Штамм стрептомицета sтrертомyсеs снrомоfusсus - продуцент биотинсвязывающего белка

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU., 164361 (gg)g. C 12 N 15/81

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ф (,", !

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР

Н ASTOPCklGMV СВЮ»1Т»ЪСТВУ (21) 4601599/13 (22) 04,11 88 (46) 23 04 ° 91 Бюл, Р 15 (71) Всесоюзный научно-исследовательский технологический институт антибиотиков и ферментов медицинского назначения и Институт цитологии

АН СССР (72) .А„П, Кашкин,:O,В,Аак, H A,Êîð÷àãèíà, IО,Е„Конев, К„И.Галактионов, . В Г.Демин

- и:10,А»Лазебник (53) 612 017 1-064(088,8) (56) Archives of Biochemistry and

Biophysics, 1964, v. 106, р» 1 5» .(54) ШТАММ СТРЕПТОМИЦЕТА STREPTOMYCES, CHRONOFUSCUS - ПРОДУЦЕНТ БИОТИНСВЯ

ЗЫВА10ЩЕГО БЕЛКА (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть и спольз о вано при проведении иммуноферментного

Изобретение относится к биотехно« логии и может быть использовано при проведении иммуноферментного и имму нофлуоресцентного анализа в иммуноло. гии, медицине и клеточной биологии

Целью изобретения является повышение продуктивности штамма, Штамм S treptomyces chromofuscus

Т 200 выделен из почв Ленинградской области в ходе скрийинга микробных . продуцентов биотинсвязывающих белков

Штамм хранится во Всесоюзной коллек.. ции микроорганизмов под номером

ВКПМ Ас-1268Д.

2 и иммунофлуоресцентного анализа в иммунологии, медицине и биологии, Целью изобретения является повышение продуктивности штамма ° Штамм Streptomyces chromofuscus выделен из почв

Ленинградской области в ходе скрининга микробных продуцентов биотинсвяA эывающих белков» Штамм синтезирует биотинсвязывающий белок, концентра ция которого в культуральной жидкоСти составляет 6 мг/л, не токсичен, не патогенен, гидролизует молоко, разжижает желатину, на клетчатке не растет, на среде Придхэма- Готглиба, растет в присутствии арабинозы, оси" лозы, глюкозы, рамнозы, фруктозы, маннита, т-инозита» Не растет на сре де с сахарозой и рафинозой Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов под номером BKIIM

Ас 1268Д, ! Штамм характеризуется следующими признаками °

Культурально-морфологические при знаки, Спороносцы спиральные, распо» ложены моноподиально и в виде кистей, Споры овальные с гладкой оболочкой

Агар Чапека с крахмалом Воздушный: жцелий серый, по краям колонйй бе лый„Субстратный мицелий светло се рый, Раствориыах пигментов нет, Глицерин-аспарагиновый агар» Воздушный мицелий светло .серый, беловатый Субстравный мицелий буроватый °

Растворимых пигментов нет.

16436 10!

О !

20

40

Крахмально-аммиачный агар, Воз душный мицелий сероватый, Субстратный мицелий желтовато-серый Раство. римых пигментов нет, 5

Органическая среда 2 ° Воздушный мицелий белый, Субстратный мицелий буроватый, Растворимый бурый пигмент образует слабо, Физиологобиохимические признаки, Меланоидные пйгменты образует слабо, Молоко пептоннзирует, желатину раз жижает, На клетчатке не растет, На среде Придхэма-Готтлиба растет в присутствии арабинозы, глюкозы, кси лозы, рамнозы, фруктозы, маннита, инозита. Не растет на среде с сахароз ой, рафино зой, Штамм не относится к микроорганизмам, обладающим патогенным дейст вием

Пример 1, Штамм Strep. chromofuscus Т-200 выращивают в фермен таторе объемом 40 л с барботажем и постоянным перемешиванием в течение

5 сут при 28+2 С на питательной сре» де следующего состава, масЖ:

Глюкоз а 5 (МН4) So4 0,6

МКЯО4 0,02

КС1 0,2

CaCO.g 0,8

КН Р04 0,04

Для приготовления посевного материала используют косяки с агаризиро ванной средой следующего состава, мас.%:

Кукуруз ный э кстракт 0,5

Крахмал нера ст вор и мый 1,0 (Ю4) 804 0,3

CaCOq 0,3

Агар 2,5 .инкубированные в течение 48 ч при

28+2 Са

IIo окончании ферментации культу ральную жидкость фильтруют, натив ый раствор, освобожденный от мице лия, концентрируют примерно в 10 раз на ультрафильтрациониой установке с использованием мембраны Рипор 4 120 ° .

