Штамм бактерий jersinia реsтis, предназначенный для проведения генетических и эпизоотологических наблюдений

 

Изобретение относится к микробиологии, генетике и эпизоотологии чумы, применяемой для микробиологических, генетических экспериментов и эпизоотологического' наблюдения в качестве маркированного штамма. Целью изобретения является получение штамма для проведения генетических и эпизоотологических исследований. Выделен штамм при эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы. Штамм является природным аргининзависимым штаммом чумного микроба. Использование данного штамма как тест-объекта дает возможность более детального изучения генома возбудителя чумы, генетики вирулентности, механизма циркуляции в природе. Штамм депонирован в коллекции Всесоюзного музея живых культур НИИ "Микроб" под номером •• КМ- 843. 1 табл..'3С/1

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (s))s С 12 N 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

k (21) 4725090/13 (22) 31.07,89 (46) 15.02,92. Бюл. М 6 (71) Среднеазиатский научно-исследовательский противочумный институт (72) Б.М.Сулейменов. Б.Б.Атчабаров, Ж.M.Èñèí, Н.А.Сатыбалдиев, P.P.Ðàõìàíêóлов и Н.С.Майканов (53) 578.81 (088,8)

{56) 1.Селекция и генетика возбудителей особо опасных инфекций, Саратов.: 1982, с. 77—

80. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ YERSINIA PESTIS, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ

ГЕНЕТИЧЕСКИХ И ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИХ НАБЛЮДЕНИЙ (57) Изобретение относится к микробиологии, генетике и эпизоотологии чумы, примеИзобретение относится к микробиологии, генетике и эпцзоотологии чумы, йрименимо для микробиологических, генетических экспериментов и эпизоотологического наблюдения в качестве маркированного штамма.

Известен аргйнинзависимый мутант чумного микроба, вирулентный для морских свинок и белых мышей, полученный поддействием химических агентов (1).

До настоящего времени неизвестны дикие штаммы чумного микроба с аналогичными свойствами. Предлагаемый штамм впервые изолирован в природе, не имеет. аналогов и может использоваться при изучении генетики вирулентности чумного микроба, механизма естественной изменчивости, закономерностей его возникновения и циркуляции в природе.

ÄÄ5UÄÄ 1712405 А1 няемой для микробиологических, генетических экспериментов и эпизоотологического наблюдения в качестве маркированного штамма, Целью изобретения является получение штамма для .проведения генетических и эпизоотологических исследований.

Выделен штамм при эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы.

Штамм является природным аргининзависимым штаммом чумного микроба. Использование данного штамма как тест-обьекта дает возможность более детального изучения генома возбудителя чумы, генетики вирулентности, механизма циркуляции в природе, Штамм депонирован в коллекции Всесоюзного музея живых кул ьтур Н И И "Микроб" под номером" КМ-.

843. 1 табл.

Целью изобретения является получение штамма для проведения генетических и эпизоотологических исследований.

Полученный аргининзависимый вирулентный штамм чумного микроба Y.pestis хранится в коллекции филиала Всесоюзного музея живых культур Всесоюзного научноисследовательского противочумного института "Микроб" под номером KM-843 и имеет следующие морфологические и физиологические характеристики:

Величина клеток двухсуточной бульонной культуры составляет 1 — 2 мкм Грамотрицательные, овоидной формы, биполярноокрашенны, Дает агглютинативный рост в прозрачном бульоне с мелкохлопчатым.осадком на дне пробирки. На агаре Хоттингера формирует пигментированные колонии с зерни3

1712405 стым центром и периферической зоной диаметром 2 — 2,5 мм. Температура оптимума роста 28ОС.

Ферментирует глюкозу, маннит, арабинозу, глицин, дульцит. Не ферментирует лактозу, сахарозу, рамнозу. Обладает фибринолитической и коагулазной активностью, пестициногенен и не чувствителен к пестицину 1. На среде Джексона-Берроуза формирует пигментированные колонии, на магниево-океалатной среде Хигучи-Смита вырастают кальцийзависимые клетки. Продуцирует фракцию 1, чувствителен к чумному фагу Покровской, фагу Л-413" С", псевдотуберкулезному диагностическому фагу, стрептомицину, тетрациклину, левомицитину.

Зависит от аргинина, независим от его предшественников цитрулина-и орнитина.

Вирулентный для морских свинок (0С1

3,5.10 м.к.) и белых мышей(0С1 — 10 м.к.}.

Пример 1, Способ получения штамма

Yerslnia pestis.

Аргининзависимый вирупентный штамм чумного микроба KM-843 получен путем посева суспензии 9 блох О.ilovaiskii.

Блох О,llovaiskii получают после очеса малого суслика, отловленного в точке

Акамбайли песчаного массива Бийрюк, обездвиживают парами эфира и растирают в стерильной фарфоровой ступке с

0,1 мл стерильного физиологического раствора. Полученную суспензию блох бактериологической петлей высевают на пластинку агара Хоттин гера (рН 7,2) с последующей инкубацией посева в течение 48 ч при 28 С.

