Способ получения никотинамидадениндинуклеотида

 

Изобретение касается нуклеотидов , в частности, получения никотинамидадениндинуклеотида, используемого в биологических исследованиях. Синтез ведут из ферментационных растворов (содержащих биополимеры, нуклеотиды и пигменты), которые подвергают ультрафильтрации на мембранах, задерживающих вещества с мол.м. более 20000 (для отделения биополимеров). Затем раствор хроматографируют сначала на сильном катионите, а затем на сильноосновном анионите (для отделения пигментов) с последующим осаждением смеси нуклеотидов органическим растворителем, разделением на анионообменном декстрановом геле и осаждением целевого продукта низшим спиртом (этанолом). При этом лучше отделять пигменты на анионите марки АРА-5п-Т40 с проведением сорбции в присутствии 0,05-0,1 М раствора уксусной кислоты, а десорбции - 0,5-0,7 М раствором уксусной кислоты. Смесь нуклеотидов лучше разделять на ДЕАЕ-декстрановом геле. Эти условия повышают качество целевого продукта до содержания основного вещества с 85 до 98% при использовании исходных растворов с низкой концентрацией и меньшем в 3 раза расходе растворителя. 1 з.п. ф-лы.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (19) (11) (51) 4 С 07 Н 19/207

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

Н А ВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

2 ров) . Затем раствор хроматографируют сначала на сильном катионите, а затем на сильноосновном анионите (для отделения пигментов) с последующим осаЖдением смеси нуклеотидов орнаническим растворителем, разделением на анионообменном декстрановом геле и осаждением целевого продукта низшим спиртом (этаиолом). При этом лучше отделять пигменты на аиионите марки APA-5п-Т40 с проведением сорбции в присутствии 0,05-0, 1 М раствора уксусной кислоты, а десорбции—

0,5-0,7 И раствором уксусной кислоты

Смесь нуклеотидов лучше разделять на

ДЕЛЕ-декстрановом геле. Эти условия повышают качество целевого продукта до содержания основного вещества с

85 до 98Х при использовании исходных растворов с низкой концентрацией и меньшем в 3 раза расходе растворителя. 1 э.п. ф-лы. (21) 4382702/23-04 (22) 18. 01. 88 (46) 07.09. 89. Бюл. У 33 (71) Научно-производственное объединение -"Биолар" АН СССР (72) A.A.Ñïóíèòå и Е.Д.Ермолаев (53) 547.821 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

М 1014266, кл. С 07 Н 19/207, 198 1. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИКОТИНАМИДАДЕНИНДИ НУКЛЕОТИДА (57) Изобретение .касается нуклеотидов, в частности получения никотинамидадениндинуклеотида, используемого в биохимических исследованиях.

Синтез ведут из ферментационных растворов (содержащих биополимеры, нуклеотиды и пигменты), которые подвергают ультрафильтрации на мембранах, задерживающих вещества с мол.м. более 20000 (для отделения биополиме"

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения никотинамидадениндинуклеотида (НАД), которой применяется в научных исследованиях и в медицине.

Целью изобретения является повышение качества целевого продукта.

Цель достигается тем, что биополимеры отделяют ультрафильтрацией ферментационного раствора йа мембранах, задерживающих вещества с молекулярной массой свыше 20000 и посла хроматографической очистки на сильнокислотном катионите, оставшиеся пигменты отделяют хроматографией иа сильноосновном анионите, а полученную смесь нуклеотидов отделяют на анионообменном декстрановом геле. Пример 1. 5,0 л культуральной жидкости Brevibacterium ammoniagenes (конц, P НАД 1,0 г/л) подвергают ультрафильтрации на полых волокнах APB-2, ОАПУ-20, которые задерживают биополимеры с мол.м. 20000. Пермеат пропускают через колонку с катионитом КРС 4 и в Н -форме. Объем

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

3 1505951 к<. анки 5,5 л. Элюируют, еминерали аванна 1 водой. Фракции с рН 1,5-3,8, содержащие примеси (АТФ, АМФ и т.д., пигменты), отбрасывают, Собирают НАД, 10 л которого непосредственно пропускают через колонку объемом 1,5 л с анионитом APA-5п-Т40 в СН>СОО -форме, уравновешенным 0,1 M CH COOH.

НАД десорбируют. 0,5 М СН СООН (6,0л) .10

Раствор упаривают до 0,3 л, НАД выделяют осуждением этиловым спиртом

3,0 ч. Осадок растворяют в 0,20 л деминерализованной воды и пропускают через колонку с анионнообменником 15

ДЭЛЭ 2,5 в CH СОО -форме, уравновешенным 0,01 M СН СООН. НАД десорбируют 0,1 М СН СООН (2,1 л), выделяют осаждением этилавым спиртом.

Получают 4,4 г препарата (выход 20

857) .

НАД=99,7X (опред. по f,, в н о

= 18,7.10 ) .

