Способ экспрессии цепей химерного антитела

 

Использование: в иммунологии и медицине для диагностики прогнозирования и лечения болезненных состояний, включая аденокарциному. Сущность изобретения: сконструированы эукэриотические векторы экспрессии, которые могут быть использованы для создания модифицированных и химерных производных KSI/4.

SU „, 1780541 АЗ

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (53)5 С 12 N 15/13

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ;:,-: ::, ;,,„

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ л

I»

«Г

СО

С) (л )>

,Сд (21) 4743669/13, 4613958/13 от 20,04.89 (22) 25.04.90 (31) 184522 (32) 21.04.88 (33) US (46) 07.12.92, Бюл. ¹ 45 (71) Эли Лилли Энд Компани (US) (72) Лайза Селсам Бриверз, Томас Фрэнк

Бьюмол, Роберт Алан Гадски и Барбара

Джин Вигел (US} (56) Патент ЕПВ N 0120694, кл, С12 N15/00,1984.

Патент ЕПВ № 0125023, кл. С 12 N

15/00, 1984.

Патент ЕПВ ¹ 0088994, кл, С 12 N

15!00, 1984.

Изобретение относится к иммунологии и генной инженерии, в частности к исследованию моноклональных антител, и направлено на продуцирование химерных моноклональных антител, которые могут быть использованы для лечения рака и других заболеваний.

Изобретение относится к способу экспрессии тяжелых цепей химерного антитела

К 1/4 в эмбриональных клетках человеческой почки, В публикации Европатента №

0125023 от 14 ноября 1984 r, раскрываются рекомбинантные и химерные моноклональные антитела, Однако эти молекулы реагируют с карциноэмбриональным антигеном, а не с антигеном аденокарциномы настоящего изобретения, Кроме того, СаЫИу и др. не раскрывают способ настоящего изобретения, в котором цепи антител продуцируются в нелимфоидных клетках почки.

SherIe l. Morrison в ignm, 223: 1202—

1207 (1985) раскрывает получение химерных антител в клетках трансфектомы. Химерные (54) СПОСОБ ЭКСПРЕССИИ ХИМЕРНОГО;

АНТИТЕЛА (57) Использование. в иммунологии и медицине для диагностики прогнозирования и лечения болезненных состояний, включая аденокарциному, Сущность изобретения: сконструированы эукариотические векторы экспрессии, которые могут быть использованы для создания модифицированных и химерных производных К$!/4. антитела, полученные Morrison реагируют с тринитрофенилом и были продуцированы в лимфоидных клетках, В работе Sun и др., и ) *» *.6 раскрывают химерные антитела; которые реагируют в аденокарцйномой. Из сравнения ами нокислотной последовательности тяжелой цепи антитела, раскрытого Sun, и аминокислотной последовательности тяжелой цепи KS1/4 ясно видно, что эти последовательности являются на 48;ь негомологичными, Более того, в работе Sun и др. не раскрывается Использование нелимфоидных клеток, которые используются в настоящем изобретении.

Настоящее изобретение относится к получению новых соединений ДНК и векторов клонирования рекомбинатной ДНК, который кодирует мышиное (человеческое) химерное антитело с тяжелой цепью, проис-, ходящее от КЯ1/4. Эти векторы позволяют экспрессировать новые ДНК-соединения в нелимфоидн ых эукэриотических клетках.

1780541

Изобретение также позволяет получить клетки хозяина, трансформированные этими новыми клонирующими векторами. Эти трансформированные клетки хозяина экспрессируют рекомбинантные или химерные

KS1/4-антитела. Многие из существующих

ДНК-соединений могут быть использованы для получения KS1/4-производных, которые до сих пор не были синтезированы ни в природе, ни в лаборатории, и которые также входят в объем настоящего изобретения.

Моноклональное антитело KS1/4 является мышиным антителом, которое специфически связывается с антигеном поверхностных плотности на клетках аденокарциномы, а также на нормальных эпителиальных клетках, Это антитело оказалось эффективным для диагностики заболеваний vl î, а также для

j jyg диагностики и лечения аденокарциномы. Последние исследования подтвердили, что KS1/4-лекарственные коньюгаты показывают дозозависимую суппрессию роста опухоли.

Возникает одна проблема с использованием мышиных антител в человеческом организме, если иммунная система пациента с заболеванием раком вырабатывает антитела .против мышиных иммуноглобулинов, Такой иммунный ответ происходит не у всех пациентов, но если он происходит; то он приводит к постепенному ухудшению эффективности лечения в течение курса многократного приема лекарственного средства. Этот иммунный ответ пациента может также приводить к более сильным реакциям, таким, как анафилаксия или сывороточная болезнь. Такая иммуногенность не позволяет вводить Мхогократные дозы антитела и поэтому снижает клиническую ценность лечения.

