Способ получения @ -интерферона лошади

 

Изобретение относится к способу получения нового интерферона, в частности к способу получения лошадиного интерферона типа у. Способ получения у-интерферона лошади заключается в том, что из печени лошади выделяют высокомолекулярную ДНК, которую обрабатывают эндонуклеэзой Sau ЗА, полученные фрагменты длиной 1020 т.п.н. отделяют, дефосфорилируют. клонируют в лямбда-векторе и выделяют ген интерферона из полученной библиотеки ДНК, реклонируют ген в векторы экспрессии, полученными рекомбинантными ДНК трансформируют штаммы Е. coli с последующим выделением и очисткой целевого продукта.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (!9) (!)) (st)s С I2 N 15/23

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

Ф !

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4203834/13 (22) 09.12.87 (31) Р 3642096.4 (32) 10,12,86 (33) DE (46) 23.12.91. Бюл. ¹ 47 (71) Берингер Ингельгейм Интернациональ

ГмбХ (0Е) (72) Рудольф Хауптманн, Адольф Химмлер и

Петер Светлы (АТ) (53) 575.224,2, 577:2(088,8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ у-ИНТЕРФЕРОНА ЛОШАДИ

Изобретение относится к способу получения интерферона, в частности к способу получения лошадиного интерферона типа у, Способ получения у-интерферона лошади заключается в .том, что из печени лошади выделяют высокомолекулярную ДНК, которую обрабатывают эндонуклеазой Sau

ЗА. полученные фрагменты длиной 10 — 20 т.п.н. отделяют, дефосфорилируют, клонируют в лямбда-векторе и выделяют ген интерферона из полученной геномной библиотеки ДНК, реклонируют ген в векторы экспрессии, полученными рекомбинантными ДНК трансформируют штамм Е,соИ с последующим выделением и очисткой целевого продукта, Пример. Стадия 1. Выделение лошадиной ДНК, Замороженную печень лошади размалывают в жидком азоте до тонкого порошка и в течение Зч при 55 С инкубируют в 0,5 M (57) Изобретение относится к способу получения нового интерферона, в частности к способу получения лошадиного интерферона типа у. Способ получения у-интерферона лошади заключается в том, что из печени лошади выделяют .высокомолекулярную

ДНК, которую обрабатывают эндонуклеазой Sau ЗА, полученные фрагменты длиной

1020 т.п.н. отделяют, дефосфорилируют. клонируют в лямбда-векторе и выделяют ген интерферона из полученной библиотеки ДН К, реклонируют ген в векторы экспрессии, полученными рекомбинантными ДНК трансформируют штаммы Е. coii с последующим выделением и очисткой целевого продукта. этилендиаминотетрауксусной кислоте (ЭДTYI), 10 мМ трис-НС!, рН 8,0, 0,57, додецилсульфата натрия (ДСН) и 0,1 мг/мл протеиназы К (20 мл/г ткани). Полученный вязкий раствор освобождают от белка путем однократной экстракции фенолом и трехкратной экстракции смесью фенола с хлороформам и изоамиловым спиртом (25;24;1 по объему), диализуют в растворе 50 ммоль трис-HCI, рН 8,0, 10 ммоль ЭДТУК, 10 ммоль хлористого натрия и ДНК осаждают двумя объемами этанола. После полного высушивания в вакууме ДНК растворяют в ТЕ-буфере (10 ммоль трис-HCI, рН 8.0, 1 мМ ЭДТУК) при 4 С, центрифугируют в растворе хлористого цезия 1,273 г/мл при 40000 об/мин в течение 62 ч при 20 С, фракции, содержащие ДНК, диализуют в ТЕ-буфере, ДНК осаждают двумя объемами этанола, промывают 70ф,-ным этанолом, высушивают и снова растворяют в ТЕ-буфере при 4 С.

Полученный препара ДНК свободен от

РНК и имеет длину более 50 т,п,н. (определено путем электрофореза на 0,45% ном агарозном геле),Стадия 2, Частичное переваривание эндонуклеазой и фракционирование по величине лошадиной ДНК.

50 мкг лошадиной ДНК вместе с 1,6 ед, Sau ЗА инкубируют при 37 С в 450 мкл реакционной среды (10 ммоль трис-HCl, рН

7.5, 10 ммоль хлористого магния, 1 MMonb дитиотреитола). Через 15, 25 и 40 мин отбирают по 150 мл аликвотной части и смешивают с 15 ммоль ЭДТУК и прогревают в течение 10 мин при 70 С для остановки реакции. После добавления 0,3 моль ацетата натрия, рН 6,0, ДНК осаждают с помощью

2,5 объема этанола. После повторного растворения в TE-буфере ДНК разделяют по величине в ТВЕ-буфере (10,8 г/л трис, 5,5 г/л борной кислоты, 0,93 г/л динатриевой соли ЭДТУК) путем электрофореза при 1

В/см на 0,45%-ном агарозном геле в течение ночи. ДНК расщепляют рестриктазами

EcoR1 и Hind 111 и выделяют фрагменты

ДНК длиной 10 — 23 т.п.н. путем электроэлюации при 300 В в течение 3 ч (буфер 5 0,1 х

ТВЕ), очищают на колонке марки "Элютип

Д" и затем осаждают зтанолом.