1 -НАД=98,07. (энз. анализ с АДГ), II р и м е р 2. 1,8 л культуральной жидкости бактерий Brevibacterium

ammoniagenes, содержащей 3,0 г/л

НАД, подвергают ультрафильтрации на мембранах (Рипор-4), задерживающих биополимеры с мол .м. 20000. 30

Пермеат пропускают через колонку с катионитом KPC-Кп (Н -форма) (объем колонки 2,0 л), уравновешенным деьянерализованнай водой до рН 5, 1.

Элюируют деминерализованной водой, собирают фракции по 0,2 л. Фракции с рН 1,5-3,5, содержащие пигменты и компоненты нуклеиновых кислот, отбрасывают, Собирают фракции, содержа- 40 щие )-НАД.О,2 г/л, объемом 2,6 л, которые пропускают через анионит в

СН СОО -форме, уравновешенный водой до рН 4,0, 0 5 л. Колонку промывают 0,12 M СН СООН, десарбируют НАД 0,8 л 0,8 М СН> СООН.

Раствор упаривают до 0,1 л и осаждают этиловым спиртам (1:10) . Полученный осадок растворяют в 0,1 л деминерализованной воды и наносят на колонку с ДЭАЭ 2,5 в СН COO -форме, 50 уравновешенный водой (объем колонки

0,2 л), Десорбируют НАД О, 1 М СН СООН фракциями по О, 1 л. Фракции, содержащие НАД, осаждают этиловым спиртом и получают 4,5 л НАД с содержанием

98,77 (опред ° по -НАД 256 им pHQ,О

=18,7.10 ) и 6-НАД 97,57 (энзим. анализ с VII ) 11 р и м е р 3. 10 0 л культуральной жидкости бактерий Brevibacterium

ammoniagenes концентрацией НАД 1,4г/л подвер гают ультрафильтрации на полых волокнах APB-2, ОЛПУ-20, которые задерживают биополимеры с мол.м.-20000.

Пермеат пропускают через колонку с катионитом KPC-4 п в H †форме (объем колонки 10 л), уравновешивают деминерализованной водой до рН

4,5. Элюируют деминералиэованной водой. Фракции с рН 3,5, содержащие примесей {пигменты, компоненты нуклеиновых кислот и т.д,), отбрасывают. Собирают 20 л раствора, содержащего НАД, который пропускают через анионит APA-5п-Т40 в СН СОО -форме, уравновешенный 0,08 Ì ÑH ÑOOH. НАД десорбируют 3,5 л 0,7 M СН СООН и иэ раствора выделяют осаждением этиловым спиртом (1:10), Полученный препарат содержит АДП-рибозу, АМФ и т.д, Осадок растворяют в 0,2 деминерали" зованной воды и наносят на ионообменный декстрановый гель ДЭАЭ 2,5 в

СНзСОО -форме, уравновешенный 0,01

M CH COOH. НАД десорбируют О,1 М

СН СООН. Первые фракции, содержащие примеси (нуклеотиды), отбрасывают.

2,5 л раствора, содержащего НАД, упаривают до 0,3 л, осаждают 3,0 л этакола.

Получают 12,1 r НАД (выхад 857) .

Содержание НАД 97,57 (по Я НАД, 258 нм рН 2,0) 3-НАД 96,5% (энэ.анализ с АДГ) .

Пример 4. 3,0 л отсепарированной культуральной жидкости бактерий Brevibact. ammoniagenes концентрацией р-НАД 2,1 г/л подвергают ультрафильтрации на полых волокнах ЛРБ-2,0 АПУ-20, которые, задерживают биополимеры с мол,м. 20000. Пермеат пропускают через колонку с катионитом KPC-4п .в H"-форме (объем колонки 3,2 л), уравновешенным деминерализованной водой до рН 4,0. Элюируют деминерализованной водой. Фракции с рН 3,6, содержащие пигменты и компоненты нуклеиновых кислот, отбрасывают (7,0 л) . Собирают НАД фракциями по 0,5 л. Общий объем раствора НАД 6,0 л, его непосредственно пропускают через колонку с подготовленным сильноосновным анно" нитом в СН>СО0 -форме, уравновешен ным 0,05 М СН СООН. Адсорбированный

НАД элюируют 0,5 М СН СООН (1,4 л) 15059 и вьделяют из раствора осаждением этиловым спиртом в соотношении 1: 10.

Осадок растворяют в деминерализованной воде и пропускают через колонку (объем 0,25 л) с анионообменным декстрановым гелем ДЭАЭ-2,5 в ацетатной форме, уравновешенным 0,05 М CHsCOOH

Десорбируют НАД 0,1 M CH3C00H. Собирают фракции по 0,2 л. Первые фракции (0,7 л), содержащие примеси (смесь нуклеотидов), отбрасывают. Последующие фракции, содержащие НЛД (объем 1,5 л), упаривают до О,"= л и осаждают этиловым спиртом (2,0 л). 15

Получают 5,0 r препарата, выход

857.

