Способ получения собачьего @ -интерферона

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения веществ с антивирусной активностью. Печень собаки инкубируют в буфере с PH 8,0, экстрагируют ДНК с использованием фенола, диализа и осаждения этанолом, ДНК центрифугируют, диализуют и осаждают этанолом. Полученную ДНК длиной более 50 т.п.о. частично переваривают эндонуклеазой SAU 3А, фракционируют по величине путем электрофореза и выделяют фрагменты длиной 10 - 23 т.п.о., которые после дефосфорилирования клонируют в LAMBDA=EMBL 3 (-3А). ПОЛУЧЕННУЮ БИБЛИОТЕКУ ГЕНОВ СКРИНИРУЮТ С ПОМОЩЬЮ РАДИОАКТИВНО МАРКИРОВАННЫХ ИНТЕРФЕРОНОВЫХ ГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА, ВЫДЕЛЯЮТ ГОМОЛОГИЧНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК, субклонируют их в векторе PUC 9 и вводят в экспрессирующие плазмиды. Полученными при этом векторами трансформируют штамм Е. COLI с последующим выделением конечного продукта. Выход целевого продукта составляет не менее 3<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">5</SP> ед. активности интерферона на 1 л культуральной среды.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (I I ) (sI)ç С 12 N 15/20

ГОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Ы fi И 9 Ь g.,y 3 m р г у y,z" lю

Д0 (Г GAG G(G " G G AA(",1 л, л C T„i rTGНН /A(СЛ" GTG

23 у A A (ф 3g у /лллР,Др (.- (, (ЙЖ Т(Т l G" .(ЛС

77а й(le С(„

n,(ig GTG",.Т(- (. М

®! М ky,ó ó 4в

GAG ЛТО EGG Л.- Л (TG ((О

ТУ g ff /f y ГИ. А(,"., "sf гlе ВЕа / lt /Ъ., ЯС Ут 1 (EGG Тй, (G", < /, . lÅ а «. (. Ад (Ъ Т П ЖГ(,Е", (21) 4202575/13 (62) М 3994213/14 от 17,12,85 (22) 14.05.87 (31) P 3446124.8 (32) 18.12.84 (33) DE (46) 07.08.91. Бюл. М 29 (71) Берингер Ингельгейм Интернациональ

ГмбХ (DE) (72) Адольф Гиммлер, Рудольф Гауптман (АТ)

Норберг Гауэль (0Е) Гюнтер Адольф и Петер

Светлы (AT) (53) 576,224,2,577.2 (088.8) (54) СПОСОБ Г(ОлЧУЧ ЕНИЯ СОБАЧ Ь ЕГО (ТИНТЕРФЕРОНА (57) Изобретение относится к био.ехнологии, в частности к способу пс лучения веществ с антивирусной активностью, Печень собаки инкубируют в буфере с рН 8,0, зкстрагируюг ДНК с использованием фенола.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения веществ с антивирусной

Э диализа и осаждения этанолом, ДНК центрифугируют, диализуют и осаждают этанолом. Полученную ДН К длиной более 501 п,о. частично переваривают эндонуклеазой Яао

ЗА, фракицонируют по величине путем электрофореза и выделяют фрагменты длиной

10-23 т.п.о,, которые после дефосфорилирования клонируют в Lambda-EMBL3 (-ЗА), Полученную библиотеку генов скринируют с помощью радиоактивно маркированных интерфероновых генов человека, выделяют гомологичные последовательности ДНК, субклониру, о- их в век горе pUC9 и вводят в экспрегсируешие плазмиды. Голуч .иными при "-"т,!ì Векторами трднсфорклиоую г г гамм Е. соИ - последующим выделением ког.ечного продукта, Выход целевого продукта составляет не менее Зх10 ед. актив

5 ности интерферона на 1 л культурал:ной сре, ы, актиРносгью, в частности к способу получения собачьего, нтеоферона формулы

1669402

55 60 ю ЕЕ а g и, TCT СТ9 9ТС СЛС СТ(! АТ9

70

65 тlт М у khan г4Е Нь ZAr » гу р Ь p$g ю S

Л!, С (, Л9 AAG СТС TTC СЛС CTC ТТС ТСС CCC- 9ЛС ACG ТСС TCT GCT

00

Ad / М /ЬЕ /М г- lt u ghy A pQ /с и ф В ф + i 4 (СТ ТС(ЛАС ИТС ЛСТ СТС CTG 9Л9 9ЛЛ CТ9 TGC TCG СС9 СТС ТСТ

I05

IOO

Е6 6«e+ Vs А/ k Ca fs Ас Д ® фф ф

И9 A9 СТО- CAT 9AC CTG 9Л9 ССС ТСТ ССС СТО СЛ9 9Л9 9CG С(ЖЕ20

lI5

I IO

Ьб М Nr УЩ. Ac Ocr ЮН Ж Щ АУ 4» Фг leer 4y 5

CTG 9СС 9Л9 АСС ССС СТС ATG (, ЛТ И((ЛС ТСС АСС СТС- АСС АСС

I35

Е30

I<5

Р ® 2ф Х4 ЙФ lEcf ф Ф 6g 45 фф 4Ф7 ф 3 3(ф. ф2.

