Способ получения окрашенного субстрата для определения полигалактуроназной активности

 

Изобретение относится к энзимологии, микробиологии, микробиологической и пищевой промышленности, а именно к способам определения активности ферментов. Цель изобретения - удешевление субстрата, сокращение длительности и упрощение процесса получения субстрата. Способ осуществляют путем окрашивания пектинового вещества активным красителем винилсульфонового ряда (активный ярко-оранжевый ЖТ, Ремазол ярко-синий Р и др.) в количестве 50-500% от массы пектинового вещества при 30-80°С в присутствии мочевины в концентрации 0,5-8 М в реакционной смеси. 2 з.п.ф-лы, 1 ил., 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

09) И1) (51)5 С 12 1/34

1 4

- — -1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPblTHRM

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4416362/30-13 (22) 26.04.88 (46) 15.07.90. Бюл. Ю 26 (71.) Научно-производственное объединение "фермент" (72) В. Б. Герасимас, P.Þ. Са ви цкене, l0.l0. Степонавичюс и Г.И. Денис (53) 543 .9(088 .8) (56) Авторское свидетельство СССР

1l 12058, кл. С 12 11 9/36, 1983.

Friend D.R., Chang С.M. Simple Dye

Release Assay for Determining Endopectinase activity. — J. Agric. Food.:

Chem., 1982, 30, р. 982-985 ..

Изобретение относится к энзимологии, ми кроби ологии, ми кробиологич ес-кой и пищевой промышленности, а именно к способам определения активности ферментов.

Цель изобретения " удешевление субстрата, сокращение длительности и упрощение процесса получения окрашенного пектинового вещества.

Окрашенный субстрат согласно изобретению получают путем окраши ва ния пектинового вещества (пектин, пек" товая кислота) с последующим осажде. нием целевого продукта и его отделением от несвязанного красителя многократным вымыванием органическим рас" творителем. В качестве красителя ис2 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОКРАШЕННОГО СУБСТРАТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ (57) Изобретение относится к знзимологии, микробиологической и пищевой промышленности, а именно к способам определения активности ферментов. Цель изобретения - удешевление субстрата, сокращение длительности и упрощение процесса субстрата. Способ осуществля ют и ут ем о кра ши ва ни я пе кти нового вещества активным красителем винил" сульфонового ряда (активный ярко-оранжевый ЖТ, Ремазол ярко-синий Р и др.) в количестве 50-500 от массы пектино0 вого вещества при 30-80 С в присутст" а

® вии мочевины в концентрации 0,5"8 И в реакционной смеси. 2 з.п. ф-лы,1 ил, 1 табл.

С пользуют активный краситель винилсул ьфонового ряда (а ктивный Rp Ko»îðàíжевый ЖТ, Ремазол ярко-синий P) в количестве 50-5003 от массы пектиноаого вещества, а окрашивание осуществляют при 30-80 C e присутствии мочевины в концентрации О, 5-8 М в реакционной смеси при рН 11,0-11,5, При мене ни е а кти в ног о ви нилс ул ьфо" нового красителя в присутствии моче" вины для окрашивания пектина позволяет проводит ь процесс окра шива ния за

О, 25-1 ч. Это объясняется тем, что а кти вные ви нилсул ьфоновые группы красителя непосредственно образуют ковалентные связи с гидроксильными группами пектина в щелочной среде в!

98

4 новой кислоты (полигала ктуроновая кислота) фирмы "Serva", 240 г (8М) мочевины и 70 г (5003) активного красителя Ремазола ярко-синего P. Полученную реа кционную смес ь нагревают на водяной бане до 80 С и инкубируют 1 ч, после чего доводят рН среды до 11,3

0,1 н раствором едкого натра и перемешивают при той же температуре 1 ч.

Далее выделение продукта и его отмывку проводят так же, как в примере 1.

Получают 10 г окрашенного субстрата в виде синего порошка, растворимого в воде. Коэффициент экстинкции li-ного раствора Е = 5,6.

Пример 6. Определение полигала кт урона зной а кти вности .

В две пробирки наливают по 4 см

13-ного раствора субстрата в 0,1 М а цетат ном буфере, р Н 4, 5 и термостао тируют 5 мин при 40 С. В одну пробир" з ку приливают 1 см ферментного раствора пектиназы из А. niger фирмы

"Ser a" с концентрацией 0,1 мг/см или полигалактуроназы из Zygofabospo

ra marxiana 848 с концентрацией

0,75 мг/см, в другую " 1 см буфера з (контроль) и инкубируют при 40 С в течение 20 мин, после чего в каждую пробирку добавляют 5 см этанола.

Реакционную смесь взбалтывают и фильтруют через бумажный Фильтр (красная лента) . Измеряют оптическую плотность полученного фильтрата против контрольной пробы при длине волны 490 или

595 нм (в случае субстрата, полученного по примеру 3) . Полигалактуроназную активность (ПГА) определяют по формуле

1578 присутствии мочевины. Поскольку окрашивание пектина винилсульфоновым красителем осуществляют в сильнощелочной, среде (рН 11,5) в присутствии мочевины, способ позволяет исключить гомо" з генизацию пектина перед окрашиванием.

Изобретение иллюстрируется примераМи.

