Способ получения полипептида со свойствами гирудина

 

Использование: генетическая инженерия и получение полипептида со свойствами гирудина. Сущность изобретения: способ предусматривает конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pTG 1828 - или pTG 1891, или pTG 1833, кодирующей HV1 или HV2, трансформацию полученными ДНК штаммов Saccharomuces cerevisiae, культивирование трансформированных дрожжей, выделение и очистку целевого продукта. Причем эти плазмиды имеют следующие последовательности Str-Lex-Scl- ген Н, где Н - ген, кодирующий гирудин HV1 или HV2, Sir- представляет собой промотор PGR-дрожжей; Lex-последовательность, обеспечивающая секрецию полового феромона дрожжей; Scl - последовательность, кодирующая участок расщепления протеина , один кодон ATG или два кодона, кодирующих Ser-Leu-Asp-Lus-Arg; Lex - последовательность представляет собой пре-про последовательность, которая выделяет половой альфа феромон дрожжей. 2 табл. ел С

CO)C3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (sl)s С 12 N 15/15

ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ., 1

К ПАТЕНТУ (21) 4202962/13 (22) 09.07.87

i (ЗЗ) FR (31) 8610090; 8616722 (321 10.07.86; 01.12,86 (46) 15.11.92. Бюл. lU 42 (71) Трансжен С.А. {FR) (72).Жерар Луазон, Ив Лемуан, Натали Лаба и Алэн Баллан (ЕВ) (56) РСТ (FR 86) 00183, кл. С 12 N 15/00, 2,05.86. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА

СО СВОЙСТВАМИ ГИРУДИНА (57) Использование: генетическая инженерия и получение полипептида со свойствами гирудина. Сущность изобретения: способ предусматривает конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pTG 1828 — или

Изобретение относится к генетической инженерии и в частности к способу получения полипептида со свойствами гирудина, Известен способ получения полипептида со свойствами гирудина, предусматривающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей HV1 или

HV2, трансформацию полученными ДНК штаммов Saccharomyces cerevisiae, культивирование трансформированных дрожжей, выделение и очистку предшественника гирудина с последующей активацией (11.

Недостаток известной конструкции плазмидной ДН К состоит в том, что гирудин экспрессируется в форме предшественника, который имеет два сайта расщепления.

Когда расщепление происходит по первому сайту, получают более длинную форму, чем активный гирудин, который отличается от, Ж„„1776276 АЗ

pTG 1891, или pTG 1833, кодирующей HV1 или HV2, трансформацию полученными

ДНК штаммов Saccharomuces cerevisiae, культивирование трансформированных дрожжей, выделение и очистку целевого продукта. Причем эти плазмиды имеют следующие последовательности Sir — Lex — Scl— ген Н, где Н вЂ” ген, кодирующий гирудин НН1 или HV2, Sir — представляет собой промотор

PGR-дрожжей; Lex-последовательность, обеспечивающая секрецию полового ферОмона дрожжей; Scl — последовательность. кодирующая участок расщепления протеина, один кодон ATG или два кодона, кодиру. ющих Ser — Leu — Asp — Lus — Arg; Lex последовательность представляет собой

"пре-про" последовательность, которая выделяет половой альфа феромон дрожжей.

2 табл. гирудина активного удлиненным остатком аминокислоты с NHz-концом.

Предшественник загрязняет зрелый гирудин на различных стадиях его очистки и это усложняет способ очистки и приводит к снижению выхода чистого препарата гирудина.

Предложенные плазмиды имеют только один сайт расщепления, расположенный перед N-терминальным концом гирудина.

Расщепление в этом месте и позволяет получить сразу зрелый гирудин и избежать в дальнейшем энзиматического расщепления, или этапов обработки бромидом цианогена и ренатурации протеина.

Целью изобретения является упрощение способа. Способ предусматривает конструирование рекомбинантной плазмиднай

ДНК pTG61828 или pTG1891, или pTG1833, 1776276 кодирующей HV1 или HV2, трансформацию полученными ДНК штаммов Saccharomyces

cerevislae, культивирование трансформированныхх дрожжей, выделение и очистку целе- вого продукта. Причем эти плазмиды имеют 5 следующую последовательность:

Str — Lex-Scl-ген Н где Н вЂ” ген, кодирующий гирудин HV1 или

НН2;

Str — представляет собой промотор re- .10 . на PGKдрожжей;

Lex — последовательность, обеспечивающая секрецию полового феромона дрожжей; . Scl — последовательность, кодирующая 15 участок расщепления протеина; т.е. один кодон ATG или два кодона, кодирующих Lys-Alg или пять кодонов, кодирующих Ser — Leu Asp Lys — Arg ! ех последовательность представляет со- 20 бой "пре-про" последовательность, которая выделяет половой альфа феромон дрожжей.