ДНК дефосфорилируют, Для этого ДНК вместе с 5 ед. кишечной бычьей фосфатазы инкубируют в течение ЗО мин при 37 С в 140 мкл реакционной среды (50 ммоль трис-HCi, рН 9,5, 10 ммоль хлористого магния, 0,1 ммоль ацетата цинка, 1 ммоль спермидина), добавляют 5 ед. фермента и инкубируют в течение 30 мин. После добавления ЭДТУК до конечной концентрации 25 ммоль ДНК экстрагируют однократно смесью фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом (25:24:1 по объему), двукратно смесью хлороформа с изоамиловым спиртом (24;1 по объему) и трехкратно простым диэтиловым спиртом, осаждают этанолом, высушивают и растворяют в 0,1 х ТЕ-буфере, Стадия 3. Получение библиотеки лошадиной геномной ДНК, Дефосфорилированные длиной 10 — 23 . т.п.н. фрагменты лошадиной ДНК клонируют в лямбда-векторе, например лямбдаЕМВЕЗ или ЕМВ1 ЗА, с выступающими

G-А-Т-С-концами путем удаления внутреннего Barn Н1-фрагмента фаговой ДНК.

Вектор выращивают в штамме Е,со!! с супрессорным фактором SupF., например

Е.coti NM 526, 538 или 539, в LB-бульоне с 5 ммоль сульфата магния, осаждают полиэтиленгликолем и очищают путем двукратного центрифугирования при 45000 об/мин и

20 С в течение 40 ч с использованием хло5

ЗО

55 рида цезия в качестве градиента плотности (0,71 г/мл раствора). После диализа в ТЕ-буфере фаговую ДНК освобождают от белка путем двукратной экстракции смесью фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом (25:24:1 по обьему) и двукратной экстракции смесью хлороформа с изоамиловым спиртом (24;1 по объему), затем концентрируют путем осаждения этанолом, Для получения концевых фрагментов

MBL ЗА 50 мкг фаговой ДНК полностью переваривают с помощью Вагп Н1 втечение

2 ч пои 37 С в 45 мкл реакционной среды (10 ммоль трис-HCI, рН 7,5, 10 ммоль хлорида магния, 1 ммоль дитиотреитола), после чего реакцию прекращают путем добавления 15 ммоль ЭДТУК на 10 мин при 70 С. ДНК осаждают этанолом, Во избежание повторного лигирования средний фрагмент режут с помощью FcoR1 и отделяемый при этом олигонуклеотид удаляют путем осаждения изопропанолом.

Полученную ДНК полностью переваривают с помощью EcoR1 в течение 2 ч при

37 С в 450 мкл 10 ммоль трис-НО, рН 7,5, 100 ммоль хлористого натрия, 10 ммоль хлористого магния и реакцию прекращают путем добавления 15 ммоль ЭДТУК и

10-минутного прогревания при 70 С. После добавления ацетата натрия до конечной концентрации 0,3 М три больших фрагмента

ДНК осаждают с помощью 0,6 объема изопропанола в течение 15 мин при О"С, промывают 2 раза 0,45 M ацетата натрия (0,6 объема изопропанола) и однократно с помощью 0,3 М ацетата натрия (2,5 объема этанола) и растворяют в 15 мкл 0,1 х ТЕ-буфере. При этом линкеры Barn Н1/EcoR1 осаждаются в растворе.

Фрагменты EMBL3A(8 мxr) объединяют примерно с 5 мкг лошадиной ДНК длиной

10 — 23 т,п.н, и 10 ед. Т4 — ДНК-лигазы и инкубируют в течение ночи при 14 С и один день при 4 С в 50 мкл среды лигирования (66 ммоль трис-HCi, рН 7,2, 0,1 M хлорида натрия, 10 мМ хлорида магния, 1мМ ЭДТУК, 5 мМ дитиотреитола, 0,5 MM трифосфата аденозина — АТФ). Лигированную смесь ДНК упаковывают в зрелые лямбда-фаговые частицы.

Компоненты этой системы, т,е, ультразвуковой экстракт (УЭ), лизат, получаемый путем замораживания — размораживания (ЛЗР), буферы М1 и А приготавливают известным образом. 10 мкл аликвотной части смеси лигированной ДНК инкубируют при комнатной температуре в течение 2 мин вместе с 25 мкл УЭ, который так же, как и

ЛЗР размораживают во льду в течение

30 мин, смешивают с 100 мкл ЛЗР и инку1701114

10 бируют далее в течение 60 MHH при комнатной температуре. Полученну.о смесь разбавляют 150 мкл лямбда-разбавителя (100 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ сульфата магния, 1 мМ ЭДТУК) и хранят при 4 С.

Стадия 4. Клонирование и анализ последовательностей гена для лошадиного интерферана типа гамма.

Выделение клона полношго гена для лошадиного интерферона типа гамма, Бактериальную культуру, растущую в течение ночл в LB-питательном растворе (10 г/л хлористого натрия, рН 7,4), содержащем

0,2% мальтозы, доводят до оптической плотности 2,0 (при 600 нм). По 0,5 мл этой суспензии инфицируют 50000 ед, лямбдафагов библиотеки ДНК и с помощью слоя мягкого агара распределяют по i В-агаровым пластинкам, содержащим 10 мМ сульфата магния, Пластинк имеют диаметр 13,5 сМ. Скринингу подверга от всего 1,5 х 10 рекомбинантных лямбда-фагов. После инкубации в течение ночи при 37 С фаги каждой пластинки используют для приготовления двукратных репликонов на нитроцеллюлозе. После денатурации фаговой ДНК (1 мин

0,5 н.гидроокиси натрия, 1,5 M хлористого натрия), нейтрализации (2 раза в течение 3 мин в 0,5 M трис-НС!, рН 7,5, 1,5 M хлористого натрия) и промывки (1 мин в буферах

