Способ культивирования ресничных простейших

 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для культивирования простейших р. Colpoda, а также для очистки производных сточных вод, содержащих этиленгликоль и диэтаноламин. Целью изобретения является упрощение способа и обеспечение выращивания чистой культуры простейших р. Colpoda. В питательную среду культивирования простейших вносят этиленгликоль и диэтаноламин в концентрации 300 - 600 мг/л. В качестве микроорганизмов используют бактерии р. Arthrobacter и Pseudomonas. 2 табл.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для культивирования простейших, в частности, рода Colpoda, а также для микробиологической очистки производственных сточных вод, содержащих этиленгликоль и диэтаноламин. Целью изобретения является упрощение способа и обеспечение выращивания чистой культуры простейших P. Colpoda. Цель достигается тем, что согласно заявляемому способу культивирования ресничных простейших на искусственной питательной среде с подкормкой бактериями, в среду вносят этиленгликоль и/или диэтаноламин в количестве 300-600 мг/л, а из бактерий используют ассоциацию бактерий родов Arthrobacter и Pseudomonas. Установлено, что при концентрации 300-600 мг/л ЭГ и/или ДЭА в питательной среде из всех видов простейших сложного биоценоза активного ила (в случае его использования в качестве источника простейших р. Соlpoda) выживают только простейшие р. Colpoda. Таким образом, поддержание концентрации ЭГ и/или ДЭА в питательной среде в диапазоне 300-600 мг/л обеспечивает ее стерильность, так как в таких условиях могут развиваться только простейшие р. Соlpoda. Бактерии р. Arthrobacter представляют собой подвижные палочки (на 3-и сутки кокки), имеют положительную окраску по Граму, ферментируют лактозу, ксилозу, фруктозу, образуют сероводород и аммиак, дают хороший рост на 2% -ном растворе хлористого натрия и 7% -ном растворе глицерина. Бактерии р. Pseudomonas представляют собой прямые, одиночные подвижные палочки, спор не образуют, грамотрицательные, ферментируют глюкозу, сахарозу, лактозу, образуют аммиак, сероводород не образуют. Внесение в искусственную среду ЭГ и ДЭА и бактерий-деструкторов этих веществ позволяет упростить способ культивирования ресничных простейших р. Colpoda. Потребление ЭГ и ДЭА бактериями и их размножение обеспечивает наличие подкормки для простейших на всем протяжении их культивирования, что исключает необходимость выполнения трудоемких, длительность операций по выращиванию бактерий специально для этих целей и их периодическому внесению в питательную среду для простейших. Использование в качестве источника ЭГ и ДЭА гликолеаминовых стоков позволяют одновременно подвергать очистке данный вид стоков, причем как от их загрязнений, так и от взвешенных веществ (бактерий, усваивающих эти загрязнения, т. е. простейшие р. Colpoda в данном случае выполняют функцию биологических фильтратов микробиологически очищенных стоков, образуя трофический уровень с бактериями - "хищник-жертва". Cпособ осуществляют следующим образом. Готовят минеральную питательную среду, вносят в нее источник углерода ЭГ и/или ДЭА в количестве 300-600 мг/л. В подготовленную среду вносят бактерии Arthrobacter и Pseudomonas в количестве не менее 10⁸ кл/мл простейшие р. Сolpoda в количестве не менее 10 кл/мл (чистые культуры). В случае отсутствия возможности внесения чистых культур микроорганизмов предварительно готовят соответствующие культуры накопления. Источником бактерий Arthrobacter и Pseudomonas а также простейших р. Colpoda может служить биоценоз активного илa очистных сооружений. Для получения культуры накопления бактерий и простейших активный ил подвергают длительному воздействию ЭГ и/или ДЭА в концентрации 3000-5000 мг/л для бактерий и 300-600 мг/л для простейших. После внесения бактерий и простейших в среду производят культивирование простейших р. Colpoda при 25-30^оС, рН 7,5-8,5, и поддержании концентрации ЭГ и/или ДЭА в диапазоне 300-600 мг/л. П р и м е р 1. В лабораторных условиях получали накопительную культуру простейших р. Colpoda. В качестве источника накопительной культуры использовали активный ил биологических очистных сооружений газоперерабатывающего завода, который содержит простейшие 10 различных родов: Colpoda (1,6 ˙ 10³ кл/мл), Euplotes (1,3 ˙ 10³ кл/мл), Aspidisca (3,7 ˙ 10³ кл/мл), Vorticella мелкая (87,3 ˙ 10³ кл/мл), Vorticella крупная (11,5 ˙ 10^-3 мл/мл), Dpercularia (59,0 ˙ 10³ кл/мл), Сarchesium (25,3 ˙ 10³ кл/мл), Epistylis (19,3 ˙ 10³ кл/мл), Lionotus (1,6 ˙ 10³ кл/мл); Dicomonas (1,2 ˙ 10³ кл/мл). Бактериальный состав активного ила представлен р. р. Bacillus, Pseudomonas, Bacterium, Arthrobacter, Micrococcus, Sarcina. Культивирование микроорганизмов вели в ферментере объемом 3 л. Температуру процесса поддерживали в интервале 25-30^оС, рН 7,5-8,5. Расход воздуха 1 л/ч, что обеспечивало поддержание растворенного кислорода в виде не менее 5-7 мг/л. Для культивирования простейших р. Colpoda готовили искусственную минеральную среду следующего состава, мг/л: KCl 20; Na₂HPO₄ ˙ 2H₂O, 400; MgCl ˙ 6H₂O 20; MnSO₄ ˙ 5H₂O 10; FeSO₄ ˙ 7H₂O 10; CaCl₂ 10; NH₄Cl 300 (вносили в среду, если в качестве источника углерода и энергии для бактерий использовали ЭГ). В качестве источника