Хотя в данной конструкции последовательность L происходит от гена полового 25 альфа феромона дрожжей, в принципе могут быть использованы другие системы (например, система белка Киллера).

Последовательность Str означает промотор гена PGK дрожжей, который отлича- 30 ется от промотора гена M Ральфа 1, В предложенном способе используют промотор гена PGK, что позволяет добиться экспрессии гирудина независимо от полового сигнала штамма-хозяина. 35

Ппазмидные ДНК могут содержать, кроме того, начало репликации в дрожжах, например, начало репликации плазмиды 2

Данные плазмиды обеспечивают репликацию в Е.coll, например, начало реплика- 40 ции, такой как репликации pBR322, и маркер селекции, например, армй. Эти плазмиды будут также нести маркер селекции дрожжей, например, ген, кодирующий устойчивость к некоторым токсичным хими- 45 ческим соединениям, или ген; ИЯАЗ.

Для управления экспрессией и секрецией гирудина в культуральную среду, соответствующий ген вводят в вектор дрожжей или в плазмиду, содержащую начало реппи- 50 кации в дрожжах. Плазмиды содержат следующие элементы: — начало репликации плазмиды дрожжей 2р, — ген ura3 55 — начало репликации в .Е.соИ и маркер устойчивости к антибиотику,, — область 5 гена М Ральфа 1. которая содержит промотор транскрипции, "лидер.ную" последовательность и последовательность пре-про предшественника фактора альфа, эта последовательность слита с последовательностью, кодирующей гирудин

HV1, — терминатор транскрипции гена PGK дрожжей, размещенный ниже гена гирудина. Данные конструкции вводят в дрожжи, в частности в Saccharomyces или в плазмиду для автономной репликации. или в хромосоме дрожжей.

Когда плазмида является автономной, она содержит элементы, обеспечивающие ее репликацию, т.е, начало репликацию такое. как у плазмиды 2,и. Кроме того, плазмида может содержать элементы селекции, такие как ген ИВАЗ или ЕЕИ2, которые обеспечивают комплементарность дрожжей

Ura3 ипи leu2. Эти плазмиды могут также содержать элементы, обеспечивающие их репликацию в бактериях, например, начало репликации, такое как у рВ й322. маркерный ген, такой как Амр".

Когда промотор является таким, как у гена феромона альфа, дрожжи будут предпочтительно полового типа Matalpha. Можно использовать, например, штамм гентипа

ura3 или leu2, или другой, комплементарный плазмиде, для обеспечения удержания плэзмиды в дрожжах при соответствующем давлении селекции.

Получают гирудин культивированием трансформированных дрожжей в культуральной среде и выделяют его из культуральной среды в форме созревающего предшественника гирудина In vitro или in

vivo.

Созревание может быть и роведено в несколько этапов. Сначала расщепляют некоторые элементы, происходящие от трансформации последовательности Lex, это расщепление проводится на уровне последовательности, соответствующей Scl, Зрелому гирудину предшествует селективное отщепление метионина бромидом цианогена. Последовательность, кодирующая гирудин, не содержит метионина.

Предусмотрено отщепление на N конце депиптида Lys Arg. В некоторых случаях необходимо предусмотреть ферментативное расщепление после секреции при добавлении специфического фермента.

В некоторых случаях после обработки бромидов цианогена необходимо денатурировать белок, воссоздавая дисульфитные мостики. Для этого белок денатурируют, например гуанидинхлоридом, потом денатурируют в присутствии восстановленного и окисленного глютат-иона.

В частности гирудин HV1 используют в фармацевтических композициях, один или в

1776276

20

30

55 сочетании с другими активными продуктами, или же в рамках тестов или диагностики

In vitro или in vlvo.

Пример 1. Плазмида pTG897 несет информацию для предшественника гирудина, который содержит только один сайт расщепления для протеиназы yscF. В результате обработки протеиназой узсГ высвобождается молекула гирудина, удлиненная у NH2 на 4 остатка Gl u Ala Clu u Ala.

Делеция фрагмента ДНК, кодирующего эту последовательность Glu u Ala Glu Ala, приводит к получению зрелого гирудина, Эту делецию осуществляют с помощью сайт специфического мутагенеза invltro.