ТЛС TTC САЛ Л99 ЛТС TCC СТС ТЛС CTG СЛЛ GAC АСС. ЛЛС СЛС АСС

I50! l5

Во

„. q И Q Ж и й1.Ь гФ g@.а „a< ;.„а

CCG Т9Т GCC TGG (АГ ATG. (.ТС ССЛ G(Л (ЛЛ ЛТС ССС- AGA ТСС ТТС

I65

160

Ег 5

Й йг. г 7 ? ф 4Ъ <4 N Мгу Щ Ау Ay y "ф

ТТС ТСС ТСО. А(, И ЛТС TTG САЛ 9ЛЛ Лi".Л ЛТ(, AGG ЛЖ. AGG ААА TGA. gg, И 1е Ии Ю /А G4 ЗРИ 4еу

СЛ9 "O СТС СЛ9 СЛ9 Ф!9 СИ((. СС (, ТС

Способ получения собачьего интерферона заключается в том, что собачью печень инкубируют в присутствии буфера с pH = 8,0 с последующей экстракцией с использованием фенола, диализом и осаждением ДНК этанолом, которую в присутствии буфера центрифигируют с последующим диализом и осаждением этанолом, полученную при этом ДНК с длиной более 50 кб подвергают частичному перевариванию эндонуклеазой

Sau ЭА в присутствии буфера с рН = 7.5 с последующим фракционированием по размеру путем электрофореза и выделением фрагментов с длиной 10-43 кб, которые после дефосфорилирования клонируют в лямбда-векторе Lambda-ЕМВ(3(-3A), с последующим умножением, полученную ген-библиотеку ДНК подвергают скринингу

5 с помощью радиоактивно меченых интерфероновых генов человека с выделением гомологичных последовательностей ДНК, которые подвергают субклонированию в векторе pUC9, с последующим умножением

10 и введением в экспрессирующие плазмиды, и полученными при этом векторами трансформируют Е,coll с последующим выделением конечного продукта.

Пример, Выделение ДНК собаки.

1669402

Замороженную ткань печени собаки размалывают в жидком азоте до тонкого порошка и в течение 3 ч при 55 С, инкубируют в 0.5 М этияендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 10 мМ трис-HCI, рН 8,0, 0,57 додецилсульфата натрия (ДСН), 0,1 мг/мл протеиназы К (20 млlг ткани). Полученный вязкий раствор освобождают от белка путем экстракции фенолом и трехкратной экстракции смесью фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом (25;24:1 по объему), диализуют в буфере 5 мМ трисHCI, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCI и ДНК осаждают двумя объемами этанола, После полного высушивания в вакууме ДНК растворяют в ТЕ-буфере (1О АМ трис-HCI, рН

8 О, 1 мМ ЭДТА) при 4 С и вместе с 1,273 г

CsCI/мл раствора центрифугируют в течение 62 ч при 20 С со скоростью 20000 об/мин. После удаления хлорида цезия фракции, содержащие ДНК. диализуют в

ТЕ-буфере и затем ДНК осаждают двумя обьемами этанола, промывают 707,-ным этанолом, высушивают и снова растворяют в ТЕ-буфере (4 С).

Готовый ДНК-препарат свободен от

PHK и имеет длину более 50 т.п.о, (определено путем электрофореза в 0,45%-ном агарозном геле).

Частичное переваривание зчцонуклеазой и фракционирование по «ели>ине ДНК собаки.

50 мкг ДНК инкубируют прл 37 C " 2,0 ед. Sau ЗА в 450 мкл реакциок;>т>й реды(10 мМ трис-HCI, рН 7,5, ",О мМ h,>I>jClg, 1 мМ дитиотреитопа). Через 40 и 60 мин отбира ют 225 мкл среды и с>лешиеаю> с 15 мМ

ЭДТА и путем наг>евания до 70" С в течение

10 мин прекр .щ,".,3г реакцию Добавляют ацетат натрия до концентрации 0,3 М, рН

6,0, /„НК осаждаю> д.>бав-е>-ием 2,5 обьемов зт-анолона. После растворе>>ия в ТЕ-буфере ДНК >эазд ляют го галичине электрофорезом в течение ночи в О, ",5;(,— ном агврозном геле в TSE-буфере:10,8 г/л трис-HCI, 5,5 г/л борной кислоты, 0,93 г/л (Л!а2ЭДТА) примерно при В/см. При помо щи маркеров (переваренная с помощью

EcoRI u Hind iI! и переваренная с помощью

Hind IlI лямбда-ДНК) вырезают кусок геля с

ДН К длиной 10-23 тысяч пар ocl-Ioeàíèé (далее т.п.о) ДНК электроэлюируют из геля в

>ечен>1е 3 ч при 300 3 в камере для диализа (буфер 0,1xTRE), очищают хроматографией на >,с>1онке Элютип-Д и осаждают этанолом.

Для того, чтобы предотвратить самолигирование фрагментов ДНК, которое может привес и к искусственным гибридам последовательностей собачьей ДНК и к слишкол; большим и такил1 образом более неспособным упаковываться в лямбда-фаги

ДНК-кускам, расфракционированные по величине фрагменты ДНК дефосфорилируют, Для этого ДНК инкубируют в течение 30 мин при 37 С в 140 мкл реакционной среды (50

20 мМ трис-HCI, рН 9,5, 10 мМ М9О2, 0,1 MM ацетата цинка, 1 мМ спермидина) вместе с

5 ед. фосфатазы из кишечника теленка, добавляют следующие 5 ед. фермента и инкубируют 30 мин, После добавки ЭДТА до

25 конечной концентрации 25 мМ ДНК экстрагируют однократно с помощью смеси фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом (25:24:1 по объему), двукратно с помощью смеси хлороформа с иэоамиловым спиртом

30 (24/1 по объему) и трехкратно с помощью диэтилового эфира, осаждают этанолом, высушивают и растворяют в 0,1хТЕ-буфере.