Пример 1. К 500 мл дистилли- !О рованной воды при перемешивании небольшими порциями добавляют 14 г цитрусового пектина, 15 r мочевины (О, 5 М) и 7 r (503) активного красителя ярко"оранжевого ЖТ. Полученную реа кционную смес ь нагревают на водяной бане до 50 С и инкубируют 1 ч„ после чего доводят рН среды до 11, 5.

0,1 н. раствором ецкого натра и перемешивают при той же температуре

0,25 ч. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и выпивают в 1000 мл ацетона. Образовашийся желеобра зный осадок пер емеши sa ют 20 ми н и отжимают через капроновую ткань. 25

Массу отжатого продукта зали вают

1000 см 503-ного раствора ацетона (по объему), перемешивают при комнат" ной температуре в течение 30 мин, осадок продукта отстаивают в течение

20 мин, надосадочную жидкость сливаЗО ют, а продукт отжимают через капроновую ткань. Отмывку несвязанного красителя повторяют еще 5-6 раз, после чего промывают окрашенный продукт ацетоном,и высушивают в сушильном шка-З фу при 70 С в течение 10 ч. Получают о

10 r субстрата в виде оранжевого порошка,. хорошо растворимого в воде.

Коэффициент экстинкции 17. -ного раствора субстрата Е = 3,9.

Пример 2. При перемешивании маленькими порциями добавляют в

500 см дистиллированной воды 14 г

3 свекловичного пектина, 150 r (3М) мочевины и 28 г (200/) активного красителя ярко"оранжевого ЖТ. Полученную реакционную смесь нагревают на водяной бане до 65 С и инкубируют 1 ч, после чего доводят рН среды до 11,0

0 1 н. раствором едкого натра и пере- 50 мешивают при той н<е температуре 0,5 ч.

Осаждение окрашенного продукта и от" мывку несвязанного красителя проводят так же, как в примере 1. Получают

10 г субстрата Коэффициент экстинкции у !

13."ного раствора субстрата Е4 = 6, О.

Пример 3. При перемешивании маленькими порциями в 500 см дистиллированной воды добавляют 14 г пектоПГА = — — - 1000

D V

m-t

Э где Р— оптическая плотность фильтрата;

V — объем реакционной смеси, см (5 см ); с — вр емя гидролиза, мин (20 мин);

m — коли чест во фермент ного препарата, взят ог о для а нали за, мг, 1000 - коэффициент пересчета ферментативной активности на г препарата .

За единицу ПГА принимают такое количество фермента, которое за 1 мин приводит к увеличению оптической плотности фильтрата реакционной смеси на одну оптическую единицу, I

В таблице приведены данные, свидетельствующие о пригодности субстра5

1578198 б тов, полученных согласно способу, для страта, коэффициент экстинкции 1 -но" определения полигалактуроназной актив- го раствора Е = 5 9.

535 н 1СтИ .

Формула изобретения

4/o

Е 49с или

10I0

Оптическая плот нос т ь фил ьтрата

ПГА, усл.ед./г Препарат фермента. Субстрат

По примеру 1

Пекти на за и з

Asp. niger

550

0,22

0,52

0,49 а, 17

0,39

0,35

3,9

6,0

5,6

56

116 фирмы "Serva"

Полигала ктурона за из Zygofabospora

marxiana 848

3,9

6,0

5,6

По примеру 1

На чертеже показана зависимость скорости гидролиза окрашенного пектина, полученного по примеру 2, .от концент ра ции фермент ного раст вора пек" тиназы из А.nigel Эту зависимость определяли по описанной методике определения полигалактуроназной активности. Как видно из чертежа прямолинейная зависимость оптической плотности (4So ) от концентрации фермента сохраняется до 0,6 оптической плотно" сти и обеспечивает вполне достаточный интервал для определения полигалактуроназной активности.

Пример 4. Окрашивание цитру- 20 сового пектина активным красно-коричневым РКТ, осаждение продукта и от" мывку несвязанного красителя прово" дят аналогично примеру 3. Получа1от

10 r субстрата. Коэффициент экстинкции 14-ного раствора Е54 = 6,4.

Пример 5. Окрашивание цитрусового пектина активным бордо 4СТ и вьделение продукта проводят так же, как в примере 2. Получают 10 г cy6"

1. Способ получения окрашенного субстрата для определения полигалактуроназной активности, включающий ковалент ное присоеди нение к пекти новому веществу азокрасителя с после" дующим вьделением целевого продукта путем осаждения и отделением несвязанного красителя, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью удешевления субстрата, сокращения длительности и упрощения процесса, в качест ве красителя используют а кти вный краситель винилсульфонового ряда, взятый в количестве 50-500 ; от массы пе кти нового вещест ва, а окра ши ва ние осуществляют в присутствии мочевины при рН 11«11,5.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что применяют мочевину в концентра ции О, 5-8, 0 М.

3. Способпоп. 1, отлича юшийся тем, что окрашивание ведут при 50-80 С.

1578198

О/

О. 15 кани ф риеита

hf/ /ebf3

Составитель А. Семенов

Редактор А, Каковская Техред М.Дидык Корректор Л.Бескид .

Заказ 1892 Тираж 488 Подпис ное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 415

У

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина,101