Способ выявления парвовируса свиней, рекомбинантная плазмидная днк ppv4, используемая в качестве гибридизационного зонда для выявления парвовируса свиней, и рекомбинантная плазмидная днк м13/ppv, используемая в качестве гибридизационного зонда для идентификации парвовируса свиней

 

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для выявления парвовируса свиней в пораженных плодах, отдельных органах и тканях. Цель изобретения состоит в повышении чувствительности и специфичности способа. Разработан способ выявления парвовируса свиней путем непрямой ДНК - ДНК гибридизации с использованием гибридизационных зондов. Сконструированы рекомбинантные ДНК на основе плазмиды PBR 322 и фага М 13, которые содержат фрагменты генома парвовируса свиней и служат гибридизационными зондами. 3 с.п.ф-лы.

СОЮЗ. СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s С 12 С 1/08, С 12 и 15/35

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4652512/13 . (22) 16,02.89 (46) 23.07.91. Бюл. N 27 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.P. Коваленко . (72) Г.Ф. Коромыслов, С.К. Артюшин и А.Д. Забережный (53) 577.2/048 (088.8) (56) Доклады ВАСХНИЛ, 1988, N 11, с. 2932. (54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПАРВОВИРУСА

СВИНЕЙ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPV 4, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ В КАЧЕСТВЕ ГИБРИДИЗАЦИОННОГО ЗОНДА

ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПАРВОВИРУСА СВИНЕЙ, И РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДИзобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для диагностики вирусных заболеваний сельскохозяйственных животных, генной инженерии, биотехнологии, микробиологической промышленности, в частности выявления парвовируса свиней, а также в практической и экспериментальной ветеринарии для идентификации парвовируса свиней в пораженных плодах, отдельных органах и тканях.

Цель изобретения — повышение чувствительности и специфичности способа.

Для этого 25 — 35%-ную суспензию исследуемой ткани, приготовленную на физрастворе. после денатурирования нуклеиновых кислот разводят в нескольких пробах от 10 до 100 раз в ячейках 96-луночной микроплаты для иммунологических исследований. B микрообьемы исследуемых,;„ЯЦ„„1664831 Al

НАЯ ДНК М13/PPV, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ В КАЧЕСТВЕ ГИБРИДИЗАЦИОННОГО ЗОНДА

ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАРВОВИРУСА

СВИНЕЙ (57) Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для выявления парвовируса свиней в пораженных плодах, отдельных органах и тканях. Цель изобретения состоит в повышении чувствительности и специфичности способа, Разработан способ выявления парвовируса свиней путем непрямой ДНК-ДНК гибридизации с использованием гибридизационных зондов, Сконструированы рекомбинантные ДНК на основе плазмиды pBR 322 и фага 322 и фага

М 13, которые содержат фрагменты генома парвовируса свиней и служат гибридизационными зондами. 3 с.п.ф-лы, образцов вносят меченую денатурированную ДНК гибридизационного зонда .. M13/PPV. В эти же пробы вносят нитроцеллюлозные мембраны в форме кружков диаметром 4 мм, к которым заранее пришивают

ДНК гибридизационного зонда pPV4. Гибридиза ци ю осу ществля ют 16-24 ч. Далее мембраны отмывают в течение 0,5 — 1 ч в ячейках. в которых проводят гибридизацию.

Подсчет радиоактивности мембран в сцинтилляционном счетчике позволяет получить результат в количественном выражении.

: Учет результата возможен в наглядной форме методом авторадиографии.

Пример 1, А) Выделение и очистка репликативной формы (РФ) ДНК парвовируса свиней.

РФ ДНК выделяют из зараженной вирусом культуры клеток почек поросят (линия

1664831

ППК), собирая клетки через 21 ч после заражения. Заражение проводят через 16 ч после пересева клеток, т.е. при формировании

50%-ного монослоя. Клетки отмывают в буфере, содержащем. 150 MM NaCI, 20 мМ трис-НС1, рН 7,5, 10 мМ ЭДТА, и ресуспендируют в этом буфере до плотности 2 х х 10 кл./мл, Суспензию клеенок смешивают с равным обьемом указанного буфера, содержащего 1,2% ДС вЂ” Na и мягко перемешивают до образования однородного лизата.

