Способ определения антител к экзотоксину коклюшных бактерий методом иммуноферментного анализа

 

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно определению антител к экзотоксину коклюшных бактерий. Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности анализа. Предложенный способ определения антител к экзотоксину коклюшных бактерий методом иммуноферментного анализа включает адсорбцию экзотоксина на поверхности полистирола , внесение исследуемых антител, коньюгата антивидовых антител с ферментом и субстрата, отличается тем, что перед адсорбцией токсина поверхность полистирола обрабатывают частично денатурированным церулоплазмином человека. Применение церулоплазмина обеспечивает повышение чувствительности и специфичности анализа, позволяет снизить его стоимость за счет возможности использования неочищенных препаратов коклюшного экзотоксина . 3 табл. (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (505 С 01 и 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

О

C (21) 4752833/13 (22) 24.10.89 (46) 15,12.91. Бюл. N 46 (71) Уфимский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им, И.И.Мечникова (72) В.Д.Смирнов, А.Н.Терегулова, P.À.Ñþíдюкова и P.ÂÌaêcþòoâ (53) 576;8;077 (088.8) (56) Ashworth . et al, Antlgens in whooping

cough vaccine and antibodylevels induced by

vaccination of childred — Lancet. — 1983.

8355. October 15, 878-881. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К

ЭКЗОТОКСИНУ КОКЛЮШНЫХ БАКТЕРИЙ

МЕТОДОМ ИММУНОФЕ РМЕ НТНОГО АНАЛИЗА (57) Изобретение относится к биологии и медицине, а именно определению антител к

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно определению антител к экзотоксину коклюшных бактерий.

Известен твердофазный иммуноферментный метод определения антител к экзЪтоксину коклюшных бактерий, включающий адсорбцию экэотоксина на поверхности полистирола, внесение исследуемых антител, коньюгата антивидовых антител с ферментом и субстрата.

Недостатками такого способа являются необходимость использования высокоочищенного препарата коклюшного экзотоксина, зависимость чувствительности и специфичности анализа от беспорядочной сорбции молекул токсина на полистироле и сорта полистирола.

5U,, 1698783 А1 экзотоксину коклюшных бактерий. Цель изобретения — повышение чувствительности и специфичности анализа. Предложенный способ определения антител к экзотоксину коклюшных бактерий методом иммуноферментного анализа включает адсорбцию экзотоксина на поверхности полистирола, внесение исследуемых антител, коньюгата антивидовых антител с ферментом и субстрата. отличается тем, что перед адсорбцией токсина поверхность полистирола обрабатывают частично денатурированным церулоплазмином человека. Применение церулоплазмина обеспечивает повышение чувствительности и специфичности анализа, позволяет снизить его стоимость эа счет воэможности использования неочищенных препаратов коклюшного экзотоксина. 3 табл.

Цель изобретения — повышение чувст- 01 вительности и специфичности анализа. О

Сущность изобретения заключается в Q() том, что перед адсорбцией препарата коклюшного экзотоксина поверхность полистирола обрабатывают частично денатурированным церулоплазмином человека, в результате чего достигается упорядоченная пространственная ориентация молекул токсина, обеспечивающая повышение чувствительности и специфичность реакции, а также возможность использования дешевого неочищенного препарата.

Пример 1. Определение оптимальной дозы церулоплазмина для адсорбции на планшете.

Церулоплазмин человека частично денатурируют прогреванием при 60 С в тече1698783

3 йие 16 ч и адсорбируют на полистироле в дозах 20, 10, 5, 2,5 мкгlмл при следующих условиях: карбонат-бикарбонатный буфер (рН 9,6),время инкубзции 3 ч, температура

22 С, объем вносимого в.лунку образца 5

0,1 мл, После адсорбции церулоплазмина планшеты промывают фосфзтным буфером рН 7,2, содержащим 0,05 твина-80. Затем в лунки планшета вносят коклюшный токсин в различных разведениях, раститрован- 10 ный с двукратным шагом начиная с 500, нг/мл. 8 контрольные лунки токсин не.вно- j ,сят. Плашки инкубируют при 37"С в течение 1,5 ч, отмывают несвязавшийся токсин двух кратным буфером, содержащим дополни- 15 .тельно 0,5 М хлорида натрия, и вносят антисыворотку к коклюшному токсину. По сле инкубации при 37 С в течение 1;5 ч несвязавшиеся антитела отмывают фосфатным буфером, вносят антивидовой конъю- 20 гат и инкубируют при 20 С 1 ч. Лунки вновь отмывают фосфатным буфером, вносят субстрат и через 15 мин останавливают реакцию 4 н;серной кислотой. Учет реакции проводят при 490 нм. 25

Оптимальной дозой церулоплаэмина для адсорбции на полистироле является 10 мкгlмл, поскольку увеличение ее до 20 мкг/мл не оказывает влияния на характер кривой титрования, а уменьшение до 5 30 мкгl мл снижает чувствительность реакции.