2xSSC, 1xSSC, 0,15 M хлористого натрия, 15

MM цитрата натрия) фильтры сушат на воздухе, ДНК фиксируют при 80 C а течение 2 ч, Фильтры промывают при 65"С в течение ночи в растворе 1,5 M хлористого натрия, 10 мМ трис-HCI, рН 8,0,0,1; ДСН, подверга от предварительной гибридизации при 65 C в течение 4 — 6 ч (раствор для гибридизации;

0,9 М хлористого натрия, 50 мМ гидрогенфосфата натрия, рН 7,4, 5 MM ЭДТУК, 0,1% фиколла, 0,1% полиBèíèënèðролидона, 0,1% альбумина сыворотки крупного рогатого скота, 0,1% ДСН, 20 мг/мл ДН К спермы лосося, подвергнутой ультразвуковой обработке и денатурации).

Гибридизацию осуществляют в свежем растворе с использованием 10 cpm на б фильтр с радиоактивно маркированной пробой человеческого гамма интерферона при

65 C в течение 20 ч, Фильтры промывают при 65 С в буфере Зх85С, 0,1% ДСН, сушат и подвергают ауторадиографии, После трехкратной очистки пятен идентифицируют пять лямбдэ-клонов, которые проявляют положительные сигналы гибрлдизации.

i/la этих выделившихся рекомбинантных фагов ДН К очищают известными приемами, После переваривания различными рестрик15

55 ционными энэимами и последующего анализа по Саузерну фаговые ДНК характеризуют путем гибридизации пробой человеческого гамма-интерферона, Выделяют единственный гибридизирующийся

BarnHl-фрагмент длиной 4,6 т п.н, клона ламода ЕЦ вЂ” )f2, который клонируют в местО разреза Bam Н1 известной плазмидой

pUC9.

После трансформации Е.cali JM101 из полученных колоний по способу приготовления мини-препаратов получают плазмидную ДНК, которую характеризуют путем переваривания рестрикционными энзимами, Плазмиду с желаемой вставкой Bam Н1 обознача от как рАН111, После введения в известные векторы Mi! Зм р8 или

М13мр9 BamH1-вставки плазмиды рАН111 подвергают анализу последовательностсй по дидезокси-методу. Сравнение последовательностей с геном человеческого интерферона типа гамма показывает большу о гомологию с некодирующими 5 — и 3 -областями. По этим

I результатам заключают, что выделен полный ген лошадиного гамма интерферона, Анализ последовательностей гена flo шадиного интерферона т dna гамма, выделенного из клона лямбда ЕО- »2.

Bam Н1 — вставкудлиной4,6т.п,н. плазмиды рАН111 подвергают полному анализу последовательностей. Общую последовательность фрагмента Bam Н1 определяют путем сочетания частичных последователь— ностей субклонов М13, которые получают путем направленного клонирования рестрикционных фрагментов (EcoR1. Hind 111, Pst1, Pst1 — В9 11, Hind 111 — Bam Н1) в соответственно разрезанные векторы

М13мр8 или М13мр9. Дальнейшле частичные последовательности получают эа счет клонирования фрагмента Bam Н1 — Bgl 11 длиной 2,0т.п.н. Или фрагмента Pst1 длиной

2,0 т.п,н. в вектор М13мрЯ. Оба фрагмента

ДНК разделяют на меньшие куски путем ультразвуковой обработки, концы ДНК делают тупыми путем инкубации ДНК-полимераэой 1 из Е.cali (фрагмент Кленова) в присутствии всех четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, каждый из которых. применяют в количестве 0,1 мМ (реакционньиЛ буфер; 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ хлорида магния, 1 мМ дитиотреитола, 0,5 мг/мл альбумина сыворотки крупного рогатого скота, 1 ч, 25ОС). После фракционирования в агарозном геле ДНК-фрагменты длиной примерно 0,4 — 1,0 т.п.н, выделя от и лигируют в место разреза Sma1 вектора М13мр8, Полученные последовательности обьединя1701114 ют с помощью компьютерной программы с получением общей последовательности длиной 4664 пар оснований.

После анализа с использованием компьютера открытых рамок чтения и сравне- 5 ния с генами интерферона типа гамма другого происхождения определяют кодирующую область гена гамма-интерферона лошади. Кодирующая область включает три интрона, причем первый кодирует гидро- 10 фобный сигнальный пептид длиной 20 аминокислот и 18 аминокислот полипептида зрелого лошадиного интерферона типа гамма (основания 366 — 479). Второй эквон кодирует аминокислоты 19 — 41 (основания 15.

1639 — 1707), третий экзон — аминокислоты

42-102 (основания 1803-1985), а четвертый экзон — карбоксиконец с аминокислотами

103 — 146 (основания 3307 — 3441). В положениях 4010 и 4020 находятся две сигнальные 20 последовательности (ААТААА) для полиаденилирования м Р Н К. В положениях 86 — 88 полипептида для зрелого лошадиного гамма-интерферона находится единственное . возможное место N-гликоэилирования 25 (AsN-Ser-Ser), которое совпадает с вторым местом N-гликозилирования (Азп-Gly-Ser) бычьего интерферона типа гамма. Неожидаемым образом полипептид для зрелого лошадиного гамма-интерферона содержит 30 только один единственный цистеиновый остаток в положении 3, причем аналогично природным, человеческим и мышиным гамма;интерферонам первые три аминоконцевые аминокислоты (s .этом случае 35

Tyr-Tyr-Cys) по всей поверхности протеолитически отщепляются в теле.