углерода и энергии использовали органическое вещество ЭГ и/или ДЭА в количестве 300-600 мг/л. Результаты опытов сравнивали по видовому составу простейших по истечении 4; 8 и 12 ч культивирования путем подсчета видов под микроскопом и камере Горяева. Результаты эксперимента приведены в табл. 1. Данные, приведенные в табл. 1, показывают, что при внесении в ферментер искусственной среды, бактерий-деструкторов ЭГ и ДЭА, активного ила БОС ОГПЗ и поддержании оптимальной концентрации этих веществ 300-600 мг/л, в среде из 10 видов простейших активного ила через 12 ч остается один р. Соlpoda. П р и м е р 2. В лабораторных условиях производили культивирование простейших р. Colpoda на минеральной питательной среде состава, приведенного в примере 1, с добавлением ЭГ и/или ДЭА в количестве 100-1000 мг/л. Культивирование вели непрерывным способом в ферментере с поддержанием условия, описанных в примере 1. Вносили культуру накопления бактерий с исходной плотностью 10⁸ мл/мл и простейших р. Colpoda в количестве 10 кл/мл. Концентрацию органических веществ в ферментере поддерживали на заданном уровне при изменении двух параметров процесса исходной концентрации в питательной среде и скорости разбавления. Размножение простейших фиксировали через 6-8 ч. Результаты опытов сравнивали по количественному учету простейших при различных концентрациях ЭГ и/или ДЭА. Результаты приведены в табл. 2. Как показали исследования, оптимальным количеством органических веществ для развития ресничных простейших р. Colpoda является 600-300 мг/л. Введение ЭГ и/или ДЭА при общем содержании выше 600 мг/л приводит к гибели простейших р. Colpoda, так как высокая концентрация является токсичной. Кроме того, при концентрации этих веществ более 600 мг/л в среде развиваются жгутиковые формы простейших. Введение ЭГ и/или ДЭА в меньшем количестве, чем 300 мг/л приводит к развитию простейших р. р. Lionotus и Amphileptus, простейшие р. Colpoda цистируются. Данные, приведенные в табл. 2 показывают, что в диапазоне концентраций веществ 600-300 мг/л, создаются как бы "стерильные" условия для развития ресничных простейших р. Colpoda (отсутствуют другие виды микроорганизмов), что дает возможность получать чистую культуру этих простейших. П р и м е р 3. В лабораторных условиях для культивирования ресничных простейших р. Colpoda использовали гликолеаминовые сточные воды. Сточные воды установок регенерации ЭГ имеют следующий состав, мг/л: ЭГ 2000-5000 К⁺ 100-3400 Mg²⁺ 140-390 Zn²⁺ 0,1-10 Fe²⁺ 0,6-31 Mn²⁺ 1-5 Ca²⁺ 8-10 MH₄⁺ 3-5 PO₄³ 0,1-0,5 NO₂ 0,06-0,1 SO₄^2- 80-96 pH стоков 8-8,5 Диэтаноламиновые сточные воды установок сероочистки природного газа ОГПЗ имеют следующий состав, мг/л: ДЭА 1000 Mg²⁺ 300-460 Zn²⁺ 0,2-1 Fe²⁺ 1/5 Mn²⁺ 2,3-8,4 K⁺ 100-200 рН стоков 8,9-10,1 При культивировании простейших р. Colpoda в ферментер вносили разбавленные водопроводной водой сточные воды до оптимального содержания ЭГ и ДЭА, а также вносили бактерии и простейшие аналогично примеру 2. Для поддержания в ферменте оптимальной концентрации ЭГ и ДЭА постоянно подавали сточные воды. Результаты эксперимента соответствуют данным табл. 2. Одновременно в процессе культивирования простейших р. Colpoda сточные воды подвергаются очистке как от этих загрязнений, так и от взвешенных веществ (бактерий). Таким образом, простейшие р. Colpoda в данном случае выполняет функцию биологических фильтратов, так как создается трофический уровень, где отношения между микроорганизмами носят характер "хищник-жертва" Хищниками в этом сообществе являются ресничные простейшие р. Colpoda, а жертвой бактерии-деструкторы. Предлагаемый способ культивирования простейших более прост по сравнению с известным способом. Упрощение процесса достигается внесением в искусственную среду ЭГ и ДЭА и бактерий-деструкторов этих веществ. Потребление ЭГ и ДЭА бактериями и их размножение позволяют обеспечить наличие подкормки для простейших на всем протяжении культивирования, что исключает необходимость выполнения трудоемких длительных операций по выращиванию бактерий специально для этих целей и их периодическому внесению в питательную среду для простейших, а поддержание концентрации ЭГ и ДЭА в диапазоне 300-600 мг/л обеспечивает стерильные для простейших р. Colpoda условия и получение чистой культуры без соблюдения специальных мер. (56) Авторское свидетельство СССР N 1367480, кл. С 12 N 1/00, 1985. Авторское свидетельство СССР N 1269439, кл. С 02 F 3/34, 1983. Авторское свидетельство СССР N 1336454, кл. С 02 F 3/34, 1984. Гроздов А. О. и др. Биотестирование токсичности природных и сточных вод с помощью культуры простейших. - Гидробиологический журнал, 1981, т. 17, N 4, с. 69-74.

Формула изобретения

СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РЕСНИЧНЫХ ПРОСТЕЙШИХ, предусматривающий внесение в питательную среду, содержащую минеральные вещества, культуры простейших и микроорганизмов, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и обеспечения выращивания чистой культуры простейших, p. Colpoda в питательную среду дополнительно вносят этиленглиголь и/или диэтаноламин в концентрации 300 - 600 мг/л, а в качестве микроорганизмов используют бактерии родов Arthrobacter и Pseudomonus.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2