трудоемкости его получения. Штамм выделен иэ больных клубней картофеля, хранится на косяках картофельного агара. Полисахарид получают выращиванием культуры на жидкой среде, содержащей глюкозу и хлорид аммония в качестве источников углерода и азота соответственно, при 25+3 С, рН 7,0-7,2 в течение 31-35 ч с последующим выделением иэ клеток щелочным гидролизом. Выход 1-2/ от С, 3-4Х от биомассы. Полисахарид состоит из повторяющихся единиц, содержащих четыре остатка рамнозы и по одному остатку фруктозы и гексуроновой кислоты.

Мол.м. -70000 Д. Иитогенная активность 23,75 + 0,75Х, митогенный индекс 70,6+0,8. антибиотиков (ВНИИА) под номером

1834. Хранится в Институте микробиологии и вирусологии им,Д.К.Заболотно го АН УССР под номером ИМВ 7757.

Культуру хранят в пробирках на косяках с картофельным агаром. Его состав: 200 г картофеля, 0,57. хлорида натрия, 1,5-2,01 агара, вода до 1 л, рН 7,0-7,2 ° Условия хранения: при комнатной температуре или под минеральным маслом.

1493672

Штамм выделен иэ больных клубней картофеля. Способ получения штамма состоит в следующем. Пораженную ткань картофеля вырезают, промывают стериль-5 ной водой, растирают с небольшим количеством стерильной воды, образующуюся гомогенную кашицу высевают на поверхность агара и выращивают при

25+3 0 на одной из следующих пита- 1О тельных сред: картофельный агар; картофельный агар +1 глюкозы; картофельный агар + 1X дрожжевого автолизата; мясопептонный агар (МПА).

Штамм имеет следующие морфологи- 15 ческие и физиолого-биохимические признаки.

Морфологические признаки.

Клетки размером (0,4-0,6)х(0,81,2) мкм, прямые или несколько ис- 20 кривленные палочки, неподвижные, неспороносные. Располагаются одиночно, парами или Ч-образно. Граммположительные.

На картофельном агаре — колонии круглые, гладкие, нежные, приподняты, блестящие, слабо слизистые, желтого цвета. Хорошо растет на обычных питательных средах.

Физиолого-биохимичесКие признаки.

Сбраживает ксилоэу со слабым образованием кислоты. Не образует кислоту из глюкозы, лактозы, мальтоэы, сахарозы, рамнозы, маннита,салицита, 35 дульцита, сорбита. Не образует сероводород, индол. Нитраты не редуцирует ° Молоко слабо пептонизирует. Желатину не разжижает. Азробный рост, температура 23-25 С, рН 7,0-7,2. Не 40 вирулентен,, не токсичен для теплокровных животных.

Штамм продуцирует полисахарид с митогенной активностью при выращивании на жидкой синтетической среде, 45 содержащей глюкозу в качестве источника углерода и хлорид аммония — в качестве источника азота, при температуре 23-25ОС в течение 31-35 ч.

Полисахарид накапливается в клетках.

Его выделяют щелочным гидролиэом клеток. Выход полисахарида составля,ет 1-2Х от источника углерода и

3-4 от биомассы.

ПЬлисахарид состоит из повторяющихся единиц, содержащих один остаток фруктозы, четыре остатка рамнозы и один остаток гексуроновой кисло-. ты. Мол.мас ° 70000 Д.

Ниже приведены примеры получения полисахарида с использованием штамма Corynebacterium sepedonicum ВНИИА

У 1834.

Пример 1. Культуру штамма, хранящуюся на косяках с картофельным агаром, засевают на косяк с той же средой и выращивают в термостате при 23-25,0 в течение 24 ч. Затем культуру смывают с косяков жидкой питательной средой описанного выше состава и засевают в колбы емкостью

500 мл, содержащие 200 мл питательной среды следующего состава, г/л:

МД$04 0,3; КН Р04 3,0; Na

NH

7,0-7,2. Выращивают на качалках (240 об/мин) в течение 31 ч. Клетки осаждают центрифугированием при

5 000 об/мин в течение 20-25 мин, промывают физиологическим раствором и подвергают гидролизу в 5Х-ном растворе КОН (100 мл на 1О r влажных клеток) в теченИе 1,5 ч. Гидролизат диализуют против водопроводной, а затем дистиллированной воды до нейтрального значения рН, центрифугируют для осаждения неразрушенных клеток, а также загрязняющих компонентов клеточной стенки при 5 000 об/мин в течение 20-25 мин. Полисахарид осаждают из надосадочной жидкости добавлением 5 объемов спирта. Осадок полисахарида освобождают от липидов последовательной обработкой ацетоном, эфиром, а затем смесью хлороформа с метанолом (2: 1) и подвергают ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Полисахарид элюируют 0,25 М фосфатным буфером с рН 7,2, а затем лиофильно высушивают, Выход очищенного полисахарида составляет 3-47..

Полученный полисахарид проверяют на митогенную активность в реакции бласттрансформации В-лимфоцитов периферической крови человека °

Учет реакции бласттрансформации лимфоцитов проводят морфологическим методом в фиксированных и окрашенных по Романовскому мазках, в которых просматривают по 200-400 клеток и подсчитывают количество бластных, бластоподобных форм и лимфоцитов.

Митогенная активность полисахарида, синтеэируемого С.sepedonicum

ВНИИА Р 1834, составляет 23,75+0,75X, митотический индекс — 70,6 0,8, Составитель Г. Голева

Техред А.Кравчук

Редактор М.Товтин

Корректор А.Обручар

Заказ 4067/28 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

5 1493672 в

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я цент полисахарида, обладающего мито-, Штамм бактерии (;orynebacterium генной активностью.

sepedonicum ВНИИА Р 1834 — проду