Пример 2. Использование неочищенного препарата коклюшного токсина в

И ФА.

Частично денатурированный церулоплазмин адсорбируют в лунках полистироло вых планшет, как описано в примере 1..

После отмывки неадсорбированного церулоплаэмина в одни лунки планшеты вносят 40 очищенный токсин в концентрации 10 мкг/мл в объеме 100 мкл, а в другие — неочищенный в объеме, содержащем такое же количество токсина, кзк очищенный препарат. Далее анализ проводят, как описано в 45 примере 1, используя рефернс-сыворотку, активность которой 5000 ЕД/мл, и тест-сыворотку с неизвестной активностью. Активность тест-сыворотки при использовании высокоочищенного токсина: 6,252,8; 50

6,182,6; 6.052,8; 6,202,8; 6,002,0; 6,346,0

ЕД/мл, а при использовании неочищенного токсина: 6,196,2; 5.986,4: 6,202,0; 6,642,6;

6,006,6; 6,240,0 ЕД/мл, Таким образом, независимо от использованного препарата 55 данные об активности антитоксической сыворотки идентичны, высокий уровень коррекции свидетельствует о возможности использования неочищенных препаратов коклюшного токсина.

Пример 3. Специфичность реакции в отношении антигенов коклюшного микроба.

Церулоплазмин адсорбируют в первых четырех рядах планшеты, как описано в примере 1. Затем адсорбируют очищенный токсин в четырех рядах лунок на церулоплазмин и в последующих непосредственно на полистирол. В лунки с адсорбированным токсином вносят антисыворотку к дефектному по продукции токсина штамму коклюшных бактерий и далее последующие этапы

ИФА проводят, как описано в примере 1, Результаты исследования приведены в табл. 1.

Использование церулоплазмина в качестве аффинной подложки обеспечивает полное отсутствие перекрестных реакций с антителами против других антигенов коклюшного микроба в то время как при непосредственной сорбции коклюшного токсина они наблюдаются.

Пример 4. Межвидовая специфичность реакции.

8 лунки полистироловой планшеты с здсорбированным нз их поверхность церулоплзэмином, а затем коклюшным токсином вносят антисыворотки к дифтерийному токсину, экзотоксину синегнойной палочки и токсину коклюшного микроба. Далее анализ проводят, как описано в примере 1.

Результаты испытаний приведены в табл. 2, Отсутствие перекрестных реакций с антисыворотками к дифтерийному и синегнойному токсинам свидетельствует о специфичности предлагаемого способа.

Пример 5. Чувствительность ИФА при различных вариантах сорбции коклюшного токсина, 8 лунки планшеты с адсорбированным церулоплаэмином и беэ него вносят коклюшный токсин в различных дозах и далее анализ проводят, как описано в примере 1.

Результаты испытаний приведены в табл. 3.

Использование церулоплазмина в качестве аффинной подложки обеспечивает увеличение чувствительности ИФА в четыре раза. Последнее достоверное значение (прямолинейный участок кривой титрования) составляет при сорбции токсина на полистирол 0.52 ЕД оптической плотности. что соответствует 15,6 нг/мл, а при сорбции на церулоплазмин — 0,6 ЕД и, соответственно

3;9 нг/мл.

Приведенные данные свидетельствуют о возможности использования неочищенных препаратов коклюшного токсина в

1698783 предложенном способе ИФА, о его высокой чувствительности и специфичности.

Формула изобретения

Способ определения антител к экзотоксину коклюшных бактерий методом иммуноферментного анализа, включающий адсорбцию экзотоксина на поверхности поТабл ица1

Способ сорбции и препарат токсина

Показатели оптической плотности при различных разведениях сыворотки

K штамму мик оба, лишенном токсина

1: 200

1: 800

1: 100

1: 600

1 . 1000 контроль

0,76

1,09

0,31

0,24

0.20Ю,06

0,17М,005

0,52

0,18

0,21

0.16

0,14

0,18

2,00

2,00

2,00

1,85

1,62

0,22 0,11

0,22+0,11

0,22

0;18

0,21

0,21

Таблица 2

Таблица 3

П р и м е ч а н и е. Фон (ЦП) 0,25: фон (ПС) 0,34.

Высокоочищенный токсин. адсорбция на полистирол церулоплазмин

Неочищенный токсин, адсорбция на полистирол

Черулоплазмин листирола. внесение изучаемых антител, конъюгата антивидовых антител с ферментом исубстрата, отл ича ю щи йс ятем, что. с целью повышения чувствительности и

5 специфичности анализа, поверхность полистирола предварительно обрабатывают частично денатурированным церулоплазмином человека.