Построение библиотеки геномной ДНК собаки.

Дефосфорилированные длиной 10 — 23 т.п,о. фрагменты ДНК собаки клонируют в лямбда-векторе, например Лямбда-EMBL-3 или -ЗА, с G-А-Т-С-липкими концами, полученными путем удаления внутреннего

Barr>HI-фрагмента фэговой ДНК, Вектор выращивают в штамме Е.col! c супрессорным факторо>л SupF напр.лмер, F.со!! НМ526 538 ипи 539, в содержащем 5

ММ вульф>э1а магния LB-6„-ьоне (10 гlл трип>с,->э, 5 г/л,1рож»,ее,1го эксграк-а и 5 г/и лористо о нэтри >> осажда>т>т попиэтилентпиколем и очиша»:г путем /!ay> oa: ното цеi: р>.фу ираван> я в . ра .„иен . летно ти (О i г СяС!. л:л,ээсx>Iona, 4О ", 15009 о6 ми> 20 С). Последиал; эа против ТЕ-6у..:. > .ра фвг>>ayiI > ДН К ">с эпГ.:ж qa>o» o I 6en> a

» >те.. дт» кра1»ой э>, рак>>>ли сме" ью фен<па с хлороформом и изпал>..лоьыл1 спио>ом (2=/24/1 по эбьему ; и дв>ук=л>ной экстра. кц >>и I IPcbk! Aflopo>1>l. 1а с изоал1и/10вым с;,. р> лл>24/! па об»ем„,,, конце: трирую>

ПУТЕМ сеа»„ДЕЦИЯ Этап .> М.

Д> я получения кэлечных фрагментов

"-МВ! ЗА 50 мкг фл овой Д}!К в течение 2 при .> > С в 15 мк, реакционнсй среды (10 м>у1;ри"-НС! рН 7,5, !О:лМ М9С!2, 1 мМ дитЛОтРЕИтОЛЭ) ПОЛНОСТЬЮ .;ЕРЕВаР ВаЮт С помощь>0 Ban>Н! с п>.. s. щью 15 мУ ЭД1А в

<;.Ч. ЧИЕ !д МИн npi170 I. прЕКращл>От peЭКцию . . ДН К с a>KpG>0>T 31 ñ> н. >0л>

10 избежание обг,вт >его легирования с-, етний фрагмент дополительно разрезают ., г омо цью FcoRI и отделенный o>I«rol yI-" еотид удаляю: путем ссаждения изспропанологл, При этом переваренную

Вап Н! пямбда-ДНК пол»остью переваривают ЕсoRI в течение 2 ч и ри 37 С в 450 мкл 10 мЧ грис-HCI, рН 7,5, 100 мМ NaC!, 10 мМ

1669402

MgClz, реакцию прекращают путем добавки

15 мМ ЭДТА и 10 мин нагревания до 70 С, После добавки ацетата натрия до конечной концентрации 0,3 М три больших фрагмента

ДНК осаждают с помощью 0,6 объема изопропанола в течение 15 мин при 0 С, промывают два раза 0.45 М ацетатом натрия и

0,6 объема изопропанола и однократно 0,3

M ацетатом натрия и 2,5 объема этанолэ и растворяют в 15 мкл 0,1хТЕ-буфера. При этом BamHI/EcoRI-линкеры остаются в растворе, ЕМВI ЗА-фрагменты (8 мкг) объединяют с 5 мкг ДНК собаки длиной 10 — 23 т.п.о. и 10 ед. Т4-ДНК-лигазы и инкубируют в течение ночи при 14 С и один день при 4 С в

50 мкл буфера для лигирования (66 мМ транс-НО, рН 7,2, 0,1 М,NaCI, 10 мМ М9С12, 1 MM ЭДТА, 5 MM дитиотреитола, 0,5 MM

АТФ), Лигированную ДНК-смесь упаковывают в зрелые фаговые лямбда-частицы посредством известной ин витро лямбда-упаковывающей системы. Компоненты этой системы, т.е. ультразвуковой экстракт (УЭ) лиээта, полученный путем замораживания — размораживания (далее:

ЛЗР буферы М1 и А), приготавливают известным образом. По 10 мкл лигированной

ДНК-смеси втечение 2 мин инкубируют при комнатной температуре вместе с 25 мкл УЭ, который также как и ЛЗР в течение 30 мин размораживают из льда. смешивают со 100 мкл ЛЗР и инкубируют далее в течение 60 мин при комнатной температуре. Упакованную смесь разбавляют 150 мкл лямбда-разбавителя (100 мМ трис-НС1, рН 7,5, 10 мМ

MgS04, 1 мМ ЭДТА) и хранят при 4"С.

Аликвоту упакованных лямбда-фагов титруют на штамме Е.coll NM 528 SupF. В целом получают примерно 1х10 неэависи6 мых рекомбинантных ДНК собаки. Остаток упакованного материала размножают путем нанесения на газон NM 528 с плотностью 30000 бляшкообразующих единиц (бое) на чашку Петри диаметром 13,5 см с

1 В-агаром, содержащим сульфат магния, Скрининг библиотеки для поиска генов интерферона.