Плазмиду pTG897 гидролизуют Pst1Bg8I рестриктазой. Фрагмент ДН К, содер>кащий последовательность гирудина, клонируют в репликативной форме однониточного фага M I3 Т G131, чтобы создать фаг

М13Т6 897.

Гибридизируют олигонуклеотид последовательностии:

5 -ТСТТТ66АТААААОААТТАСОТАТАСАОАС-3 с геномной ДНК этого фага М13ТО 897. Этот олигонуклеотид гибридизируется в своем первом фрагменте (15 пар оснований) с последовательностью из 15 пар оснований непосредственно выше делецируемой последовательности, а вторым своим фрагментом с последовательностью из 15 пар оснований непосредственно ниже. Этот олигонуклеотид служит матрицей для синтеза in vitro комплементарной нити генома фага М13Т6897. После действия Т4 ДН К лигазы полученными гибридными ДНК трансфецируют бактерию — реципиент М103 / Л /

/Lac-Pro/SupE Thi End1A Sbcb15 strA rkmk+1F Тг Р36 ProAB + Еас1 LacZ Л М15/ и анализируют фаги, полученные при этой трансфекции путем гибридизации ДНКДНК, испол ьзуя в качестве зонда нуклеотид, описанный ранее и меченый 32р путем

kin at! on.

Пример 2. Получают плазмиду

pTGB76 после удаления Bg6l сайта в плазмиде рТ6883, который находится вблизи терминатора транскрипции гена РОК.

Для этого частично гидролизуют эту плазмиду pTG876 с помощью Bgl1, обрабатывают фрагментом Кленова ДНК полимеразы 1 E.coli в присутствии 4 нуклеотидов и ковалентно соединяют молекулы ДНК друг с другом при действии ДНК лигазы фага

Т4. Плазмида рТ6883 имеет только один сайт Bgell, расположенный выше промотора гена феромона.

Плазмиду pTG883 (20 мг) обрабатывают

Вф1, потом подвергают гидролизу нуклеазой Ва131 (1,4 единицы, 10 минут). Обработанную таким образом ДНК очищают последовательными экстракциями фенолом и хлороформом — изоамиловым спиртом, за-тем фракцию (5 мг) подвергают действию полимеразы Кленова, чтобы получить максимальное количество свободных концов.

Обработанную таким образом ДНК лигируют с нефосфорилированными линкерами

ВавН1 /5,CGGATCCCG/ в присутствии лигазы фага Т4. После трансформации E.соП

1106 и селекции на устойчивость к ампициллину выделяют плазмиду pTG892, делецированную в области 5, располагающейся сбоку гена MFalpha1, линкер BamH1 локализован на основании выше ATG.

5 -СОООАТСССО А ATG АОА ТТТ линкер BamH1 Часть, кодирующая

MFalpha 1 — 2

Новый фрагмент BamH1 — $а11 клонируют между сайтами BamH1 — Sai1 фага М1ЗТ

6120, чтобы получить фаг M13TG889. Из фага М13Т6889 изолируют фрагмент BamH1—

Щ1, содержащий фрагмент, кодирующий феромон альфа, чтобы лигировать его с большим фрагментом Bgil плазмиды В

pTGB92 в содержит фрагмент ВатН1 — Bglli, соответствующий части, кодирующей феромон, вставленный позади сайта Bgll промотора гена PGK.

ДНК рТ6892 содержит один сайт Bglll, один сайт Sal1 два сайта епс adrent короткой последовательности, содержащей сайт

Pstl. При двойном гидролизе Bgl1 и Sal1, элюции, большого фрагмента и лигации с синтетическим полилинкером замещают короткую последователы ость;

5 GATC CAG CTGACATCTG CATG CG

GTCGACT6TAGACGTACG САОСТ-5 и обладают липким концом Bglll, липким концом Sall, а также сайтами рестрикции

Pst1, Bglll и Sph1.

Полученный таким образом новый вектор обозначают pTG1819. ДНК этого вектора гидролизуют Sph1 и Pst1. При двойном гидролизе получают три фрагмента: один

Рвт1 — Pst1 6,5 кв, один Pst1 — Sph 1,9 кв и другой Sp1 — Pst1 0,5 кв

Два более длинных фрагмента очищают и смешивают с фрагментом Spg1 — Pst1, соответствующим зрелому гирудину и происходящим из фага M13TG1827, и получают вектор экспрессии: pTG1828.

