Способ получения растений-регенерантов ноrdеuм vulgare, устойчивых к токсическому действию ai @ в кислой среде

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве, при селекционно-генетических исследованиях. Целью изобретения является получение устойчивых к токсическому действию AL<SP POS="POST">+</SP> растений, пригодных для выращивания на кислых почвах. Способ состоит в том, что осуществляется получение растений-регенерантов ячменя (НоRDеUм VULGaRe) на питательной среде из незрелых зародышей, при этом в среду, составленную на основе среды Мурасиге-скуга с добавками стимуляторов и фитогормонов, дополнительно вводят алюминий в виде алюмокалиевых или алюмоаммонийных квасцов и для поддержания желеобразной консистенции среды - желатин, при этом устанавливают кислый рН серной или соляной кислотой.

СООЭ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) (51) 5

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H А BTOPCH0MV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4346020/31-13 (22) 20.10.88 (46) 28.02.90.. Бюл. ) 8 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии (72) В.А. Внучкова и Н.Б. Хитров (53) 631.522:58.083.5(088.8) (56) Sith R.Н. et al. Sorgum plant ! regeneration f rom aluminium s election media. — PLant Cell Rep., 1983, v. 2, Nà 3, р. 129-132. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ HORDEUM VULGARE, УСТОЙЧИВЫХ ,К ТОКСИЧЕСКОЙУ ДЕЙСТВИЮ Alз+ В КИСЛОЙ СРЕДЕ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции растений для повышения эффективности селекционного процесса.

Проблема устойчивости зерновых злаков, прежде всего ячменя, к токсичности кислых почв является одной из крупнейших в сельском хозя:".стве мира (Бразилия, Канада, США, Япония и другие страны). Сущность проблемы состоит в том, что в условиях повышенной кислотности (рН водного раствора 5,5 до 3,0) алюминий, который обычно находится в почве в виде нерастворимых солей, переходит в раствор с образованием катиона А1 +и оказывается сильно токсичным для растений, резко снижая их урожайность. В полной мере это относится и к СССР, 2 сельском хозяйстве, при селекционногенетических исследованиях. Целью изобретения является получение устойчивых к токсическому действию Л1* ра— стений, пригодных для выращивания на кислых почвах. Способ состоит в том, что осуществляется получение растений-регенерантов ячменя (klordeum vulgare) на питательной среде из незрелых зародышей, при этом в среду, составленную на основе среды МурасигеСкуга с добавками стимуляторов и фитогормонов, дополнительно вводят алюминий в виде алюмокалиевых или алюмоаммонийных квасцов и для поддержания желеобразной консистенции среды- И

И жалатин, при этом устанавливают кислый рН серной или соляной кислотой.

)Иекль где свыше 50> полевых земель расположены в Нечерноземной зоне, почвы кс- 4 торой имеют кислую реакцию. 4

Цель изобретения — увеличение s=- ф хода устойчивых растений. вД) аб

Способ состоит в том, что незрелые зародыши ячменя культивируют на соеде, включающей (в мг/л) минеральные соли по

Иурасиге и Скугу, сахарозу 20000-30000, тиамин 1,0-10,0, миоинозитол 80-100, пиридоксин 0,5-1,0, никотиновую кислоту 0,5-1,0, 2,4Д (для формирования Ь каллуса) 2,0-3,0 или АНУ и кинетин (для регенерации растений) по 0,51,0, агар-агар 6000-7000, а также

7-9 мг/л алюминия в виде алюмокалиевых или алюмоаммонийных квасцов и

3400-3600 мг/г желатина, устанавли1546483 вая рН среды 4,8-3,8 соляной или серной кислотой.

Низкий уровень рН определяет переход нерастворимых солей алюминия в раствор с образованием А1 + . При выборе соединений алюминия следует оценивать их не только как поставщиков катиона Al+, но и с точки зрения присутствия в среде анионов дополнительно к тому минеральному составу, на основе которого приготовлена среда . Так, например, предпочтительнее использовать алюмоаммонийные или алюмокалиевые квасцы, чем хлорис- 15 тый алюминий (избыток Сl в среде нежелателен).