Для идентификации рекомбинантных фагов, которые содержат гены собачьего интерферона, используют радиоактивно меченые гены альфа-интерферона человека, Для этого полностью переваривают по 10 мкг высокомолекулярной собачьей ДНК рестриктазами EcoRI u Hind 111, разделяют электрофореэом на 0,8 -ном агароэном геле и переносят на нитроцеллюлоэные фильтры, Из экспрессионной плаэмиды pER33 выделяЮт Hind!11-фрагмент длиной 845 пар оснований (по), который содержит протеинкодирующую область для зрелого альфа-2ARG-интерферона человека.

ДНК метят P с применением известных методов.

5 Нитроцеллюлоэные фильтры предварительно гибридиэуют в течение 7 ч при 65 С в 5 х ССПЕ (0,9 М NaCI 50 мМ йаНгР04, 5 мМ ЭДТА, рН 7,4), 5 х раствор Денхардта (0,1 ф и кKоoлn, синтетический полисахарид с

10 мол,массой 400000),0,17(, поливинилпирролидон, 0,17(, эльбумин сыворотки рогатого скота, 0,1;(, ДСН, 20 мгlмл ДНК из спермы лосося и затем с 13x10" cpm маркированной пробы гибридиэуют в таком же растворе, но

15 беэ ДНК иэ спермы лосося. После инкубации при 65 С в течение ночи фильтр промывают четырехкратно в течение 1 — 1,5 ч в

ЗхССР (0,45 NaCI, 45 мМ цитрата натрия), 0,17; ДСН при 65 С и экспонируют в тече20 ние 7 дней. Появление нескольких полос доказывает наличие семейства генов альфаин ерферонэ у собак.

1000000 рекомбинан. ных лямбда-фагов наносят на Е.coll NM 528 плотностью 30000

25 6oe/13,5 см пластины. Двукратные нитроцеллюлоэные реплики изготовляют с каждой пластины. После обработки в течение 2 ч при 80 С фильтры промывают в течение

1,5ч при 65 С в 1М NaCI,10 мМ трис-HCI pH

30 8,0; 0,1 ДСН, предварительно гибридизуют в течение ночи, как описано выше, и в течение 24 ч гибридизуют с 1,5x10 cpm радисактивной пробы эльфа-интерферона нэ фильтр. После трехкратного скрининга пол35 учают 9 клонов собачьего а -интерферона, которые дают положительные сигналы гибридизации.

Характеристика рекомбинантных фагов.

40 Из 9 гибридизующихся с а -интерфероном человека рекомбинантов готовят фаговую ДНК. ДНК переваривают с помощью

EcoRl BamHI, Hind III, Pstl, Bg41, Smal, и разделяют электрофореэом в 0,8ф,-ном а а45 розном геле.

Величину фрагментов определяют известным образом. Положсние рестрикционных мест внутри Лямбда-вставки определяют путем частичного рестрикцион50 ного переваривания лямбда-ДНК. маркировки правых и левых липких концов лямбда-ветвеи синтетическими мечеными

P олигонуклеотидами с последующим электрофореэом в 0,45 -ном агароэном ге55 ле.

Субклонирование генов а-интерферона собаки, Рестрикционный фрагмент клона Саальфа-11-2. который гибридизуется с а-ин1669402 терфероновым маркером человека, субклонируют в полученное обработкой рестрикционными энзиг ами место клонирования вектора pUC9, производного р8 R 322.

Вставка постороннего ДНК-фрагмента приводит к прерыванию lас-Z-гена (/ галактозидаэы) и таким образом изменяет фенотип трансформированного плазмидой штамма

Е,coll IM101 от lac + до lac —. В результате индуцированный изопропилтиогалактозидом (ИПТГ) штамм IM101 не может расщеплять до синего красителя бесцветный субстрат-аналог 5-бром-4-хлор-3-индолилt3-D-галактоэид (X-GAL). Колонии бактерий с фенотипом lac поэтому распознают по белой окраске.

Smal-фрагмент длиной 3,7 т.п.о. из клона Са-альфа 11 — 2 элюирую- из эгароэного геля, очищают хроматограФией на колонке

Элютип-Д и примерно в 10-кратном молярном избытке лигируют с 40 нг разрезанного с помощью Smal и дефосфорилированного вектора pUC9, трансформируют в Е. со!!

IM101 и заливают вместе с В-Топ-агаром, содержащим 0,2 мг/мл Х-GAL, 0.17 мг/мл

ИПТГ и 0,1 мг/мл ампициллина. Белые колонии выращивают в 5 мл LB-бульона, содержащего 0,1 мг/мл ампициллина, в течение ночи при 37 С и подвергают скри:ингу известным образом, Полученную ппи эro÷ плаэмиду называют рА -l50. Таким же обрэ-.,Ом Ял а1-фрагмент длиной 2,4 тат из Г(с же лямбда- ..лона субклонипуют pl.iC9, Полученнук1 плэзмиду нэгывзГот ГРАН .

