Способ получения ферментных препаратов лизоцимов из содержап1его их сырья

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Ссве1ских

Социалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельства,¹

3аявле 1о 17.11.1965 (¹ 943666, 28-13) с присоединением заявки ¹

Приоритет

Оп1 бликовано 03.11.1966. Бюллетень ¹ 4

1 л. 6а, 22 ч.ч1ПК С 12к

Комитет по делаю изобретениЯ и открытий

IlpH Совете Министров

СССР

УДК 663.18: 576.8.093.383 (088.8) З,ата опубликования описания 19.11!.19!,6

Авторы изобретения

И. А. Черкасов и Н. А. Кравченко

Институт органической химии имени Н. д. Зелинского 1чН C5>

Заявитель т

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНЪ|Х ПРЕПАРА 1ОВ

ЛИЗОЦИМОВ ИЗ СОДЕР)КАЩЕГО ИХ СЫРЬЯ

К группе лизоцимов относятся блктернолитические ферменты, которые разрушают бактерии, действуя на входящие в состав их клеточных стенок мукополисахариды.

Известны способы получения ферментных препаратов лизоцимов из содержащего их сырья, например белка куриного яйца, путе.t смешивания его с годой и последующей лдсорбции хитином.

Однако в сырье могут находиться и другнс белки, способные сорбироваться:1а хитнне 15 тех же условиях, в которых сорбируется лизоцпм. Это приводит к тому, что при совмес.ном присутствии таких белков 13 сырье на хптине сорбируется не один лизоцим, а сумм белков, имеющих сродство к хитину, т. е. лнзоцим, полученный по известному способу, содержит еще белковые примеси.

Предлагаемый способ обеспечивает получение фермептных препаратог, лизоцимов без белковых примесей.

Для этого ферментпые препараты десорбпруют дистиллированной водой. Процесс адсорбцни хитпном следует проводить путем пропуска раствора сырья или экстракта его через слой хитина в присутстьчш М»С! с концентрацией 0,5 — 1,00/о при рН 5,5.

Для очистки выделенных водных растворов ферментных препаратов лизоцимов от низкомолекулярных небелковых примесей (itI»CI) и продуктов частичного гндролиз» xIITIIIiil олигасахарндов (если онн есть) целесообр»зно провести повторную лдсорбцпю рлстгора

11>ерментного препарата лизоцимл х11тином с после, чующей десорбцией его 0,5 — I,0%-1II.I I растьоро>1 уксусной кислоты. Пр1: этом 11013торную ",дсорбцню рекомендуется т рогодить г. присутствии 0,1 М натрии- н,чи кллийфосфатного буфера при рН 7,9- — 8.0. Perettepitpoвать хптщ после десорбци 1 ферме 1тного llpeПгlРсlт:l,t!IЗОЦПМ013 ДИСTII 1;III Pλ!!НОII ВОДОII (т. е. пос.чс первой стлдни) и лесоооразно 2 —5%-пым растворе м уксусной к 1с, оты. После второй стл jtttt хнт11 регенерируетсp. лвтомлтпческп при десороции лнзопихуов 0,5 — 1,,1lой l КС т Ci1011 КИС 70той.

ПРЕ ЧЛЛ Гсl Е .>1ЬПI СПОСОб ЗЛ КЛIОЧ »ЕТСЯ I: С. Ie0Чт ющех .

Через колснку, нлпол1.ctltlyIO хпти11ом с рлзмерох частиц 50---250 III и >, p»13IIOI3el.tietitiyIO с 0,5 1,0%-ным рлствором »С! в дистиллированной воде, пропускают исходный водпосолег>ой раствор сырья, содержащий лнзоцих

i5 C. CC11 C COIIX TCTI3 > IOII1пх1и 13OIt»IeСям;1. I ICX01,ный рлствор должен содержать "»С! 13 концентрации нс менее 0,5 — 1,0% и иметь рН 5.5.

В этих условиях лизоцпм целиком сорбируется 11;I . 11Т11не и задерж1!в»ется н» ко. 10нне> в то гремя к»к примеси проходят -tepee колон30 ку, нс зл,чер>кивлясь. Злгем через колонку

178771

Москва, центр

Тнпографiiÿ, пр. Сапунова, 2 пропускают 0,5 — 1,0%-пый раствор 1 !ЯС1 в дистиллированной воде, окончательно отмывая ее от примесей, а лизоцим продолжает оставаться на колонке. После этого через колонку пропускают дистиллированную воду, которая смывает с хитппя лизоцим. Если собранный водный раствор лизоцима содержит следы ХЯС! и олигясахаридов — продуктов частичного гидролиза хитина (последние практически отсутствуют, когда процесс ьыделения ведут при температуре, примерно равной 4 С), то раствор повторно пропускаютчерез колонку с хитином при рН 7,9 — 8,0. Для этого колонку уравновешивают с 0,1М натрий- или калийфосфат!!ым буфером при рН

7,9 — 8,0, а раствор лизоцпма, первично смытьш с колонки водой, зябуферивают до тог э же значения рН и молярности, добавляя концентрированный буферпг.п4 раствор или сухие соли в соответствующем количестве. Далее растгор лпзоцима пропускают через колонку, которую затем промывают дистиллировапнои водой. При этом удаляются соли и олигасахарпды, лизоцим же полностью осгается на колонке. Смывают лизоцим с колонки, проПУскаЯ чеРез нее 0,5 — 1,0>jp-пый РаствОР Уксусной кислоты. Собранный раствор лизоцимя высушивают обычным образом. Регенерируют колонку после первой стадии выделения лизоцима промыванием ее 2 — 5%-ным раствором уксусной кислоты; после второй стадии (в случае удаления солей 11 олигасахаридов пз лизоцпмя) х1:тпн в колонке !эегене1э11pyeTc>I

ЯВтоМатИЧЕСКП ПРИ СМЬ1ГЯНИП ЛНЗОЦПМЯ Окй-1,0%-Пой уксусной кислотой.