При расчетах доз алюминия следует иметь ввиду, что при повышении рН количество катиона Al + в среде умень.20 шается, при понижении увеличивается.

Если при концентрации алюминия

10 мг/л количество Al " в среде при рН 4,5 составляет 3,6 10 смоль/л, то при 4, 0-3,58 .10, при рН 3,5-3,6 25

«10, а при рН 3,0-3,6 10. При предлагаемой концентрации алюминия (79 мг/л) фосфора выпадает в осадок при рН 4,0-3,5 до 301 от исходного содержания, что допустимо для развития растений-регенерантов. Чем ниже рН среды, тем меньше образуется каллусов и регенерировавших из них растений. При рН 3,5 и ниже каллусная ткань от первичной посадки не форми- 35 руется или быстро погибает.

Кроме того, агар-агар в кислой среде не желируется. Плотную или желеобразную среду в этом случае можно получить, используя смесь агар-агара и желатина, который желируется в более кислых условиях. Достоинства этой смеси в том, что она дает плотную или желеобразную изотропную среду при кислом рН. Исполь- 45 зование одного желатина невозможно, так как он образует при застывании грубую ячеистую структуру, препятствующую контакту эксплантата со средой.

Поскольку желатин после автоклавирования подщелачивает среду, рН среды перед автоклавированием должен быть ниже заданного для эксперимента.

Желеобразная. среда хорошо удерживает на поверхности эксплантат, позволяет наклонять и даже класть пробирку во время работы.

/}ля эксперимента берут три уровня кислотности сред: рН 4,8-4,1-3,8 в соответствии с классификацией почв на слабокислые с рН 5-6(серые лесные оподзоленные), кислые с рН 4-5 (дерновоподзолистые и подзолистые) и сильно кислые с рН 3-4 (торфяные и болотистые).

Исходя из того, что свыше 503 почв

Нечерноземной зоны имеют кислую реакцию, предлагается селективная среда для регенерации зерновых злаков из недозрелых зародышей с целью получения форм, устойчивых к кислым почвам с токсическим действием алюминия (в мг/л):

Среда I (для инициации каллуса): макро- и микросоли по Иурасиге и Скугу; сахароза 20000-30000; агар-агар

6000-7000; желатин 3400-3600; витамины по В . тиамин 1-10; миоинозитол

80-100, пиридоксин - НС1 0,5-1; нико-, тиновая кислота 0,5"1; дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4Д) 2-3; А1 + 7-9; ,lKA1(SOg) .1."-Н О 140-1807.

Среда II (для получения регенеран,тов из каллуса): макро- и микросоли по Иурасиге и Скугу; сахароза 2000030000; агар-агар 6000-7000; желатин

3400-3600, витамины по В : тиамин

1-10; о - нафтилуксусная кислота (АНУ)

О, 5-1; ки нетин О, 5-1; А1 7-9;

ГКА1(SOg) 12Н 0 140-1803

Для обоих сред устанавливается три значения рН: рН,4,8 (готовой среды), рН 3,75 (перед автоклавированием); рН 4,1 (готовой среды), рН 3,0 (перед автоклавированием); рН 3,8 (готовой среды), рН 2,7 (перед автоклавированием) .

Пример 1 (контроль). Проводят культивирование незрелых зародышей ячменя на питательной среде следующего состава, в мг/л: макро- и микросоли по Иурасиге и Скугу; сахароза

30000; агар-агар 7000; витамины по

В . тиамин 10, миоинозитол 100; пиридоксин — НС1 1, никотиновая кислота

1; 2,4Д 3,0 (среда I для инициации каллуса) или АНУ и кинетин по 1,0 (среда II для регенерации), рН 5,8=

=6, О.