ДНК-последовательность генов об чьего а -инге; ферона из клона Сэ-эльфа-112

Н!пг) II-вс --. Гвкх Длиной 3,7 тгп:. пллзмид рАН2 (38 э!-фрагмент,(линой 1,7 т.п.о, субклон Са- а 1-i, noдве ргэю Г анализу для

ОПРeДeРeНИS ПОСЛЕДОватЕЛ,НОСТИ а "ЛИНОкислотных остатков. 60 мкг ЦНК из плэзмиды рАН2 полностью -ереваривэют с помощью Hind III, фрагмент длиной 1,7 т.п.о, выдег:яют из 1;4-ного агарозного геля и очищают, как описано выше. 15 мкг этого фрагмента 8 100 мкл буфера для лигировэния подвергают лигированию с ".4 ед, Т4ДНК-nvraav при 14 С 8 те гение ночи и

Зат-..М ПОД8ЕРГаЮт СаМОЛИrvf,>08»НИЮ В ТЕЧЕМ,t: 4 Г(НЕй, Ът, ЛИГИрзваННуЮ ДНК доОбят нэ маленькие части в ледяной банг с помощь о 20-секундных ультразвуковых импульсов (всеro 1 IÎ-140 .). ДНК-.Онцы воссгэнавлиэают в те ение 2 ч при 14 С л

25С мкл ОЕ"кционной Срвды (50 мМ триСH(i, oH 75, 10 мМ М9С!р, 1 мМ д.:тиотреи ;"з . 5 мг/мл э,,бумина cèaoротки

wit, l1H0I 0 Iiof8Tof о сt. o ra, пО О, 1 м."л QA I Р, 5

3,. n

t0

dGTP, dCTP, dTTP с помощью 15 ед. большого фрагмента Е,со!1-полимеразы I (фрагмента Кленова), После концентрирования путем осаждения этанолом предварительно обработанную таким образом ДН К разделяют в 1,— ном агароэном геле и ДНК-фрагменты длиной 0,35--1,0 т.п.о. выделяют и очищают. Примерно в 10-кратном молярном избытке фрагменты лигируют с разрезанной Smal и дефосфорилированной репликативной формой бактериофага М13 mp8 и трансформируют Е.coil !М101. Однонитевую ДНК рекомбинантных фагов выделяют и после связывания с синтетическим олигонуклеотидом осуществляют двунитевой синтез в 4 Отдельные реакции с использованием фрагмента Кленова Е.сoll ДНК-полимерэзы, Аналогично анализируют Hind ill-фрагмент длиной 1,9 т.п,о. иэ плазмиды рАН4 (SmaI субклон длиной 2,4 кб иэ Са-альфа-112).

Конструирование экспрессионной плазмиды pRH100.

Все ферментные реакции осуществляют в указанных изготовителями условиях. 7 мкг плазмиды pER103 линеаризируют в

50 мкл реакционной среды с помощью рес Г..икц энной эндонуклеээы Hind III lo) к (З Л P т ЧН "P 1 Ч ПО1 3 i p ЗбавnflKt :,3 л i 2хС1Р-буфеоэ (2 CIP-n . фер. 2С

", ЕЛ:, I, to Нпй фО. j;Эт -,f» t<" K ×tt P ":Í, „"

ОГГ нка 1 1 НС-. 5 -Knt

Я,(! .ОГки .гдэляи, riqt -t,1, > n;-тн; и э;<Г: Г,1-8 - и 1)е НОРoM Одно" gaT:.Ov. э коroa

I ци . и смес -Го Г1)енол- с хлоп . Фоо! м. Д HI!.

Осэ. „;, „r нэ о >ной,aзь дпб, ;ен.iefa О,

Обь.: а "М раствора ." .Гэт натри> . рН,5, и 250 м л зтэннла, Осадок ДНК после центриф,г",Оовэнля промывают однократно

70;4- ым раствором этанола. ДНК высу: кивают и аа см осадок после цантрифугироэан .я растворе;От 8 20 мкл TF.-буфера (10 мМ трис, I 8,0, 1 ММ ЗДТА). ПО: мкг синтетичес,:.ил ОРИГ дезОкснчуклеогилов

d(AGC (, Р А-<..АТ4ЛГ СТ) % d(CАТС i ГА) фо с, о .t,-;.:èã JГгт ° 0 м„л реакиис .i-ГО I»стнорэ r; ° доблвле t и 10 ед.;4 III-t».(полИНуК18. «ЛКИНЭЗЫ) и 1 М"Л АIГ. I- aàÊöÈto

8 . ду i: A,., С 8 t n÷n . iP. 4: ми;: I 8: кци 0 оста;: .", .!88K!ò,á-м;и т .ым нэг евэни(лл до 70 С 1о 5 мкг расг вора плаз лиды и фос фьр:.: ировэнных оли. онуклеотлг 8 смеил":Г; ва П . Э ГРЕБ г. ОT 8: ЕЧЕН ИС O МИН .-, Р, о,ае,;:, ac f8op » л t>K+8-Ог .„:3 (, ( (эп,",, gò мкл 10 л ли! . " чсГ(: г, ti ltn,, Рt, мlv

1669402

50 трис, рН 7,5, 100 мМ МоС!г, 200 мМ ДТТ-дитиотреитола, 1 мМ АТР, 500 мкг/мл альбуминЬ сыворотки крупного рогатого скота), а также 2 мкл воды и 10 ед. Т4-ДНК-лигазы, Реакцию ведут 40 ч при 4 С и прерывают

10-минутным нагреванием при 70 С.

