Способ получения слизистых форм энтеропатогенных эшерихий и шигелл

 

Использование: медицина, ветери я нария, бактериологическая диагностика кишечных заболеваний. Сущность изобретения: культуру энтеропатогенных E.coli или шигелл в R-форме высевают на поверхность плотной селективной питательной среды, в которую предварительно внесена суспензия фага Тз в концентрации 107 - 109 БОЕ/мл. Посевы инкубируют в течение 1 сут при 37 С. Выросшие слизистые колонии пересевают для получения чистой культуры. Слизистые формы образуются у всех 56 изученных штаммов энтеробактерий. 2 табл. /

СООЗ СОВЕТСНИХ

РЕСГЭЬЛИК

ON (И) А1

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

° В»В

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ н *втсесиоми свидатвпьствм

1 (21) 4651516/13 (22) 16.. 02.89 (47) 0j.06.92. Бюл. V 21 (72) .А.М. Воскресенский (53) 576.8.093.1(088.8) (56) Федорова З.Ф, Влияние образования

:сферопластов и последующих реверсий на вирулентность и другие биологические признаки E.coli 0124:К72(В17).ЖМЭИ, 1977, }} 7, с. 7-11. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЛИЗИСТЫХ ФОРМ

ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ ЭШЕРИХИЙ И ШИГЕЛЛ (57} Использование: медицина, аетериИзобретение относится к способам выделения микроорганизмов и может быть использовано для получения слизистых форм энтеропатогенных эшерихий (ЭПЭ) и шигелл.

Известен способ получения слизистых Форм Escherichia coli 0124: К72, заключающийся в приготовлении таких питательных сред, как аминопептидный бульон (АПБ), аминопептидный агар

1, 5 - 2,03 (АПА), среда с пенициллином (АПБ + 20Ж сахарозы + 0,2}ь MgSO +

+1200 ЕД/мл пенициллина}, минимальная среда (НБа) РО 4 1 г, К НРО 1 г, Na

5 г, Н О " до 1 л, рН 7,2-7,4, АПА +

+ 13 пептона (AllA с пептоном}.. Первый этап способа заключается а получении пенициллиновых сферопластов. Для это-. го исходную К-форму E.coli 0124:К72 выращивают на АПБ и в логарифмической фазе роста вносят в среду с пенициллином на 3-4 ч .при 37 С. Сферопласты получены. (g1)5 С 12 N 1/20//(С 21 N 1/20 С 12 R 1:70) 2 нария, бактериологическая диагностика кишечных заболеваний. Сущность изобретения: культуру энтеропатогенных

E,coli или шигелл в R-форме высевают на поверхность плотной селективной IlH» тательной среды, в которую предварительно внесена суспензия фага Тз в концентрации 10 - 10 БОЕ/мл. Посевы т 9 инкубируют в течение 1 сут. при 37 С.

Выросшие слизистые колонии пересевают для получения чистой культуры. Слизис- тые. формы образуются у всех 56 изученных штаммов энтеробактерий. 2 табл.

Второй этап заключается в осущест- влении реаерсии, т.е. сферопласты следует вернуть в исходную R-форму (ревертанты). Для этого О,1 мл взвеси сферопластов вносят в минимальную Я среду с последующей инкубацией при

37 С в течение 1 сут, после чего куль. туру выдерживают при 28 С 2 3 сут.

При этом сферопласты превращаются в исходную R-форму, обозначенную как ревертант. Для их выделения в виде изолированных колоний культуру с минимальной среды . пересевают на АПА с пептоном. Инкубация flpH 37 С в течение 1 сут. Вырастают изолированные .колонии ревертантов - исходная R-форма получена. Затраты времени составляют 4-5 сут.

Третий этап заключается в получе- д,. нии слизистых форм. Для этого с ревертантами проводят процедуры, как на первом и втором этапах, повторяя получение сферопластов и снова ревертантов. В лучшем случае слизистые фор3

1738849

4 мы колоний получают на AllA c пепто- рацией 5 10® КОЕ/мл в объеме 0,1 мл ном после проведения 4-7 циклов Ре- засевают шпаделем на селективную среверсий; Таким образом, слизистые фор- ду АПА+Т „ Через 1 сут инкубации при мы появляются минимум на 16"20-е сут- 37 С вырастают слизистые колонии в ко" ки. Выделение в чистой культуре тре- личестве 40-60 на чашку. бует еще 1 сут. Суточную бульонную культуру E,coli

Известный способ характеризуется 0124:К72 в исходной R-форме с консложностью, трудоемкостью и большими центра цией 5 "108 KOE/ìë в. объеме временными затратами. 1O 0,1 мл засевают шпаделем на селективЦелью изобретения является упроще- ную среду KA+T>. Через 1 сут инкубание способа. ции при 37 С вырастают слизистые колоПоставленная цель достигается пу- нин в количестве 40-60 на чашку.. тем посева взвеси исходной R-формы Суточную бульонную культуру .Е.culi

ЭПЭ и шиггел на плотную питательную 1> 0124:Ê72 в исходной R-форме с концентсреду, содержащую бактериойаг Т с по- рацией 5xlos КОЕ/мл в объеме О,l мл следующим выращиванием в течение засевают шпаделем на селективную

1 сут при 37 C и выделением появляю.- среду ЭНДО +. Т, Через 1 сут инкуо щихся слизи .тых форм колоний в чистой бации при 37 C вырастают слизистые культуре ° 10 колонии в количестве 40-60 на чашку, П р и и е р. Получение слитистых Суточную бульонную культуру E.coli форм ЭПЭ и шиггел по предлагаемому 0143 в исходной. R-форме с концентраспособу. цией 5 10 КОЕ/мл в объеме 0,1 мл за Изучение литических свойств фага севают шпаделем на селективную среду

Т>, проводили методом "стекающей кап Zg АПА + Т . Через 1 сут инкубации при ли" на засеянных газоном культурах 37 С вырастают слизистые колонии в коЭПЭ и шигелл. личестве 20-30 на чашку.