СТадия 5, Получение синтетического гена для зрелого лошадиного интерферона типа гамма, 40

Синтетический ген для зрелого лошадиного гамма интерферона конструируют в виде двух вариантов с использованием 16 различных олигонуклеотидов, Первый вариант кодирует зрелый интерферон с 146 амийокислотами плюс стартовый метионин, а второй вариант — на концевой аминогруппе укороченный на 3 аминокислоты (Tyr-ÒóãCyr) полипептид плюс с артовый метионин, как в организме, Синтез гена гамма-интерферона лошади осуществляют в две стадии. На первой стадии осуществляют конструкцию первой части гена с использованием восьми олигонуклеотидов EG-1 — EG-8 до места разреза

SaI1, а на второй стадии — конструкцию второй половины гена с использованием шести олигонуклеотидов EG-9 — EG-14, размещенных от места разреза Sal1 до места разреза Ham Н1. Для конструкции укороченного на три аминокислоты на концевой аминогруппе варианта лошадиного гаммаинтерферона используют олигонуклеотиды

EG-15 и EG-16 вместо олигонуклеотидов Е61 и Е6-2. Комплементарные олигонуклеотиды парами подвергают фосфорилированию на 5-конце. По I00 пмоль обоих олигонуклеf отидов (например, EG-3 и EG-4, EG-5 и Е6-6 и т,д,) инкубируют*10 ед. Т4-полинуклеотидной киназы при 37 С в течение 10 мин в 9 мкл реакционного буфера (70 мМ трис-HCI, рН 7,6., 10 MM хлористого магния, 5 мМ дитиотреитола), 2 мкКч (P Р) АТФ. Затем добавляют 1 мкл раствора 10 мМ АТФ и инкубируют при 37 С в течение 50 мин, Реакцию прекращают путем 10-минутного нагрева до 95 С, В целях предотвращения последующего связывания концов ДН К олигонуклеотиды Е6-1, EG-15, Е6-9 и EG-14 не фосфорилируют. После инактивации полинуклеотидкиназы их смешивают с соответствующим комплементарным олигонулеотидом, нагревают до 95 С в течение 5 мин и охлаждают до комнатной температуры. Смеси олигонуклеотидов

ЕО-1 + EG-2 (или EG-15 и E6-16), EG-3 + EG-4, EG-5+ EG-6 и Е6-7+ EG-8 обьединяют, смешивают с 1 мкл 5 M хлористого натрия, нагревают до 70 С в теченине 5 мин и охлаждают до комнатной температуры. К раствору добавляют 5 мкл 10 MM АТФ, 2 мкл дитиотреитола, 1,5 мкл 10 х буфера лигирования (0,66 М трис-HCI, рН 7,2, 1 M хлористый натрий, 100 мМ хлористого магния, 10 мМ ЭДТУК, 50 мМ дитиотреитола) и 80 ед.

Т4 ДНК-лигазы и инкубируют при 4 С в течение 48 ч, За ходом реакции лигирования наблюдают путем разделения электрофорезом в 5%-ном полиакриламидном геле фрагментов ДНК небольшой части реакционной среды и последующей ауторадиографии.

Аналогично связывают один с другим шесть олигонуклеотидов Е6-9 до EG-14. Реакцию прекращают экстракцией фенолом и хлороформом, ДН К выделяют осаждением этанолом, Стадия 6. Введение синтетического гена в плазмиду pRH-100, 10 мкг плазмиды pRH-100 расщепляют рестриктазой Sac1 в 100 мкл реакционного буфера и этим инактивируют путем 10-минутного нагрева до 70 С. ДНК обрабатывают фрагментом Кленова при 25 С в течение

30 мин в присутствии всех четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, каждый из которых берут в количестве 10 мкМ. Реакцию прекращают зкстракцией смесью фенола с хлороформом, ДНК концентрируют осаждением этанолом, В результате этой обработки за триптофановым промотором образуется ту1701114 l0

55 пой конец ДНК, который заканчивается трансляционным стартовым кодоном ATG.

Линеаризированную плазмидную ДНК расщепляют рестриктазой BamH1 и векторную часть выделяют электрофорезом в агарозном геле.

50 нг подготовленного таким образом плазмидного вектора pRH-100 смешивают с

20 пмоль лигированных олигонуклеотидов

EG-1 до Е6-8 и EG-9 до Е6-14 и в 10 кмл буфера лигирования (66 мМ трис-HCl, pH

7,2, 100 мМ хлорида натрия, 10 мМ хлорида магния, 1 мМ ЗДТУК, 5 мМ дитиотрейтола, 1 мМ АТФ) инкубируют 1 ед. Т4-ДНК-лигазы при 14 С в течение 24 ч. Обработанные кальцием клетки E,coll 1Ы-101 трансформируют этой лигазной смесью и инкубируют при 37 С в течение ночи. Иэ полученных трансформатов выделяют плазмидную

ДНК, структуру ко — îðîé определяют рестрикционным анализом и анализом последовательностей вставки Hind 111 Bam H1, Плазмиду желаемой структуры для экспрессии зрелого лошадиного интерферона типа гамма обозначают как pEqG-YYC1. Аналогич и ы м образом ол и гон уклеотиды EG-15, EG-16, EG-3 до EG-8 и EG-9 до EG-14 клонируют в вектор pRH-100 с тем, чтобы получить укороченный на три аминокислоты лошадиный интерферон типа гамма. Плазмиду желаемой структуры обозначают как

pEqG-aAA1.