На пластинке эгара Хоттингера через.

48 ч регистрируют рост колоний чумного микроба типичных по морфологии и чувствительности к чумному и псевдотуберкулезному бактериофагам.

Пример 2. Использование штамма для изучения вирулентности аргининзависимых вариантов чумного микроба.

Из двухсуточной. агаровой культуры чумного микроба Y,pestis КМ-843, И-765 (аргининзависимый штамм, выделенный в Горно-Алтайском природном очаге), А-1728 (аргининзависимый штамм,,выделенный в

Гиссарском природном очаге) готовят суспензии по стандарту. мутности (10 единиц) в забуферен ном физиологическом растворе (рН 7,2) с концентрацией микробных клеток

10 в 1 мл. Последовательным разведением пипеткой переносят 0,5 мл суспензии в пробирки с 4,5 мл физиологического раствора до концентрации 10 микробных клеток в

1 мл. Из разведений 10, 10, 10, 10, 10

2 3 4 5 6 микробных клеток в 1 мл каждого штамма вводят четырем морским свинкам по 1.0 мл подкожно в область верхней трети бедра.

Учет результатов проводят в течение 10 сут. Сравнение вирулентности проводят.

5 по количеству погибших морских свинок с бактериологическим подтверждением инфекционного процесса (см. табл; ).

Сравнительная вирулентность аргининзависимых штаммов чумного микроба из

10 разных природных очагов для морских сегпнок приведена в таблице.

Штамм Y.pestis KM-843 является вирулентным аргининзависимым, 0С1 для морских свинок — 3,5 10 микробных клеток. г

15 Полученные данные позволяют сделать заключение об отсутствии связи вирулентности чумного микроба с приобретением зависимости от аминокислоты эргинина;

Пример 3. Использование штамма, 20 Y,pestis КМ-843 для изучения генетики вирулентности чумного микроба, Двухсуточные агаровые культуры штаммов KM-843 (природный аргининзависимый вирулентный для морских свинок), И-765 и

25 А-1728 (природные аргининзависимые авирулентные для морских свинок), выращенные при 28 С, переносят аппликаторами в. пластиковые пробирки с 100 мкл лизирующей смеси (50 мл Tris-OH 3% SDS), смесь

30 доводят до рН 12,6 добавлением 2 N NaOH и доливают до 100,0 мл дистиллированной воды}. Лизат инкубируют 15-16 мин при

56 С с последующим экстрагированием равным объемом фенол-хлороформа (в соот35 ношении 1:1), центрифугируют 5 мин при .6000об/мин, отбирают20мкл водной фазы и смешивают с 5 мкл 0,25% бромкрезолового пурпурного в 50% глицерине (приготовленном на 0,05 M Tris — ацетате с рН 7,9) и

40 наслаивают в лунки для электрофореза. Горизонтальный электрофорез проводят в 0,7% агарозе при напряжении тока 12 — 14 в/cM в

2 течение 2 ч. Гель окрашивают в этидиумбромиде (0,5 мкг/мл) 30 мин при 23 С. Иденти45 фикацию плазмидных ДНК производят под

УЭ-лучами с использованием оранжевого фильтра.

В результате обнаружено, что все три штамма имеют типичный для чумного мик50 роба набор плазмид: pPst, pFra, pCad.

Полученные данные позволяют сделать вывод об отсутствии корреляции между вирулентностью чумного микроба и зависимостью от аргинина — наличие у всех штаммов

55 плазмиды pCad, ответственной за вирулентность.

Пример 3, Использование штамма

Y.pestis KM-843 для изучения динамики чумного зпизоотического процесса в природном очаге чумы.

5 1712405 6 !

Составитель Б; Атчабаров

Редактор M. Васильева .Техред M.Моргентал Корректор С. Шевкун.

Заказ 510 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

При многолетнем тщательном зпизоотологическом обследовании Зауральского степного очага чумы из грызунов и их блох регулярно изолировались типичные для очага по питательным потребностям (зависимые от аминокислот метионина, цистеинэ, треонинэ) штэммы возбудителя чумы.

В 1987 г. на Юго-Востоке Зауральского степного очага в массиве песков Бийрюк— точка Акамбайли — был выделен первый аргининзависимый вирулентный штамм чумного микроба (Y.резбз А-1861).

Последующее эпизоотологическое обследование и параллельное изучение питательных потребностей выделенных штаммов позволило установить первичную динамику распространения аргининзависимых вариантов чумного микроба.

5 Таким образом представленные данные позволяют использовать штамм KM-843, как генетическую метку для изучения динамики природного зпизоотического процесса в очаге чумы.

Формула изобретения

Штамм бактерий Yerslnla pestls KM-843, предназначенный для проведения генетическйх и зпизоотологических наблюдений.