Результаты приведены в табл. 1. Суточную бульонную культуру ShiКак видно из приведенных в табл. 1 gella sonnei в исходной R-форме с конрезультатов, фаг Т3 избирательно лизи- центрацией 5 ° 10 КОЕ/мл в объеме рует R-формы и не влияет на М-варианты 0,1 мл засевают шпаделем на:селектив- бактерий . Ilo-видимому, это связано с ную среду АПА+Тэ . Через I сут инкубатем, что фаг Т адсорбируется на бо ции при 37 С вырастают слизистые кололее коротких цепях липополисахарида нии в количестве 100-120 на чашку. (ЛПС) R-форм энтеробактерий и не мо- Суточную бульонную культуру Sh. жет крепиться на специфических поли- 3S flexneri la в исходной R-форме с .кон-. сахаридных цепях М-вариантов микРобов центрацией 5 ° 10 КОЕ/мл в объеме

Продуцируемая М-клетками слизь экрани- 0,1 мл засевают шпаделем на селективрует рецепторы фага l3 свободные у ную среду АПА+Тз. Через 1 сут инкубашероховатых бактерий. ции при 37 С вырастают слизистые колоЭти данные подтверждают возможность ® нии в количестве 5-10 на чашку. использования фага Т> для реализации Способ испытан на 40 штаммах E.соспособа получения слизистых форм как li 0124:К72, 2 штаммах Е.coli 0143, единственного селективного агента в 12 штаммах Sh.sonnei и 2 штаммах Sh. качестве компонента питательной среды. flexneri la.

Приготовление селективной пита- 45 Сводные результаты испытаний приветельной среды. дены в табл. 2.

В расплавленный и остуженный до . Как видно из приведенных в табл. 2

43РС АПА добавляют бактериофаг Т3 s результатов, выход слизистых форм. конечной концентрации примерно 1О -, составляет 1003 поскольку иэ всех изу1

0 БОЕ/мл, после чего разливают .по © ченных 56 штаммов, взятых в К-форме чашкам Петри. Среда АПА+Т3 получена. ЭПЭ и шигелл, удалось получить полоВместо АПА может быть использован ка- жительный эффект, зеиновый агар (KA) среда ЭНДО и дру- Можно добавить, что повышение конгие среды, не ингибирувщие литические центрации бактерий эа счет осаждения . свойства бактериофага. 55 путем центрифугирования исходной

Получение слизистых форм. бульонНой культуры или сбора их уроСуточную бульонную культуру Е.со1ъ . жая с агаризованной среды (исходная

0124:K72 s исходной К-форме с концент- R-культура может быть выращена на

Таблица 1

Литическая активность фага Тз

Форма колоний

Число штаммов

Вид -и серовар

40 12

«ЮЮЮЮЬФ\Ю ЮЮ

Таблица 2. м«к о «еюююю» е

Вид и Число серовар штаммов

Ю ЮЮ

i/

Е,соН 2.

0143 40

R,cali

Частота получения И-форм

Селективная среда 5 10 10

АПA + ТЗ

АПА + Т3

KA+ Т3 ал

ЭНДО+ Т3

0124

$Ь 8ОЙ

nei

Sh.flexnerila

-6

2 10

l2 АПА + ТЗ

2 AflA + ТЗ

-r . 1 ° 10

Составитель А. Воскресенский

Редактор B. Петраш Техред Я.Моргеитал - Корректор С. Шекмар

Ц ° Ф М ЮИФЫВЮВЬ ФВЮЮЮЮЮЮЮ ЮЮ ЮЮЮ ЮЮ

Заказ 1977 Тираж . - Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35 ° Раушская наб ., д. 4/5

Производственно»издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101

5 173 плотной среде), а также длительная инкубация исходной R-культуры в бульоне, например до 3 сут,ведет к накоплению слизистых -форм в популяции и, как,следствие, к повышению эффектив, ности отбора. Однако это практически не требуется, если речь идет о получении 3-5 колоний (субштаммов) слизистой формы, а не о выделении десятков

И-клонов из одной Е-культуры.

Проведенные исследования позволяют считать, что способ может быть использован для получения слизистых форм

ЭПЭ и шигелл..

Е.cali

0143

RicoIl

0)24

$Ь, зоп

nei

Sh Л1ехneri la

8849 6

Формула изобретения

Способ получения слизистых форм энтеропатогенных эшерихий и шигелл путем посева культуры в К-форме на питательную среду с последующим инкубированием посевов и выделением нистой культуры слизистых форм бактерий, 10 отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, посев культуры в R-форме осуществляют на питательную среду с бактериофагом Тв.

И, Нет лиэиса

Лизис

И Нет лиэиса

К . Лизис

M Нет лизиса

R Лизис

M Нет лизиса

R Лизис.