На среду Т высаживают незрелые зародыши 6 селекционных образцов ячменя щитком вверх в возрасте 10-14 дней после опыления. Высаживают по 30 пробирок каждого образца по 8 зародышей в одной пробирке - всего 240 зародышей каждого образца. Через 710 дней визуально на поверхности щит5

15 ка отмечают образование каллуса и его последующее нарастание. В зависимости от генотипа процент образования каллуса составляет 37,3-75,5"ь.

Каллусы находятся на этой среде до появления плотных участков — меристематических очагов, после чего плотные участки переносят на среду для регенерации 11, на которой иэ них в течение 4-8 недель образовываются проростки, в зависимости от генотипа в 11-314 случаев; Оставшийся после переноса плотных участков на среду

1Т каллус пересаживают на среду I для дальнейшего нарастания каллуса и формирования в нем новых меристематических зон.

Возможно культивирование незрелых зародышей ячменя на питательной среде Мурасиге и Скуга со следующим содержанием добавок, мг/л: сахароза

20000; агар-агар - 6000; витамины: тиамин 1; миоинозитол 80; пиридоксин — НС1 0,5; никотиновая кислота

0,5; 2,4Д 2 (для инициации каллуса) или АНУ и кинетин по 0,5 (для регенерации); рН 5,8-6,0.

На этих средах получены результаты, аналогичные вышеприведенным, с той разницей, что при уменьшении количества 2,4Д с 3 до 2 мг/л происходи ускорение во времени заложения меристематических эон. Эти данные дают возможность работать с селективными средами, в основе которых лежит среда следующего состава, мг/л: макро-и микросоли по Иурасиге и Скугу; сахароза 30000; агар-агар 7000, витамины по В : тиамин 10; миоинозитол

100; пиридоксин - НС1 1; никотиновая кислота 1; 2,4Д 2 (среда для инициации каллуса) или РНУ 0,5; кинетин 1.

46483

Эту среду в дальнейшем называют основной. На основную среду накладываются предлагаемые факторы: И и желатин при разных значениях рН.

Пример 2. Проводят культивирование незрелых зародышей ячменя на кислой селективной среде I с токсическим действием алюминия следующего состава, мг/л: основная среда, желатин 3600; А1 + 9; рН 4,8 (готовой среды); рН 3,75 (перед автоклавированием).

На эту среду высаживают незрелые зародыши тех же 6 селекционных образцов ячменя щитком вверх в воэрасте 10-14 дней после опыления в количестве около 240 зародышей каждого образца. В зависимости от генотипа процент образования каллуса составляет

15-703, что несколько ниже контроля.

Процент заложения меристематических зон снизился по сравнению с контролем в 2 раза и более и составил 4-163, что свидетельствует о токсичности селективной среды с содержанием Al npu рН 4,8.

Не было получено принципиальных отличий по выходу каллуса и меристематических зон при культивировании зародышей на основной среде с содержанием желатина 3400 мг/л, А1 7 мг/л при рН 4,8. Поэтому для проведения третьего и четвертого эксперимента было взято в дополнение к основной среде, мг/л: желатин 3500; Al3 8. Условия третьего и четвертого экспериментов были изменены за счет понижения рН среды.

Пример 3. Посадку зародышей и их культивирование осуществляют по схеме примера 2 на среде следующего состава, мг/л: основная среда; желатин 3500; Al + 8; рН 4,1 (готовой среды); рН 3,0 (перед автоклавированием) .

Как видно из вышеизложенного (с. 5), понижение рН увеличивает количество Al 4 в среде, следовательно, повышает ее токсичность. При рН

4,1 среда с содержанием агар-агара и желатина не плотный нель, ио застудневает;

На селективной среде примера 3 получено в зависимости от генотипа при работе на тех же селекционных образцах: каллусов от числа посаженных зародышей 5,2-27,83, каллусов с меристематическими зонами 0,9-6,23, т.е. имеет место дальнейшее понижение процента выхода продукции.