Объем лизата в расчете на биомассу с 2,5 л культуральной среды составляет 40 мл. К лизату добавляют протеиназу К до концентрации 250 мкг/мл и инкубируют 2 ч при

37 С. Затем к лизату добавляют NaCI до концетрации 1 М, охлаждают во льду в течение 16 ч, центрифугируют при 12000 g в течение 30 мин, осадок отбрасывают, а из . надосадка собирают нуклеиновые кислоты путем путем добавления 2,5 обьемов холодного этанола и центрифугирования при

10000 g в течение 15 мин. Нуклеиновые кислоты растворяют в буфере ТЕ, содержащем

10 мМ трис-HCI, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, и экстрагируют раствор равным объемом смеси фенол: хлороформ. К водной фазе добавляют ацетат натрия до концентрации 0,3 М, собирают нуклеиновые кислоты добавлением 2,5 обьемов холодного этанола и центрифугированием при 10000 g в течение 10 мин, Нуклеиновые кислоты растворяют в 0,5 мл буфера ТЕ, добавляют РНК-азу до конечной концентрации 100 мкг/мл, после чего инкубируют 1 ч при 37 С, Раствор экстрагируют последовательно равными объемами фенола, смеси фенол: хлороформ и хлороформа.

Нуклеиновые кислоты собирают из водной фазы, как описано выше, и растворяют в буфере ТЕ. Данный препарат содержит ДНК репликативной формы парвовируса свиней, часть хромосомной ДН К клеток-хозяев и малые количества PНК.

Очистку РФ ДНК вируса проводят методом препаративного электрофореза с применением агарозных гелей с низкой температурой плавления.

Б) Клонирование фрагмента РФ ДНК парвовируса свиней в плазмидном векторе

pBR 322.

ДНК плазмиды pBR 322 (2 мкг) гидролизуют эндонуклеазной Ры I в 20 мкл буфера состава: 50 мМ NaCI, 10 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ MgClz, 1 мМ дитиотрейтол и 5 ед. фермента. Реакцию проводят в течение 1 ч при 37 С. Раствор экстрагируют равным обьемом фенола и переосаждают ДНК этанолом. Затем ДНК гидролизуют рестриктазой EcoRI в тех же условиях за исключением концентрации NaCI (100 MM), после чего по30

35 содержат плазмиды размером 6.8 т.п;и., а при гидролизе рестриктазами Pst I u EcoRI

25 вторяют фенольную экстракцию и переосаждение. Осадок ДНК растворяют в 20 мкл буфера ТЕ. Результат ферментативного расщепления проверяют при помощи электрофореза в 0,8% ном агарозном геле. При правильном расщеплении образуются фрагменты размерами 3,61 и 0,75 т.п.н, ДНК репликативной формы парвовируса свиней обрабатывают рестриктазами Pst

1 и EcoRI, как это описано выше для плазмидной ДНК.

Обработанные ДНК плазмиды и вируса объединяют по 0,5 мкг в буфере, содержащем 0,066 М трис-.НС1, рН 7,5, 5 мМ MgClz, 5 мМ дитиотрейтол. 1 мМ АТФ, и к раствору добавляют 1 ед. ДНК-лигазы фага Т4, Реакцию лигирования проводят в течение 16 ч при 15 С, Лигазную смесь используют для трансформации клеток Е.coll, Компетентные клетки Е.coll штамма С600 получают с использованем CaClz. Трансформацию проводят при 0 С в течение 40 мин, затем при 42 С в течение 10 мин. После трансформации клетки Е.coll инкубируют с аэрацией в жидкой среде LB при 37 С, затем высевают на агаризованную среду, содержащую 15,0 мкг/мл тетрациклина.

Выросшие колонии пересевают на среду, содержащую 50 мкг/мл ампициллина, и отбирают чувствительные колонии.

ДНК из отобранных клонов выделяют и исследуют рестриктазным анализом с последующим электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле. Отбирают клоны, которые образуют фрагменты размерами 3,6 и

3,2 т.п.н. Эти клоны используют в качестве продуцентов ДНК при pPVI. Эффективность штамма составляект 1 мг ДН К гибридизационного зонда на 1 л бактериальной культуры.

Пример 2, А) Выделение фрагмента генома парвовируса свиней из ДНК плазмиды pPVI и встраивание ее в ДНК плазмиды

pUC19.

ДНК плазмиды рРИ обрабатывают рестриктазами Pvu II и Pst1 в буфере, указанном в примере 1, Б, и в тех же условиях.

ДНК плазмиды pUC19 обрабатывают рестриктазами Pst l u Smal в буфере, содержащем 20 мМ KCI, 10 MM трис-HCI. рН 8,0, 10 MM M9CIz и 1 MM дитиотрейтола, После фенольной экстракции и переосаждения этанолом ДНК обоих плазмид смешивают в равных количествах и добавляют 1 ед. ДНК лигазы фага Т4 на 1 мкг ДНК.

Лигирование проводят аналогично примеру l.