Стадия 7. Экспрессия интерфероновой активности штаммом Е.соИ НВ101, содержащим плазмиду pEq-YYC1 или pEqGQAA1, 100 мл бактериальной культуры инкубируют при 37 С и при интенсивном встряхивании в следующей, не содержащей триптофана в среде (данные на литр среды):

10 г фосфата аммония, 3,5 г гидрогенфосфата калия, рН 7,3 с помощью гидроокиси натрия, 0,5 г хлористого натрия, 21 г

Саз-аминокислот (подвергнутых кислотному гидролизу), 11 r глюкозы, 1 мМ сульфата магния, 0,1 мМ хлорида кальция, 1 мМ тиамина- HCI, 20 мг (=цистеина, 20 мг 3-Р- индолакриловой кислоты. Кроме того, среда может содержать еще 50 — 100 мг ампициллина. После инкубации среду центрифугируют при 4000 об/мин в течение 5 мин, осадок суспендируют s охлажденном буфере (50 мМ трис-HCI, рН 8,0, 30 мМ хлорида натрия), взятом в количестве 1/10. Клетки дважды в течение 30 с разрушают ультразвуком (при

20 кГц, 100 Вт). Остатки разрушенных клеток удаляют центрифугированием в течение

10 мин при 10000 об/мин при 4 С и после стерилизующей фильтрации надосадочную жидкость проверяют на интерференовую

11

45 активность путем определения цитопатического эффекта везикулярного вируса стоматита (ВВС) или вируса энцефаломиокардита (ВЗМ)

Тест-система: клетки NBL-6 (АТСС CCL

57, клетки лошадиного эпидермиса)/ВВС;

А 549 (АТСС СС1 185, клеточная линия опухоли легких человека)/ВЗМ.

Титр на клетках А 549 нормируют на международные единицы с помощью стандарта человеческого интерферона. Штамм E.coll

СЯВ603 трансформируют плазмидами, бактерии селекционируют нг содержащих ампициллин агаровых плитках. Для приготовления макси-клеток и маркировки протеинов клетки выращивают при 37 С до оптической плотности 0,5 при 600 нм в 15 мл среды (см. стадию 7) без индолакриловой кислоты и 10 мл этой культуры в качающейся чашке Петри, облучают в течение 5 с с помощью установленной на расстоянии 50 см от чашки лампой (15 Вт), после чего и кубируют при 37 С в течение 1 ч. Культуры смешивают с 100 мкг/мл D-циклосерина, инкубируют при 37 С в течение 14 ч, бактерии отделяют путем центрифугирования.

Клетки дважды промывают 5 мл солевого раствора Хершей, в 5 мл среды Хершей суспендируют 20 мкг/мл индоакриловой кислоты и инкубируют при 37 С в течение 2 ч. К каждой культуре добавляют 5 мкКи/мл Sметионина (1000 Ci/ììîëü) и встряхивают при 37 С в течение 1 ч. Клетки отделяют, лизуют в буфере для электрофореза, содержащем ДСН и 2-меркаптоэтанол, и протеины разделяют в 15/-ном полиакриламидном геле.

Состав солевсго раствора Хершей (на 1 л):

NaCl 5-4 г

КС! 3,0 г

NH4Cl 1,1 г

СаСЬ 2Н20 15 мг

MgCb 6Н О 0,2 г

FeCb 6HzO 0,2 мг

КНОРР Оп 87 мг

Трио-H Ci 12,1 г рН 7,4, Состав среды Хершей (на 100 мл солевого раствора Хершей):

2 мл 20Я, глюкозы

0,5 мл 2;4 треонина

1,0 мл 1 лейцина

1,0 мл 2;ь пролина

1,0 мл 2 аргинина

0,1 мл 0,1 Д тиамина

Ауторадиографию высушенного геля осуществляют 2 дня при -80 С на рентгеновской пленке с использованием усиливающей пленки, В качестве стандарта

1701114 молекулярного веса применяют смесь Сt4 метилированных протеинов. В качестве контроля применяют плазмиду pER103, которая содержит только промотор без гена интерферона, и плазмиду pER21/1, которая содержит две копии гена человеческого интерферона типа Альфа2агс.

Стадия 8, Доказательство наличия гомолсгичных последовательностей в лошадином геноме с геном ЕцИФ-) .

30 мкг высокомолекулярной лошадиной

ДНК (см. стадию 1) полностью переваривают с помощью 60 ед. соответствующего рестракционного фермента в 200 мкл реакционного объема и каждый раз 10 мкг этой разрезанной ДНК разделяют по вели чине в 0,87;-ном агарозном геле. После переноса на нитроцеллюлозные фильтра, денатурации и фиксации ДНК каждый фильтр гибридизуют 17 ч при 65 С, 5хбуфер

SSC, 5 х раствор Денхардта, 0,1%,ЦСН, 20 мкг/мл денатурированной ДНК из спермы лосося в присутствии примерно бх10 cpm радиоактивно маркированной пробы.

В качестве пробы для ЕцИФ-) применяют фрагмент из плазмиды pEqG-УУС1, который содержит последовательность, кодирующу о весь зрелый интерферон. Затем фильтры промывают4 раза в течение45 мин при 65 С с помощлью 0,3хЯЯС/45 мМ хлрида натрия, 4,5 мМ цитрата натрия, 0,1

ДСН, Ауторадиографию осуществляют на рентгеновской пленке с использованием усиливающей пленки при -80 С в течение 7 дней.

Стадия 9, Экспрессия лошадиного интерферона типа y(QAA) в Е.coli H 8101/pEGQAA2 и НВ101/pEgG-ОААЗ.