Пример 4. Посадку зародышей и их культивирование осуществляют по схеме примера 2, рН сред составляет

3,8. Эти среды желеобразны и для удобства работы на поверхность их кладут диск фильтровальной бумаги.

На селективной среде примера 4 получено каллусов от числа посаженных зародышей 1,5-23>, каллусов с меристематическими зонами 0,4-2,91. Кроме низкого заложения меристематических зон токсичность сред примера 4 проявляется также в быстром потемнении и

1546483 формула и 3 о б р е т е н и я ь В. Демкин

Корректор О. Ципле

Редактор И, Киштулинец

Техред А.Кравчук

Заказ 56 Тираж 484 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г,ужгород, ул.Гагарина, 101 отмирании каллусной ткани. Кроме того, при потемнении каллусной ткани ее сразу не выкидывают, так как плотные (меристематические) участки обна5 руживают иногда и на таком каллусе (очевидно, из более устойчивых клеток). В случаях, когда после заложения меристематических очагов или проростков на среде с рН 3,8 они оста- 10 навливаются в росте и развитии, их пересаживают на среды с рН 4,0-4,1 и выше (т.е. на среды с менее жестким режимом).

Дальнейшее понижение РН питатель- 15 ных сред нецелесообразно..

Проростки, полученные на селективных средах примеров 2-4, отсаживают на обычную среду для ускорения и после достижения регенерантами фазы 2-4 20 листьев высаживают из пробирок сначала в горшочки с землей, а затем в поле, где они завязывают зерно.

Всего от 6 селекционных образцов ячменя получено на селективных средах 91 линия, в том числе на среде с. РН 4,8 41, с РН 4,1 29, с рН 3,8

24..

Пример 5. Посадку зародышей и их культивирование осуществляют З0 по схеме примера 2. В качестве исходного материала берут зародыши от растений-регенерантов, полученных из каллусной ткани на среде с рН 4,8 (т.е. Производится повторная посадка 35 на селективную среду).

В эксперименте 5 на среде с рН

3,8 получено от тех же селекционных образцов ячменя каллусов от числа посаженных зародышей 18 -69,33, каллу- 40 сов с меристематическими зонами 1,2193. Линий ячменя в грунте 92. Этот эксперимент свидетельствует,о том, что повторное культивирование на селективных средах ведет к повышению 45 устойчивости материала.

Предлагаемые среды дают возможность в короткий срок (2,5-10 мес) отобрать каллусы способные формировать в жестI

У сп

Составител ких условиях эксперимента очаги меристемы с последующей регенерацией из них растений, т.е. более устойчивые к данным условиям, в то время, как менее устойчивые погибают на том или ином этапе эксперимента. Тем самым в 5-10 раз сокращается объем работ по оценке растений ин вива и значительно повышается возможность отбора устойчивых форм.

Предлагаемые среды с учетом поправок, вносимых в зависимости от сортовой специфики, могут быть использованы в работе с другими злаковыми сельскохозяйственными культурами.

Способ получения растений-регенерантов Hordeum vulgare, устойчивых к токсическому действию Al" в кислой среде, включающий культивирование незрелых зародышей и получение из них регенерантов на питательной среде, минеральной основой которой является среда Мурасиге и Скуга, содержащей дополнительно, мг/л:

Сахароза 20000-30000

Тиамин 1-10

Миоинозитол 80" 100

Пиридоксин-НС1 0 5

Никотиновая кислота 0,5-1,0

Дихлорфенилуксусная кислота 2 3 или с1-нафтилуксусная кислота и кинетин по 0,5-1,0

Агар-агар 6000-7000 отличающийся тем, что, с целью повышения выхода устойчивых

;растений, в среду дополнительно вводят алюминий в виде алюмокалиевых или алюмоаммонийных квасцов в количестве

7-9 мг/л, желатин в количестве 34003600 мг/л для создания желеобразной консистенции среды, устанавливая рН среды 4,8-3,8 соляной или серной кислотой.