1664831

Проводят трансформацию клеток Е.coll

jM-103; отбирают клоны, устойчивые к ампициллину и имеющие нарушенную активность Р -галактозидазы, выделяют плазмидную ДНК из 12 клонов и проводят ее расщепление рестриктазами Pstl u

EcoRI. Отбирают клоны, содержащие плазмидные ДНК, которые при данном анализе образуют фрагменты размерами 2,1 и 2,7 т.п.н. Данные клоны используют в качестве продуцентов ДНК pPV191.

Б) Выделение фрагмента ДНК парвовируса свиней из ДНК плазмиды pPV191 и встраивание ее в ДНК плазмиды pBR 322.

ДН К плазмиды pPV191 и РВВ322 обрабатывают рестриктазами Pst I и ECoRI, проводят фенольную экстракцию и переосаждение этанолом и лигирование, как описано в примере 1, После трансформации клеток Е,Coll С600 отбирают клоны, устойчивые к тетрациклину и чувствительные к ампициллину.

Выделяют ДНК плазмид из 12 клонов и tipoводят ее расщепление рестриктазами Pst I и EcoRI. Отбирают колонии, содержащие плазмидные ДНК, которые дают фрагменты

2,1 и 3,6 т,п.н. Данные клоны используют в качестве продуцентов в ДНР рР\/4.

Пример 3. Конструирование рекомбинантной фаговой ДНК М13/PPV.

ДНК плазмиды рРИ обрабатывают рестриктазами PVull и EcoRI, как указано выше.

ДНК репликативной формы фага М13 обрабатывают рестриктазами. EcoPV u

EcoRI в буфере, используемом при обработке ECoRI в примере 1, Б, Лигирование проводят, как описано выше.

ДНК лигазной смеси трансформируют

Е.coll штамма jM-103, Фаги высевают на газоне Е.соИ.. Отбирают колонии с нарушенной активностью /3 -галактозидазы. Из 12 колоний с рекомбинантным фенотипом выделяют фаговую ДНК репликативной формы. Ее исследуют, расщепляя рестриктазами EcoRI u Pstl. Отбирают колонии, которые содержат ДНК. образующую при данном анализе фрагмент размером

1 т.п,н., совпадающий по электрофоретической подвижности в 1%-ном агарозном геле с нанесенной рядом ДНК фрагмента вирусного генома, ограниченного сайтами рестриктаз Pvull-E.coll. Данные колонии фага используют для заражения Е.соИ штамма

jM-103 для наработки рекомбинантной ДНК гибридизационного зонда. Пример 4.

Обработка образцов для исследований. 100 мкл 30%-ной суспензии внутренних органов абортированных плодов обрабатывают проназой концентрации 500 мкгlмл в присутствии 0,20% ДС-Na при 37ОС в течение

30 мин. Нуклеиновые кислоты денатурируют нагреванием до 100 С в течение 10 мин, затем добавляют.NaOH до концентрации 0,5

М и выдерживают в течение 20 мин при комнатной температуре, Затем добавляют

1/2 объема раствора, содержащего 0,5 М трис-HCI, 1 M NaCI, 0,3 М ацетата Na, 1 М

HCI и сразу используют для анализа, В случае применения биотинового мечения после проназной обработки проводят

10 однократную фенольную экстракцию и переосаждение этанолом.

15 Пример 5. Проведение непрямой гибридизации.

Нанесение материала на нитроцеллюлозные мембраны и проведение гибридизации.

Образцы тканей наносят на нитроцел20 люлозные мембраны по 2 — 5 мкл в различных разведениях в растворе 4 х CCP (1 х х ССР; 0,15 M NaCI, 0,015 М цитрата натрия).

Мембраны подсушивают и выдерживают в течение 2 ч при 80 С

Мембраны выдерживают в растворе для гибридизации, содержащем 4xCCP, 0,25%ДС Na, 1-кратный раствор Денхардта (по 5 г/500 мл, фикол, БСА, поливинилпирролидон), 200 мкг/мл ДНК тимуса теленка, в течение 2 ч при 65 С (предгибридизация).

Затем проводят гибридизацию в тех же ус30 ловиях в те <ение 16 часов в минимальном объеме указанного раствора с добавлением меченой денатурированной ДНК гибридизационного зонда, 35

ДНК зонда, как описано в примере 4

Мембраны отмывают в следующем режиме: в растворе 2хССР, 0,1% ДС-Na a течение 15 мин, при комнатной температуре; дважды в том же растворе по 30 мин при

65 С; в растворе 0,1хССР при комнатной температуре в течение 15 мин, Результаты реакции учитывают методом радиоавтографии на рентгеновской

50 пленке.