Для достижения улучшенной экспрессии используют улучшенные экспрессионные векторы и улучшенное место рибосомального связывания.

Улучшенные экспрессионные векторы основаны на промоторе trp иэ Serratia

marcescens (Sma), который в области -35 путем замены основания (pRH281) приравнен к консенсусной области -35, или на гибридном промоторе trp, который имеет первую богатую А/Т область E.cîÈ (Есс) или вторую богатую А/Т область плюс промотор Sma (pRH282), В качестве мес га рибссомальнсго связывания используют энтеротсксин и из Е.coil. рЯН281/5.

Известным образом синтезируют следующие олигонуклеотиды

Trp-1: 5 -AATTGACGCTG — 3;

Trp-3, I

-АТСО CTAAAACATTGTG САААААОАОООТТ-GACATTGCCTTCGCGAACCAGTTAACTAGT

АСАСА-3;

Trp-5: 5— !

-AGTTCACGGCTCGAGACGGTAAGGAGGTTT

5 AATATGAGCTCGAATTCAT-3;

Trp-2: 5 -TTAGCGATCAGCGTC — 3;

Trp-4: 5I

-CGTGAAC i TGTGTACTAGTTAACTGGTTCG

CGAAGGCAATGTCAACCCTCTTTTTGCAAT

10 GTT-З;

Trp-6; 5—

-СОАТОААТТСОАО СТСАТАТТАААССТС СТ

ТАССОТСТСОАОС-З, По 100 пмоль олигонуклеотидов Trp-2—

15 Trp-5 раздельно фосфорилируют в 10 мкл реакционного раствора. Trp-1 и -2, Trp-3 и -4 и Trp-5 и -6 подвергают гибридизации путем кипячения и медленного охлаждения, Pac7Bopb! пар олигсчуклеотидов соединяют и

20 добавлением Т4-ДКА лигазы. 3 мкг рАЕ153 режут с помощью EcoR1 и Оа1, После очистки большого фрагмента к нему прибавляют приблизительно 20 пмоль олигонуклеотидов и лигируют. Затем ДНК

25 трансформируют в Е,coll НВ101 и плазмиды из полученных колоний выделяют. Фрагмент Pst-Нind111, содержащий промстор, подвергают анализу последовательностей.

После подтверждения желаемой последова30 тельности выбирают плазмиду и обозначают как pRH281/5.

Последовательность промоторной части следующая . -35

5-GAATTGACGCTGATCGCTAAAACATTGT

35 GCAAAAAGAGGGTTGACATTGC

3-СТТААСТОСОАСТАОСОАТТТТОТААСА

СОТТТТТСТСССААСТОТААСО

Xho1

40> -10 Transkriptionsstag

CTTCOCOAACCAOTTAACTAOTACACAAOT-TCACGG CTCGAGACGGTAAG

GAAG CG CTTGGTCAATTGATCATGTGTTCA-AGTG CCGAG CTCTG С САТТС

45 RBS Яы1 EcoRi Cia i

GAGGTTTAATATGAG CTCGAATTCATCGAT — 3

СТССАААТТАТАСТCGAGCTTAAGTAGCTA-5

Преимуществами нового экспрессионного вектора являются оптимальная область

- 35 в промоторе trp-Sma; единственное место Xho1 перед местом рибосомального связывания (ViPC), что допускает замену

МРС на другое; экспрессионная плазмида содержит трансляционный старт ATG на расстоянии 5 нуклеотидов от МРС; О этого

ATG является первым основанием последовательности опознавания Sst 1 (GAGCTC), Путем разреза с помщью Sst 1 и последую13

1701114

14 щего получения прямого конца получают экспрессионный вектор с трансляционым стартом ATG, с которым можно лигировать чужой ген, начиная с первого основания рамки считывания; связь MPC-ATG не содержит ни G ни С; выбором последовательности олигонуклеотидов на 5 -конце разрушается первоначальное место разреза EcoR1, благодаря чему на 3 -конце промотора можно получать место мультиклонирования, состоящее из $зс1, EcoR1, Cia1 и Hind 111 (уже в рАТ153).

p R Н282/5.

Аналогичным образом конструируют экспрессионный вектор pRH-282/5. Олигонуклеотиды Trp-1 и Trp-2 заменяют олигонуклеотидами Trp-7 и Тго-8:

Trp-7; 5«ААТТ6 C CCGTTCTGGATAATGTTTTTTG CG

СС6АСАТСАТСАТ6 СТ-З, Trp-8: 5—

-TTAG С6АТСА6CATGATGATGTCTCGG CGC

ААААААСАТТАТССА6ААС666С вЂ” 3 .

Последовательность промоторной части в pRH282/5 следующая;

51

- 6AATTGCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTG C-GCCGACATCATCATG CTGAT

3- CTTAAC6GG CAAGACCTATTACAAAAAACG-С66СТ6ТА6ТА6ТАС6АСТА

-35—

- CG CTAAAACATTGTG CAAAAAGAGGGTTGA

CATT6CCTTCG CGAACCAGT

GCGATTTTGTAACAC6TTTTTCTCCCAACT.-6ТААС66АА6С6СТТ66ТСА

Xho1

-101ТгапэИрбопээтагт RBS

TAACTAGTACACAAGTTCACGGCTCGACGG

- — TAA6GA6GTTTAATAT6A

ATTGATCATGTGTTCAAGTG CCGAGCTCTG

-ССАТТССТССАААТТАТАСТ

Sst EcoRi Clal

G CTCGAATT CAT CGAT — 3

CGAG СТТААСТА6 СТА — 5

1 мкг pUC18 разрезают с помощью Bam

Й1 и Яа! 1.Из 10 мкг EqGQAA1 путем разреза с помощью Bam Н1 и Sal1 выделяют и дефосфорилируют вторую половину гена лошадиного интерферона типау. 20 нг вектора лигируют с 100 нг вставки и ДНК трансформируют в Е.соИ JM101. Плазмиду одной колонии анализируют путем переваривания рестрикционными энзимами и обозначают как pCN1, pCN3.