2 мкл продукта реакции в 30 мкл раствора переваривают 10 ед, рестрикционной эндонуклеазы Sacl в течение 3 ч при 37 С, Реакцию прерывают путем 10-минутного нагревания до 70 С, 5 мкл этой реакционной смеси в 30 мкл среды лигируют с 10 ед, Т4-ПНК при 14 С в течение 16 ч. 200 мкл штамма Е.coll НВ101 смешивают с 10 мкл продукта реакции лигирования. Бактерии выдерживают в течение 45 мин на льду и затем нагревают в течение 2 мин до 42 С, чтобы сделать возможным поглощение

ДНК. Затем суспензию бактерий инкубируют снова при 0 С в течение 10 мин. После этого трансформированные бактерии наносят на LB-агар, который содержит 50 мкгlмл ампициллина.

Из образовавшихся колоний бактерий отбирают произвольно 12 и из них выделяют плазмиды. Суммарную ДНК разрезают с помощью рестрикционной эндонуклеазы

Sacl è ДНК разделяют в агарозном геле(1;(„

1хТВЕ-буфер). ПеремещениеДНК в виделинейной молекулы размером 4400 п.о, подтверждает введение сайта рестрикции Sacl в плазмиду, Одну из этих плаэмид произвольно отбирают. ДНК из соответствующего выделения еще раз трансформируют в штамм Е.coll НВ101. Иэ полученных трансформированных бактерий выбирают одну колонию и выращивают в большем масштабе. Выделенную плаэмиду разрезают рестрикционными эндонуклеаэами FcoRI u

BamHI, ДНК разделяют в 17,-ном агарозном геле и меньший фрагмент выделяют из геля путем электроэлюции. Этот EcoRI—

BamHI ДНК-фрагмент длиной 460 п.о, анализируют для определения последовательности аминокислотных остатков. Полученную плаэмиду называют

pRH100.

Прямая экспрессия зрелого интерферона-21 собаки (Са И Ф Н а 1).

5 мкг плазмиды pRH100 полностью разрезают с помощью рестрикционной эндонуклеазы BamHI и затем 5 а -концевые фосфаты удаляютс помощью щелочной фосфатазы кишечника теленка. 30 мкг плазмиды рАН4 переваривают с помощью BamHI.

После электрофоретического разделения

ДНК в эгарозном геле ДНК-фрагменты длиной 0,6 т.п.о, которые содержат всю кодирующую последовательность для

Са-IFN-альфа!, выделяют из геля и очищают.

1 мкг этих ДНК-фрагментов длиной 0,6 т,п.о. и 25 нг разрезанной pRH100-векторной ДНК в 10 мкл буфера для лигирования (66 мМ трис-HCI, рН 7,2, 0,1 MNaCI, 10 мМ

MgCl2, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитола, 0,5 мМ ATP) лигируют с 10 ед. Т4-ДНК-лигазы при 14 С в течение 24 ч.

Клетки Е.coll НВ101 трансформируют 5 мкл продукта лигирования и наносят на LBагар, который содержит 50 мкгlмл ампициллина.

Из образовавшихся колоний изолируют в микромасштабе плаэмиду и характеризуют путем рестрикционного анализа с различными ферментами. Плазмиду, которая содержит ген интерферона и триптофановый промотор в одной и той же ориентации, называют рАН104. Эта плаэмида представляет собой промежуточную стадию получения окончательной экспрессионной плазмиды для зрелого Са-ИФН-альфа 1.

Конструкция экспрессионной плазмиды рАН4/2. 7 пмоль BamHI-фрагмента длиной

0,6 т,п.о, из плазмиды рАН4 смешивают с 1 нмоль синтетического олигонуклеотида (d(TGCCACG TGCCCGAC), который предварительно фосфорилируют с помощью Т4полинуклеотидкиназы, общий обьем доводят водой до 34 мкл. 15-мерный олигонуклеотид содержит кодирующую последовательность для 5N-концевых аминокислот зрелого а -интерферона собаки. Раствор нагревают в течение 5 мин до 100 С и затем охлаждают, причем находящийся в больlooM избытке олигонуклеотид привязывается к комплементарному участку однонитевой ДН К.

Двунитевой синтез, исходя из связанного с олигонуклеотидом затравки, осуществляют в 70 мкл реакционной среды (50 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ MgClz, 1 мМ дитиотреитола, 0,5 мгlмл альбумина сыворотки крупного рогатого скота, по 1 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP) с 35 ед. фрагмента Кленова ДНК-полимеразы! штамма Е.coll в течение 90 мин при 22 С. Реакцию прекращают путем добавки 20 мМ ЭДТА, белки удаляют экстракцией смеси фенола с хлороформом. ДНК осаждают этанолом после добавления 0,1 объема ЗМ раствора ацетата натрия, рН 6, и промывают 707ь-ным этанолом. Оставшиеся однонитевые ДНКучастки удаляют с помощью Sl-нуклеазы.

Для этого высушенный ДНК-осадок рас-.воряют в 300 мкл Sl-реакционного буфера (4 мМ ацетата цинка, 30 мМ ацетата натрия, 250 мМ NaCI, 5) глицерина, рН 4,6) и инкубируют в течение 2 ч при 14ОС со 150 ед.

St-нуклеазы. Реакцию прерывают добавлением 20 мМ ЭДТА. Белки удаля от путем

14

1669402

13 экстракции фенолом и хлороформом. После добавки 0,15 объема ЗМ раствора ацетата натрия и 0,6 объема изопропанола ДНК осаждают при О С из водной фазы и промывают 70 -ным этанолом. Полученную ДНК переваривают с 60 ед, Pstl в течение 2,5 ч при 37 С и затем разделяют электрофорезом в 2 -ном агароэном геле, Фрагменты

ДНК длиной 300 п.о. выделяют и очищают.