В случае использования биотиновой метки мембраны выдерживают в течение 30 мин в буфере АР, содержащем 0,1 M NaCI, 0,1 M трис-HCI, рН 9,5, 1 мМ MgCI2, куда добавляют 3% БСА и 1% казеина. Затем мембраны подсушивают и выдерживают в течение 30 мин в минимальных объемах бу55 фера АР с добавлением конъюгата "стрептоавидин-пероксидаза" до концентрации 15 мкг/мл при комнатной температуре.

ДН К зонда метят при помощи встраивания дезоксинуклеозидтрифосфатов, меченых P e d-положении, или биотином, в

40 реакции "никтрансляции", Денатурируют

1664831

Чувствительность метода прямой гибридизации с использованием зонда pPV4 составляет 0,2 нг ДНК на 1 мл.

Метод "сендвич"-гибридизации с использованием зондов pPV4 и М 13/PPV позволяет определить вирусную ДНК в концентрации 0,01 нгlмл, что соответствует концентрации вируса 0,03 нг/мл.

Составитель Т.Забойкина

Техред М.Моргентал Корректор М.Кучерявая

Редактор Н.Гунько

Заказ 2366 Тираж 376 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Отмывку проводят при комнатной температуре в следующем режиме: дважды в буфере AP в течение 10 мин; дважды в растворе 0,1хССР в течение 10 мин.

Окрашивание проводят в растворе, содержащем 10 мМ К-фосфатного буфера, рН 6,5, 0,05% НгОг и 0,01% ортодианизидина, при комнатной температуре а течение, 5-30 мин, в зависимости от степени окраши вания. Реакцию останавливают, промывая мембраны водой.

Пример 6. На кружки мембран диаметром 4 мм наносят по 0;1 мкг денатурированной ДНК плазмиды рРМ4 и иммобилизуют в течение 2 ч при 80 С.

В ячейки 96-луночной микроплаты вно-, сят.по 50 мкл образцов, приготовленных,, как описано в примере 4, в различных раз ведениях в растворе для гибридизации(при мер 5, А). Туда же вносят нитроцеллюлозные мембраны с иммобилизованной ДНК зонда !, .pPV4, которые предварительно выдерживают в течение 2 ч при 65 С в растворе,для гибридизации. После этого вносят ДНК гибэоидизационного зонда М 13/PPV, меченую

P или Н и выдерживают при 65 С в течение 16 ч.

Р

Мембраны отмывают в ячейках микроплаты в режиме, описанном в примере 5, Б, Оценку результатов реакции проводят методом сцинтилляционного счета радиоактивности мембран после их высушивания.

Таким образом, предлагаемый способ обладает.по сравнению с известными высокой специфичностью, чувствительностью, технологичностью.

5 Формула изобретения

Способ выявления парвовируса свиней, включающий проведение ДНК-ДНК гибридизации анализируемого образца с ДНКзондами, оценку результатов путем

10 подсчета радиоактивности, о т л и ч а ю щи йс я тем, что, с целью повышения специфичности и чувствительности, способа в качестве анализируемого образца используют клинические образцы ткани, гибридизацию

15 проводят в непрямой "сэндвич"-форме, а в качестве зондов используют рекомбинантные ДНК pPV4.è М 13/PPV.

2. Рекомбинантная плаэмидная ДНК . pPV4, используемая в качестве гибридиза20 ционного зонда для выявления парвовируса свиней. размером 5,75 т.п.н., содержащая: .

-Pst l-EcoR. I-фрагмент ДНК парвовируса свиней размером 2,15 т.п.н; -Pst I— - EcoR I— фрагмент ДНК плаэмиды рВК322 размером

25 3,6 т.п.н.; -уникальные сайты рестрикции:

EcoR ), PvU II u Pst I, расположенные на расстоянии,1; 3,6 т.п.н. соответственно. от сайта EcoR I; генетический маркер Т " — ген устойчивости к тетрациклину..

30 3. Рекомбинантная фаговая ДНК М

13/PPV, используемая в качестве гибридизационного зонда для идентификации парвовируса свиней, размером 8,3 т.п.н., содержащая: -P vu li-EcoR I — фрагмент ДН К

35 парвовируса свиней размером 1 т.п.н.;—

EcoRv-EcoR ) — фрагмент ДНК фага M13 tg

130 размером 7,3 т.п,н.; "уникальные сайты рестрикции: Есор I, а также Sph!, Kpn 1, BamH1, Sal.G I,.Pst1, расположенные в виде

40 полилинкера на расстоянии 1 т.п.н. от сайта .EcoRI.