П р и и е р 3. Частично обрабатывают

ДНК pTG881 с помощью Pst1 и получают фрагмент 6,1 кв. Этот фрагмент изолируют, потом Гидролизуют Bglll, высвобождают 2

1776276

-10

35

50 фрагмента Рзс1 — Pst1 и Pst1 — В9И!. Эти два фрагмента лигируют с фрагментом Pst1—

В9((!. 0,62 кв, из pTG1828. Таким образом получают новый вектор pTG1833, который отличается от плазмиды рТ6897 делецией последовательностей, кодирующей Glu—

Ala - Glu - Ala. Эта плазмида рТ61833 имеет начало реппикации для Е.соИ, ген устойчивости к ампициллину, ген Leu2 $.cerevlsiae, фрагмент плаэмиды 2 м, который обеспечивает репликацию в S,cerevlslae промотар гена MFa(pga1, кодирующий пре-про, и re» гирудина.

Пример 4. Трансформируют штамм

S.cåråvÈsIàå TGY1 sp 4/Matalpha ura 3 251373-328 Ыз-11-15/ плаэмидами pTG1818, рТ6 1828 и p TG t 833. Резуп ьтаты показывают, что pTG1818 и pTG1833 вызывают секрецию гирудиновой активности на одинаковом уровне. Напротив, TGY1 зр4

pTG1828 секретирует в два раза меньшую активность гирудина, чем два других штамма. Также сравнивают синтез гирудина, секретируемога штаммами $.cerevisiae /Mata/

TGY14-1, трансформированным или

pTG1828 или PTG1833 и TGY14-2, трансформированными теми же плазмидами (табл.

1-2). В случае штамма TGY14-2 (попавой тип Matalpha) плазмида рТ61833 обеспечивает лучшую секрецию гирудина, чем плаэмида pTG1828. Напротив, в случае штамма

TGY14-1 (половой тип Маса эЕП1833 не вызывает секрецию гирудина, как ожидалось, тогда как NG14-2 продуцирует гирудин.

Пример 5. Из штамма TGY1 sp4

pTG833 выделяют спонтанные мутанты, . способные образовывать колонии на полной среде (YPG), дополненной 1 мг/мл 5фторурацила. 6 мутантов культивиру«ат на полной среде и выбира«от один, который не обладает ни одной выжившей колонией для плазмиды после более 20 генераций роста в неселективных условиях.

Мутант, названный TGY (sp4-3, используют для продуцирования гирудина в полной среде.

Пример 6. Эта последовательность несет элементы слияния последовательности HV1 с частью пре-про МЕа(р(2а1 и сигналами, обеспечивающими правильное вызревание секретированнага гирудина, в частности, область соединения должна садержатьдублет Pys Arg сразу выше первого оетатка й(-(г-концевай GV1.

Синтез осуществляют иэ двух отдельных блоков, которые затем объединяют.

Первый блок содержит 9 алиганукпеотидов, пронумерованных от 1 до 9, а второй блок содержит 10 нуклеотидов, пронумерован.ных от 10 до 19..Пример 7. Олигануклеотиды 2 8 (фосфорилируют па их 5,-концам, чтобы избежать образование димеров или полимеров: 500 пикомапей каждого олигонуклеотида обрабатывают полинуклеотидкиназой (2 единицы) в конечном объеме 25 мкл Трис НС! 60 мМ, рН 7,5, Mg CIz 10 мМ, дитиотрейтал 8 мМ, содержащем 3,3 пмолей гамма-АТФ 32р (500 кюри (нмоль), после 15 минут инкубации при 37 С прибавляют 5 нмолей немеченай АТФ. После инкубации при 37 С в течение 30 минут комплементарные фрагменты гибридизируют два Ila два, эа исключением фрагментов

1, 2 и 3, эти последние смеши«2а«ат вместе.

Используют 300 пмопей каждого алигонуклеатида в конечном объеме 10 мкл Трис HCI

66 мМ, рН 7,5, MgClz 6 мМ, NaCl 100 мЫ, спермидин 0,5 мМ, ДТТ 8 мМ.