ЗО мкг плаэмиды рАН104 переваривают с 50 ед. Sacl в течение 2 ч и ри 37 С, фермент инактивируют в течение 10 мин при 70 С, После добавления по 0,5 мМ всех четырех дезоксинуклеотидов и 30 ед, полимераэы

Кленова инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре, чтобы сделать тупыми концы ДНК. Белки удаляют путем экстракции фенолом и хлороформом и ДНК осаждают этанолом. Полученную ДНК частично разрезают 20 ед. Pstl в течение 40 мин при 37 С и реакцию прерывают добавлением 20 MM ЭДТА. ДНК разделяют электрофорезом в агарозном геле. Фрагменты длиной

4,3 т.п.о. изолируют и очищают.

Полученная ДНК и описанный выше

ДНК-фрагмент длиной О,З т.п.о. лигируют в

10 мкл буфера для лигирования с 10 ед.

Т4-ДНК-в течение 20 ч при 14" С. Продуктом лигирования трансформируют клетки Е,coil

ЕВ101 и наносят на содержащий ампицилин LB-агар. Образовавшиеся колонии бактерий переносят на свежие агаровые пластины, а также На нитроцеллюлозные фильтры, которые наложены н агаровые пластины. После инкубации при 37 С bai терии лигируют и ДН К после денатурирования

СВяэЫВаЮт С I«; r pnftennKOnOSOй, ОСтаГКИ клеток удаляют путем инкубзции в течение

16 ч при 65 С в промывном рас .ьоре (1

MNaCI 50 мМ тгис-НС1, рН 8,0, 1 ма1 ЭДТА, 0,1 ДСН). Фильтры затем гч!брир!!зуют в

10 мл раствора (О 9 MNa(90 MM трис-HCI, рН 7,5, 6 мМ ЭДТА, 0,1; ДСН, 0,1 мкгlмл

РНК иэ Е.соП) с 2x10 cpm меченого Р

7 32 олигодезоксинуклеотида б(ТСССАССTGCCCGAC) в течение 3 ч Ггри

47ОC. 18 пмоль олигон/клеогидг и 18 пмоль (у- 2Р) АТР (3000 CI/ммоль) в 20 мкл буфера (70 MM трис-HCI, рН 7,6, "0 мМ MgCI2, 5 мМ дигиотреитола) инкубируют в присутствии

10 ед. Т4-полинукл от!!дкиназы !-. течение. .5 мин при 37" С. Реакци! ff! Iåêða:öà!oò робавление л 25 мМ ЭДТА и !;ееключившуюся радиоактивносгь отделяют путем хро;. атографии на колонке, содержащей мл биогеля Рб-DG, Фильтры промывают 4 раза в течение

30 мин при 47"С. Поомывнпй раствор соо;— вегсгвует испальзованно!-.у для гибридизации раствору бс? добавки tPHK Фильтры

3!

1г

5Г

; — r, !! экспонируют при 80 С. Из колоний бактерий, которые дают на ауторадиограмме положительный сигнал гибридизации, выделяют плазмидную ДНК. После разделения электрофореэом в агарозном геле выделяют рестрикционные фрагменты длиной

0,5 т.п.о„которые подвергают анализу последовательностей аминокислот, Плазмиду с желаемой структурой называют рАН4/2, Она позволяет осуществлять экспрессию зрелого СаИФН-альфа! в штамме E.coll.

Получение плазмиды рАН4/3.

Подготовленный для бактериальной экспрессии СаИФН-альфа!-ген иэ плазмиды рАН4/2 субкпонируют в плазмидном векторе par-PATER i03, 0,5 мкг Hind III — фрагмента длиной 0,5 т.п.о. плаэмиды рАН4/2 и 25 нг разрезанного с помощью Hind! II è BamHI и очищенного на геле плаэмидного вектора par-pATER103 в 10 мкл буфера для лигирования инкубируют в присутствии 5 ед. Т4-ДНК-лигазы в течение 3 ч при 22 С. Клетки Е.coll HB101 трансформируют 5 мкл продукта реакции и наносят на LB-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина. Из образовавшихся колоний бактерий произвольно отбирают 6 и иэ них выделяют плазмиды. Плазмиду, которая обладает желае лгй стрчктур т называют рАН4, . . SKI;rIpr ".сил ингерф" IOHOE и активности; U! a !!".-. .coll - Ь 101, сс.дер.каше .! пла .м!иду рАН412 ипил р! H/3, 100 мл «uaKtepr» !ьной «y! r уры и!!куби( рук» при 37 !. при III-r!cr-... см в;:;."- .. внии !..пл т!- до нижс, Ka..,:.Ií" г:!" I плот ости при 600 : л, с,-;. IIye! a:. coДеР:: . „cß >!, —;;:тоф. . с; .*.,:е -..гэн c Ia 1 лсрер".,:i, r .,>,!Hл)2г Ол,З.Ь г I;I!. РОл -н /,.), с Na !Н. О, Г Из! 2 1 I, .1Я-г!.,и;!Окислот ки лс1 !ьй fидролиэат, 11 гл!окозы . !лМ !,gSf./ 1, i мМ СаСI2, i . - тиг „! -Р! .1, 2.! мг

L-öèc û Ha, 20 мг 371 -Rl до! а кои!!свой кислоты;. Лук- )p д и! три!:т .фано врона). необязап .-.I.Ho 50- 10!! Mf а "..!иш!олина ..- aгем бак-! с,.! чл центр..ф. - л ую.. re c r;c 5 мин при сс00 об/ми!„! яро» сугпендируют в

1/10 (к!/л.турал:.,нс г.. обьема! охлаж,,е-! I.of льде;;! Ьео!а "..,0 I,I:", !р! i! Ci оН 8,, 3п

4 л i, .. >: IK Qxa:.I.", . ° f; льд!!!м двзж!!ы!