Первую половину синтетического гена вместе с местом рибосомального связывания конструируют иэ олигонуклеотидов:

EqG-1: 5- AG CTTCCCTCGAGAGGTTGAGGTGATTTAT

6CAGGCTG СТТТСТТТААА6АААТС6АААА

CCTGAAAGAATACTTCAAC6CTCGTAACCC

5 AGACGTTGGT — 3;

EqG-2: 5—

- GACGGTGGTCCG СТ6ТТССТ66АСАТССТ

GAAAAACTGGAAAGAAGACTCTGACAAAAA

6АТСАТССА6ТСТСА6-3;

10 EqG-3: 5— ATCGTTTCTTTCTACTTCAAA CTGTTCGAAA

ACCTGAAGAAAGACAACCAGGTTATCCAGA

AATCGATGGACACTATCAAAGAAGATCTGT

TCGTTAAATTCTTCAACTCGTCGACTCCG — 3

EqG-4: 5— — AATTCGGAGTC6ACGAGTTGAAGAATTTAA

CGAACAGATCTTCTTTGATAGTGTCCATCG

ATTTCTGGATAACCTGGTTGTCTTTCAGGTT

20 TTCGAACAGTTTGAAGTAGAAAGAAAACGA

TCTGA6ACTG — 3;

EqG-5: 5— — 6ATGATCTTTTTGTCAGAGTCTTCTTTC CAG

TTTTTCAGGATGTCCAGGAACAG CGGAC CA

25 CCGTCACCAACGTC- 3;

EqG-6: 5- TGGGTTACGAG CGTTGAAAGTATTCTTTCA

GGTTTTCCATTTCTTTAAAGAAAG CAG С СТ

6ССАТАААТСАССТСААССТСТС6А66А — 3 .

30 По 50 пмоль олигонуклеотидов фосфорилируют, а именно EqG-2 вместе с EqG-5 в

7 мкл, EqG-3 и EqG-8 раздельно в 8 мкл.

Реакцию прекращают путем нагрева до

100 С. К EqG-3 добавляют 50 пмоль EqG-4 (1

35 мкл), а к EqG-8 — 50 пмоль EqG-1 (1 мкл), Растворы еще раз нагревают до 100 С и медленно охлаждают. Растворы олигонуклеотидных пар соединяют и лигируют Т4ДНК-лигазой в 30 мкл, 2 мкг pUC18

40 расщепляют EcoR1 и Hind111, векторную. часть очищают в геле и растворяют в 50 мкл воды, 40 нг вектора и около 2 пмоль лигированных олигонуклеотидов подвергают лигированию в среде 10 кмл, Полученной ДНК

45 трансформируют клетки E.coil JM101, Вставка EcoR1-Hind111 некоторых из полученных плазмйд переклонируют в М13 mp9 и устанавливают последовательность, Выбирают плазмиду с требуемой последова50 тельностью и обозначают как р6МЗ. рбюо.

Около 3 мкг рбй1 и pGN3 расщепляют

H!nd111 и Sal1. Очищают в геле вставку

pGN3 и вектор (вторая половина гена Eq55 ИФ- у из pGN1). 0,2 мкг pGN3 лигируют примерно с 0,05 мкг вставки pGN3 и ДНК трансформируют в Е.соП JM101. Плаэмиду полученного клона выбирают после проверки рестрикционного рисунка и обозначают как pGNZO.

15 рFqG-QAA2 или рEqG-С1ААЗ, Примерна иэ 10 мкг р61 ч 20 выделяют

>йо1-Есой1 фрагмент, содержащий ген синтетического гамма-интерферона .лошади вместе с местам рибасамального связывания энтеротаксина 111 из Е,са11, pRH281/5 или pRH282/5 расщепляют рестриктазамин

Xho1 и EcoR1, 20 нг вектора лигируют с 20 нг фрагмента, полученной ДНК трансформируют клетки Е.coil НВ101, из которых эапл аaмиды и и ро веря ат рестрик INOH?lblM анализом. Вь. аирают плазмиду, которую обоз?1ачак1т к;к pEqGQAA2 (вектор pRH281/5) или рЕцО ОААЗ (вектор: pRH282/5), Опыт по провеа <е активности интерфе рона типа гамма, Росшую в TOHOHNB Ho ?и культуру E.coll

НВ101/РЕЧС-ОАА2 или НВ101/pFqG-аАЛЗ разбавляют в соотношении 1:100 1 В-буферам (100 г/л триптана, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л хлористого натрия. 50 мг/л ампициллина) и далее инкубиауют при 37ОС, После достижения оптической плотности

0,3 (600 нм) добавляют 50 мг/л индолакрилавой кислоты и культуру инкубируют в течение дальнейших 2 ч при 37"С. Бактерии отделя ат центрифугираванием vi разрушают путем ультразвуковой стерильной фильтрации, надасадачную жидкость испытывают на клетках МВ1=6 (АТССССl 57) на активность гамма-интерферона, причем в качестве вируса используют веэикулярный вирус стоматита. Лизаты обеих трансформированных бактериальных культур (Е.соИ

НВ101/pEqG QAA2 или НВ101/pEqGОААЗ) праявля от около 0,1 — 1 мпн ед,/мл интерферанавой активности, В качестве контроля испытывают идентично полученный лизат Е,col! H 8101/pRH281, Этот контрольный лизат проявляет меньше чем 100 ед./мл.