Каждую смесь нагревают при 100 С в течение 3 мин, затем охлаждают медленно до 37 С в течение 2 ч. (ибридизирова««нь«е алиганукпеатиды 1-2-3 cMQLLIHE«aloT с опигонуклеатидами 4-5 и инкубируют при 37 С в течение 2 ч: Таким же образом проводят гибридиэаци«а пар нуклеатидов 6-7 и 8-9. На последнем этапе объединяют 9 ««уклеоти. дав, предварительно обработанных таким образам, их инкубируют 2 часа при 37 С в конечном объеме 100 мкл

14 пмопей этих гибридиэованных олигонуклеотидов подвергают обработке лигазой

Т4 в течение 15 часов при 15 С. Затем к реакционной смеси прибавляют 50 нг большого фрагмента iind Ill-Ham Н1 M13TG I31, предварительно очищеннага на геле. ЛигиpQBa«I«I>÷o cMecb используют для т(2днсфар мации клеток E.coÈ М(03. Среди 12 кланов полученных таким образом фагав один обпадает искомой последовательностью:

М13Т61888.

Испапьзу«ат ту же самую стратегию для синтеза второго блока, который клониру«от между сайтами DamH1 и $а(1 фага

M13TG i31. Два клона на 12 тестов име«ат вставку, соатветствующу«о искомой последовательности. Один из этих клонов назван

Ы13Т61889.

Две двуниточные ДНК M13TG1888 и

М13Т61889 гидропизуют рестригаэами

HIndIll и HamH1 и Sai1, смешивают с большим фрагментам (Hindi(i — Sal1, очищенным на геле. Пигираванную смесь подвергают трансформации E.coil 1106. После селекции на устойчивость к ампициллину получают плаэмиду рТ61890, которая содержит прав«лль««а реконструираванную синтетическу«о последовательность.

Пример 8. Iindlli — ВсИ(! фрагмент

ДНК рТ61890 несет последовательность, 1776276

Таблица 1

Антитромбиновая активность гирудина, секретируемого штаммами дрожжей

Таблица

Антитромбиновая активность гирудина,-секретируемого штаммами дрожжей кодирующую HV1 (сайт Bglll расположен сразу выше сайта Sal1, который служит при предшествующем клонировании (для вставки между сайтами Hlndlll u Bglll плазмиды pTG881. В полученной плазмиде

pTG1891 ген РИ, последовательно, оказывается вставленным между последовательностями пре-про NFalpha1 и терминатором транскрипции. Такая конструкция 1 обеспечивает созревание и секрецию гирудина

lV1, потому что она является идентичной

pTG1818, за исключением последовательностей, кодирующих HV2, которые заменены последовательностями HV1.

Пример.9. Штамм TGY1 sp4 (alpha-1

ura 3-251-373-373-328, HiS 3-11-15) трансформируют плазмидой pTG1891, 2 клона полученных селекцией на ura+, культивируют и определяют и родуцирование гирудина, секретированного в культуральную среду. В качестве контроля определяют в тех же условиях количество гирудина, секретированного NGY1 sp4 pTG1818.

Определяют в два раза большую антитромбиновую активность при поверхностном культивировании штамма TGY1 sp4 . pTG18191 (0,9 мг/л поверхностной культуры), чем в культуре штамма TGY1 sp рТ61833.

Депонирование ш таммов-представителей изобретения.

Следующие штаммы депонируют в Национальной коллекции Культур Микроорганизмов Института Пастера 16 июня

1986 года.

Saccharornyces cerevisiae TG1Y sp4

pTG1828 под N . 1-569

Saccharomyces cerevlslae TGY1 sp.

ЗрТ61833 под М 1-570 6 ноября 1986 года.

5 Saccharomyces cerevlslae HTGY1 sp4 р

TG1891 под N. 1-623.

Формула изобретения

Способ получения полипептида со свойствами гирудина, предусматривающий

10 конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей HV1 или HV2, трансформацию полученными ДНК штам- . мов Saccharomyces cerevlslae, культивирование трансформированных дрожжей, 15 выделение и очистку целевого продукта, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа, конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК pTG1828, или

pTG1833, или pTG1391, содержащие после20 довательнасти

Str — 1.ех — Scl — ген Н, где Н вЂ” ген, кодирующий гирудин HV1 или HV2;

Str — представляет собой промотор гена

25 PGR-дрожжей;

Lex — последовательность, обеспечивающая секрецию полового феромона дрожжей;

Scl — последовательность, кодирующая

ЗС участок расщепления протеина, т.е. ATG или два кодона, кодирующих Lys-Arg, или пять кодонов для Scr - Leu — Asp - Lys — Arg.

Приоритет по признакам;

10.07.86 соответствует плазмидам

35 pTG1828 и pTG1833, т.е, гирудину HV2;

01.12.86 — плазмиде pTG1891, т,е. HV1.