Q ". ен:!е 30 с pa3p„ » fl h!,)I! ю ультразвука .20 У! ., 100;sf, . ч ! ) p,а:ру .;.нных клюок удаляю ь !е <. чие .0 мин при !

0000 об/f èн !4" С) и нлдг!с...!д!! !! у)а жидкость после стер!!ль!;о!! 4 I! ьтр,. ции испыть вают на интерферо! .; в y I(a I г !- ост = по с!,сте! -., в которой II,з!.!ср г: .. опarI ческий a,"" ект:;ез!!кчля;,е . ..-.,-.

1669402

15

Составитель Т. Забойкина

Редактор Н, Гунько Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор О. Кравцова

Заказ 2688 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород. ул.Гагарина, 101.

Тест-система: А-72 (АТСС СШ 1542) опухоль у собаки везикулярный стоматитный вирус.

Активность интерферона в единицах на литр бактериальной культуры составляет

3,2х10 и 3,0х10 для штаммов Е.coll, трансформированных плазмидами рАН4/2 и рАН4/3 соответственно, Формула изобретения

Способ получения собачьего а-интерферона, заключающийся в том, что ткань печени собаки инкубируют в присутствии буфера рН 8,0, экстрагируют фенолом, диализуют и осаждак1т ДН К этанолом, которую в присутствии б уфера центрифугируют, диализуют и осаждают этанолом, полученную при этом ДНК с длиной более 50 т.п.о. подвергают частичному перевариванию зндонуклеазой Sau ЗА в присутствии буфера рН

7,5 с последующим фракционированием по размеру путем электрофореза, выделением фрагментов с длиной 10 — 43 т.п.о„которые после дефосфорилирования клонируют в л ямбда-векторе Lambda-Е M В L3(-3A) и умножают, полученную ген-библиотеку ДН К подвергают скринингу с помощью радиоактивно меченых интерфероновых генов человека с выделением гомологичных последовательностей ДНК, Smal-фрагмент с длиной 2,4 т.п.о. отработанного клона Саа 11-2 лигируют разрезанным с помощью

Smal и дефосфорилированным вектором

pUC9, полученными рекомбинантными ДНК трансформируют бактерии Е.coll 1М101 и отбирают устойчивые к ампициллину клоны, содержащие плазмиду рАН4, переваривают

BamHI, полученный фрагмент длиной 0,6 т.п,о. лигируют с векторной ДНК плазмиды

pRH100, предварительно разрезанной рестрикционной эндонуклеазой BamHI с помощью Т4-ДН К-лигазы удаляют 5 -концевые фосфатные остатки щелочной фосфатаэой кишечника теленка, выделяют плазмиду рАН104, которую переваривают Sacl, концы полученной ДНК затупляют с помощью полимеразы Кленова в присутствии 4АТР, dGTP, dCTP и dTTP, полученную ДНК обрабатывают Pstl, и выделяют фрагментдлиной

5 4,3 т.п.о. и ВатН1-фрагмент длиной 0,6 т.п,о. из плазмиды рАН4, лигируют с олигонуклеотидом N(TG CCACCTGCCCGAC), предварительно обработанным Т4- полинуклеотидной киназой, олигонуклеотид10 ную затравку удлиняют с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 штамма Е,coll в присутствии dATP, dGTP, dCTP u dTTP и полученную ДНК осаждают, оставшиеся однонитевые участки ДНК уда15 ляют с помощью $1-нуклеаэы и полученную

ДНК осаждают, переваривают Pstl и выделяют фрагмент ДНК длиной 0,3 т.п.о., который лигируют с фрагментом длиной 4,3 т.п.о. с помощью Т4-ДНК-лигазы с получе20 нием экспрессионной плазмиды рАН4/2, HInd lII-BamHI-фрагмент длиной 0,5 т.п,о. экспрессионной плазмиды рАН 4/2 лигируют с разрезанным Hind III u BamHI плазмидным вектором раг-PATER 103 с помощью

25 Т4-ДНК-лигазы с получением экспрессионной плазмиды рАН4/3, полученными экспрессионными плазмидами трансформируют штамм Е.coll НВ 101 и трансформанты культивируют, выделяют

30 белок, очищают его путем добавления сульфата аммония до 65ф,-ного насыщения, центрифугирования, суспендирования полученного центрифугата в буферном растворе, диализа центрифугирования диализата, 35 двухстадийной колоночной хроматографии с использованием на второй стадии связанного с ионитом моноклонального анти-собачьего интерферонового иммуноглобулина с последующей эволюцией связанного с ан40 тителом интерферона раствором, содержащим лимонную кислоту, доведением элюата до рН 4,5 и хроматографией полученного супернатанта на катионите и элюцией раствором ацетата аммония.