Далее 0,56 л концентрата используют для выделения биотинсвязывающего белка (БСБ).

На первой стадии проводят высали ванне 70%-ным сульфатом аммония, выпавший осадок отделяют оч надосадоч ной жидкости центрифугированием

15000 g при 4 С и ресуспендируют в

60 мл дистиллированной воды. Полученный раствор днализуют против дистиллированной воды, Диализат центрифугируют при 15000 g 30 мин, Супер» натант используют для окончательной очистки биотинсвязывающего белка методом аффинной хроматографии на имн нобиотинаг ароз е

Хроматографию проводят следующим образом, Колонку, наполненную 1 мл иминобиотин-агарозы, уравновешивают

1О мл буферного раствора, содержащего 0,05 M Na

11,О (буфер 1). К белковому препарату добавляют 0,1 o6„10-кратного концентрата буфера 1, после чего 9 мл полученного раствора пропускают че рез колонку со скоростью 1 мл/мин

После нанесения сорбент промывают

20 мл буфера I Элюцию проводят

4 мл 0,05 М ацетатного буфера, рН

4,0 (буфер II). По окончании элюции колонку промывают 20 мл буфера II и 20 мл буфера I, после чего цикл хроматографии повторяют. За 8 циклов выделения получено 34 мг белка, Та» ким образом содержание БСБ в культуральной жидкости составляет не менее

6 мг/л„Гомогенность полученного препарата определяют методом электрофореза в полиакриламидном геле, Чистота препарата выше 97%»

Белок, продуцируемый штаммом, идентифицирован как стрептавиднн на основании следующих данных: белок обладает биотинсвязывающей способностью; белок может быть BblpeJ, H методом аффинной хроматографии на иминобиотин-сефарозе при режиме, установ ленном для авидина и стрептавидина; молекулярная масса белка - 60 КД; субъединичное строение белка с моле» кулярной массой субъединицы 15 КД; коэффициент экстинкции 1%-ного раствбра белка равен 3;2 °

Пример .2 ° В лунки планшетов для иммуноферментного анализа вносят по 100 кг биотинилированных иммуноглобулинов кролика, растворенных в

0,1 М бикарбонате натрия. После 2 ч инкубации лунки промывают буфером, содержащим 20 мМ КН РО (рН 7,4), О, 1 5 М NaC1 и 0,05% твин-20 (буфер

III) и вносят БСБ в количестве 0,0011 мкг на лунку на I OO.ìêä буфера III.

Через 15 мин инкубации лунки промывают буфером III и вносят в них рас

1643610

Ф9рмула из об ретения

Штамм стрептомицета Streptorayces

chromofuscus BKIIM Ас-1268Д продуцент биотинсвязывающего белка °

Составитель Т Забойкина

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор О,Кравцова

Редактор. Н,Рогулич

Заказ 1221 Тираж 389 Подпи сно е

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

}13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óàãîðîä, ул. Гагарина, 101 вор биотинилированной пероксидазы в количестве 0,2 мкг на лунку, Через

15 мин инкубации планшет промывают буфером III и в лунки вносят по

50 мкл раствора о-фенилендиамина с концентрацией 1 мг/мп цитратного буфера, рН 4;5, Буфер содержит

-0,0123 Н О ° Экстинкцию раствора в лунках определяют на приборе "Иультискан", Параллельно все процедуры анапиза проводят с использованием вместо БСБ авидин» Сравнительные . результаты анализа показывают, что полученный иэ культуральной жидкости

БСБ пригоден для иммуноферментного анализа, причем рабочая концентрация БСБ в 8-10 раз ниже концентрации авидина

Таким образом, продуктивность штамма составляет 6 мг/л при низком уровне пигментообразования и накопления в культуральной жидкости бал ластных белков, что позволяет упростить процесс выделения конечного продукта, сократить продолжительность химической очистки и обеспечивает получение высокоочищенного биотинсвязывающего белка в иммунохимическом анализе, превосходящем авидин, получаемый из пищевого сырья