Пример 1. Извлечение лнзоцп in»з белка куриного яйца. 20 мл цсльпого кури !ого бе,чка разбавляют 0,1 >1 раствором NLIC!,чо объема 200 л!л. Полученный водно-солевой раствор Ое;п<а, свооодньш ог механических примесей, пропускают через колонку с размерамп

2 20 см, !Ра",îлпенную xIIT!!!lop! с размером частиц 75:-25 мо.гь, ура;,повешен:у!о предварительно с 0,1 М раствором ."",CL После этого Koчопку промывают тем же 0,1 М раство- ром КяС1, контролируя отмывку !!змеренпем! оптической плотности р",створа и", во !110 275—

280 лгмк па приборе СФ-4. 1(ог>!а оптическая

ПЛОТНОСТЬ Ив!ХОДЯЩЕГО lis КОЛОНКII PBCTLiOD I стала равна практически нуч!о (пвопустпли

1,5 л промывного раствор 1), через колонку пропускают,чпстиллировя!шую воду, смыгя я лизоцим. Контроль за в!..ходом лизоцпма вел!! так эке, как контроль за отмывкой. Практически весь лизоцим выше.1 между 100 — 300 .!ь! воды, т. е. в 200 л!л.,7опол !!те.чьпый контроль за полнотой пзвле le!i!is! лпзопима из исходного раствора проводят путем измерения ферментатпвной активност:I р,",створа. выходящего из колонки, как пя стадии посадки и

Составптспь

Редактор Р. Чи-"тоза Тстрс < Л. А. Каа»»и>нико

3:>каз 555, 4 Тиран> 55 i в>орин>

ЦНИПП1! Ксиптста ио дспаи пзобрессн>> п1эомывяния, тяк и ня стядии съlывания лизоцима водой. Активность измеряли турбидиметрическим методом, используя в качестве субстрата суспензию бактериальных клеток

5 Мгсгососсцз Lisodeikticus, обычно используемую для этих целей. Практически весь лизоцим, содержавшийся в исходном растворе, был извлечен при промывании колонки водой и вышел в объеме 100 лгл.

10 Предлагаемый способ позволяет также извлекать лизоцимы из более дешевого сырья, чем белок куриного яйца, например из хрена, Пример 2. Извлечение лизоцима из хрена. 100 г хрена истирают на мелкой терке, 15 заливают 1 л воды и оставляют на 5 час при слабом перемешивании для полноты перехода лизоцимя в раствор. Затем отделяют раствор от механических примесей, добавляют

ХaCi до концентрации 1% и полученный рас20 твор пропускают через колонку 2)<20 см с хитипом размером частиц 75+25 люль, уравновешенную с 1%-ным раствором NaCL Далее повторяют те же операции, что и при выделен!и! лизоцима из белка куриного яйца. Весь лпзсци м, содержавшийся в исходном экстракте, был смыт с колонки водой и вышел в об.ьеме 150 мл.

Предмет изобретения

50 1. Способ получения ферментных препаратов лизоцимов из содержащего их сырья путем смешивания этого сырья с водой и последующей адсорбции хитином, отличающийся тем, что, с целью получения ферментных препаратов лизоцимов без белковых примесей, их десорбпруют дистиллированной водой.

2. Способ по и. 1, orëu÷àþøuécÿ тем, что процесс адсорбции хитипом проводят путем пропуска смешанного с водой сырья через

40 слой xliтина в присутств!ш NnC1 с концентрацией 0,5 — 1.0% и при рН 5,5.

3. СПОСОб ГО П. 1, Отз!иЧа>ОгиийСя тЕМ, ЧтО, С целью возможности Очистки выделенных водпых рас; вopnii ферментных препаратов лизо45 I;;I»oi: от нпзкомолекулярных небелковых приМССЕй, iiaLipII»ep ХЯС1, 11 ПрОдуКтОВ Ч!!Стнтн!Ого п1дролпза хитпна — олигасахарпдов, в случае пх присутствия, проводят Повторную адсорбцпю р!cTI ора фермептного препарата лнзоцпмя хитино;! с последующей десорбцией его 0,5 — 1,0>>p-ш !м раствором уксусной кислоты.

4. Способ по и. -, отли alo!uuucя Те», что повторную адсорбцию растаopn ферментного препарата лпзоцима проводят и присутствии

0,1. i1 натрий- или калпйфосфатного буфера прп рН 7,9 — 8,0.

5. Способ ilo п. 1, от.гичи!о!ггийа L тем, что регеii! рани>о хптина проводят 2 — 5%-ны.,! рас60 тво!эом 1 кс>>спой KHc IOTbl.

М. Андрсева ва Коррскторьп Т. Н. Костикова и Л. E. Марисич

up " >» : . Обвеьи 0,2! изд. д. Подписное б и откр кз>пi при Совете Мини зтоов СССР пр. Серова, д. 4