Формула изоб ретени я

Способ получения у-интерферона лошади, заключающиЙся в там, что иэ печени лошади при рН 8,0 экстрагиоуют ДНК с использованием фенола, элюат диатизуют

ДНК осаждают этаналом, центрифуги руют в буфере рН 8,0, диалиэуют и осажджат этаналом ДНК размерам более 50 т.п.н„полученную ДНК расщепляют эндонуклеазой

Sau 3A при рН 7,5., фракциоиируют с помощь1о электрафореза, выделяют фрагменты длиной 10-23 т.п.н„ дефосфорилируют их и клониру ат в векторе ЕМВ1 3 (-ЗА), путем скрининга клонированных фрагментов

ДНК отбирают фрагмент, гамолагичный гену гамма-интерферона человека, отобранный фрагмент размерам 4,6 т,п.н. расщепляют рестриктазой Ham Н1, встраи10 вают в вектор pUC9, полученными рекомбинантными ДНК трансформируют бактерии

Escherlchia соП JM101, отбирают плазмиду рАН111, содержащую Ham Н1, синтезируют фрагмен, состоящий из 14-ти олигонуклеотидов ЕС 1 — EG 14, который встраивают в плазмиду pRH100 по сайту рестрикции Sacl путем загупления выступающих концов

ДНК обработкой фрагментом Кленова в присутствии четырех деэоксинуклеотидтрифосфатов и дополнительным гидролизом Вав

Н1, далее полученной рекомбинантнай ДН К трансформируют бактерии Е.coll JM101, продукты трансформации, содержащие плаэмиду рЕа6-УУС1 или рЕцС-QAA1, культивируют, анализируют на интерферановую активность выделенный и очищенный ионообменной храма аграфией и гель-хроматографией белок, синтезируloT алигануклеотиды

Trp 1-6 или Тгр 1-8 со гледующими нуклеотидн ыми последовательностями:

Trp-1: 5 -ААТТОАСОСТС-3;

Trp-3: 5l

"АТОС СТААААСАТТОТОСАААААОАСООТ

25 GACATTGCCTTCGCGAACCAGTTAACTAGT

АСАСА — 3

Тгр-5: 5.1

-AG TTCACGGCTC6AGACGGTAAGGAGG TTT

ААТАТОАО СТС6ЛАТТСАТ вЂ” 3 ;

ЗО Trp-2: 5 - ГТАССОАТСАОСОТС вЂ” 3;

Trp-4: 5-СОТОААСТТ6Т6ТАСТАСТТЛАСТ66ТТСС

CGAA6GCAATGTCAACCCTCТТТТТ6САСА

AT6TT — 3;

35 Trp-6: 5-С6АТОААТТССАОСТСАТАТТАААССТССТ

ТАСССТСТС6А6С-";

Тгр-7: 5—

- AATTGCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGC

40 СОАСАТСАТСАТО СТ-3 ;

Тгр-8, 5—

-TTAG CGATCAG САТОАТОАТОТСС6 CG САА

AAAACATTATCCAGAAC6GG C — Зъ затем получают фрагменты, кодирующие

45 промотор и место рибосомнага связывания, лигируют их с большим фрагментом разрезанной EcoR1 и С!а1 плаэмиды рАТ153, трансформируют полученной ДНК штамм бактерии Е,са11 НВ101 и выделяют плазми50 ды pRH281/5 или pRH282/5, параллельно вектор pUC18 обработанный Bam Н1 и Sal1

3HDoH/KIlaa3oÉ, Il?lrиРУют с 8ToP0A rloIloB?lной синт тическаго фрагмента, полученного в результате переваривания плазмиды

55 EqG-QAA1 эндонуклеазами Ham Н1 и Sal1 и дефосфарилирования, полученной ДНК трансформируют бактерии E,со11 JM101 и выделяют плазмиду рСК1 или вектор

pUC18, обработанный эндонуклеазами

EcoR1 и Н1пб 111, лигируют с алигануклео1701114

Составитель Т. Забойкина

Техред М.Моргентал Корректор М. Максимишинец

Редактор Н. Бобкова

Заказ 4480 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 тидами EqG-1 — EqG-6 или EG3 — Ебб,полученной ДК трансформируют бактерии

Е.coll JM101, выделяют плазмиду pGN3, плазмиды pGN1 и pGN3 обрабатывают Hind

111 и Sal1, подвергают гель-очистке с последующим лигированием, трансформируют полученной ДНК бактерии Е.coll JM101 и выделяют плазмиду pGN20, далее выделяют

Xho1-EcoR1 фрагмент ДНК, содержащий синтетический re a-интерферона с местом рибосомного связывания Е,coll Entегоtoxln

ll, который лигируют с плазмидами pRH

281/5 и pRH 282/5, обработанными Xho1 и

EcoR1, эндонуклеазами, полученной ДНК

5 трансформируют штамм бактерии Е.coll

НВ101, продукты трансформации, содержащие плазмиду pEqG-QAA2 или pEqG-QAA3, культивируют с последующим выделением интерферона и его очисткой путем ионообменной

10 хроматографии и гель-хроматографии.