НАД=96% (опр. по Я НАД <

=18,7,10э) . 2БЬ нм р и 0

1 — НАД=-95,57. (энз. анализ с АДГ) . 20

Пример 5. 2,4 л культуральной жидкости Вгеч1Ъас егium ammoniagenes" концентрацией НЛД 2,0 г/л подвергают ультрафильтрац .и на мембранах "Рипор 4", которые задерживают 25 биополимеры с мол.м..-20000 ° Пермеат . пропускают через колонку с катионитом KPC-5п-Т40 в Н -форме. Объем коФ лонки 2, 5 л, уравновешивают и элн ируют деминерализованной водой. Ло- 30 лучают раствор НАД объемом 4„5 л, который пропускают через анионит ЛРА5п-Т40 в (ацетатной форме), уравновешенный 0,03 М СН СООН. НАД десорбируют 0,4 М СН СООН (1,2 л) и вьделяют осаждением этиловым спиртом. НЛД растворяют в деминерализованной воде и пропускают через колонку объемом

0,25 л с декстрановым гелем ДЭАЭ 2,5 в ацетатной форме (рН 4,1) . НЛД де- щ сорбируют 0,1 М СН СООН. Собирают раствор НАД 1,2 л, который упаривают до 0,2 л и осаждают этиловым спиртом

2,0 л.

Получают 28 r препарата (выход

60X) .

НАД 95,3Х (опред.по с НАД

7.10з )

Р -НАД 94,17 (энз. анализ с АДГ) .

П р. и м е р 6. 6,3 л культуральной жидкости бактерий Brevibactrerium ammoniagenes, содержащей 1,5 г/л

Р-НАД, подвергают ультрафильтрации на полых волокнах APB-2 О АПУ-20 коЭ

55 торые задерживают биополимеры с мол.м. 20000.

Пермеат пропускают через колонку с катионитом KPC-Кп в Н -форме, +

51 6 (объe м колонки 7, О л), уравновешивают деминерализрванной водой до рН

4,2, Элюируют деминерализованной водой. Фракции с рН 3,5, содержащие примеси (пигменты, компоненты нуклеиновых кислот и т.д.), отбрасывают. Собирают 14,0 л раствора, содержащего НЛД, которьп пропускают через анионит ЛРЛ-5п-Т40 в ацетатной форме, уравновешенный 0,08 М СН СООН, НЛД десорбируют 0,6 М СН СООН (2,6л).

НЛД из раствора выделяют осаждением этиловым спиртом (1:10). Полученный осадок растворяют в 0,2 л деминерализованной воды и пропускают через колонку с ДЭЛЭ 2,5 в СН; СОО -форме, уравновешенный 0,0 1 М CH СООН. Десорбируют НЛД 0,1 М СН СООН. Первые фракции, соде-ржащие примеси, отбрасывают, 1,8 и раствора НАД упаривают и выделяют осаждением этиловым спиртом (1: 10) .

Получают 8,0 л НАД (выход 857.) .

НЛД 99,87. (опред п f 258 нм H 0 "

=18,7,10З) .

P — НЛД 98, 37 (энэим, анализ с АДГ) .

Таким образом, предлагаемый способ пс зволяет повысить качество целевого гродукта, увеличить его содержание с 85 до 987., вьделить целевой продукт из ферментационных растворов с низким его содержанием в исходном сырье, сокрaтить расход органического растворителя в 3 раза, Сор мула изобретения

1 . Способ получения никотинамидаденивнуклеотида из ферментационных растворов, содержащих биополимеры, нуклеотиды и пигменты, включающий хроматографическую очистку и осаждение целевого продукта органическим растворителем, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью повышения kaчества целевого продукта, ферментационный раствор подвергают ультрафильтрации на мембранах, задерживающих вещества с молекулярной массой свыше 20000 с целью отделения биополимеров, полученный раствор подвергают хроматографической очистке сначала на сильном катионите, а затем . с целью отделения пигментов - на сильноосновном анионите с последуют щим осаждением смеси нуклеотидов органическим растворителем, разделе1505951

Составитель Г.Коннова

Техред М.Ходанич Корректор М.ВасильеВа

Редактор Н.Гунько

Заказ 5390/25 Тирюк 338 Подпис ное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.уагород, ул. Гагарина,101 нием последних на анионообменном декстрановом геле с последующим оса>кдением целевого продукта низшим спиртом.

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что отделение пигмента проводят на сильноосновном анионите марки АРА-5п-Т40, причем сорбцию проводят в присутствии 0,05 0, 1

М раствора уксусной кислоты, а де,сорбцию 0,5-0,7 М раствором уксусной кислоты, и полученную смесь нуклеотидов разделяют на ДЕАЕ-декстрановом геле.