Человеческие моноклональные антитела получить очень трудно, поэтому во избежание иммунологических проблем конструируют химерные антитела. Химерные антитела содержат специфические или вариабельные части антитела, происходящего от видов, связанных с постоянным участком от различных видов, См. Ol u Morrison; Bio

bechnlques 4:214 — 221 (1986). Поскольку иммунный ответ бывает часто направлен против постоянного участка, замена мышиного постоянного участка человеческим постоянным участком способствует значительному ослаб лению иммунологической реакции пацйента.

В соответствии с этим химерные антитела являются желательными для лечения заболевания.

Основная теория химерных антител описана в литературе, однако еще остается антител, обладающих определенной специфичностью, Настоящее изобретение относится к рекомбинантной ДНК и аминокислотным последовательностям, ко5 торые содержат полную молекулу К$1/4 монокланального антитела. Эти последовательности воздействуют на экспрессию химерных антител, которые обладают той же тканевой специфичностью, что

10 и KS1/4, но которые содержат при этом постоянные участки, происходящие от человеческих источников. Поэтому настоящее изобретение позволяет применять терапевтический режим с той же тканевой специклеток 40000 Д, обнаруженным в высокой 15 фичностью моноклонального антитела

KS1/4, но со значительным уменьшением иммунологических побочных эффектов.

Кроме того, изобретение включает рекомбинатную ДНК и аминокислотные после20 довательности К$1/4. Знание этих последовательностей позволяет специалистам разработать новые KS1/4-производные с модифицированными родством для KS1/4антигена, Настоящее изобретение, кроме то25 го, содержит способы получения химерного и рекомбинантного KS1/4 в линиях нелимфоидных клеток, чтобы тем самым разрешить проблему, часто возникающую в результате двойной секреции гетерогенных антител в

30 лимфоидных клетках.

В целях раскрытия настоящего изобретения ниже приведенные понятия определяются следующим образом;

А — деоксиаденозин;

35 Ala — остаток аланина;

Ар — ампициллин-резистентный фенотип или ген, несущий устойчивость в ампициллину;

Arg — остаток аргинина;

40 Ash — остаток аспарагина;

ASp — остаток аспарагиновой кислоты;

С вЂ” деоксицитозин;

Химерное антитело — антитело, содержащее вариабельный участок от одного ви45 да обычно мыши, который связан с постоянным участком от другого и отличного от него вида, обычно человека:

CyS — остаток цистеина;

dhfr — фенотип дигидрофолат-редукта50 зы или ген, несущий этот фенотип;

Enh — последовательность энхансера, полученная от ВК-вируса;

G — деоксигуанозин;

Gln — остаток глутамина;

55 G lu — остаток глутаминовой кислоты;

Gly — остаток глицина:

G418-R устойчивый фенотип или ген, несущий этот фенотип, может быть также идентифицирован как Km ; необходимость в разработке новых химерных His — остаток гистидина;

1780541

Hm — гидромицинустойчивый фенотип

R или ген, несущий этот фенотип;

Ile — остаток изолейцина;

Ivs — ДНК, кодирующая интрон, так называемая вставочная последоватеу1ьяость;

KSA — антиген поверхностного гликопротеина клеток 40000 USLA РЗ, которые являютсяя распознаваемыми моноклональным антителом KS1/4;

К$1/4 — мышиное моноклональное антитело, происходящее от линии клеток гибридомы; это антитело, распознающее гликопротеиновый антиген 40000 Д, обнаружено на поверхности клеток РЗ-VCLA;

Leu — остаток лейцина;

LP — ДН К-фрагмент, содержащий активность промотора аденовируса позднего промотора;

Lys — остаток лизина;

Met — остаток метионина;

МоА — моноклональное антитело;

Нативн ый белок — полипептид, продуцируемый при трансляции и РНК-транскрипта, и любых посттрансляционных модификаций;

PA — ДН К-последовательность, кодирующая сигнал полиаденилации;

Phe — остаток фенилаланин;

Р1 — ДН К-фрагмент, содержащий актив.ный промотор левого промотора бактериофага;

Pro — остаток пролина;

Промотор — ДН К-последовательность, которая направляет транскрипцию ДНК в

РНК.

Вектор клонирования рекомбинантной

ДНК вЂ” любой автономно реплицирующий агент, включающий плазмиды и фаги, но не ограничивающийся ими, содержащий ДНКмолекулу, к которой могут быть добавлены один или несколько дополнительных фрагментов ДНК, Вектор экспрессии рекомбинантной

ДНК вЂ” любой вектор клонирования рекомбинэнтной ДНК, в который вводят промотор.

Рекомбинантное KS1/4 -- молекулы мо. ноклонального антитела KS1/4, экспресси руемые в клетках, трансформированных вектором, вызывающим экспрессию KS1/4.

Репликон — ДНК-последовательность, которая регулирует и обеспечивает автономную репликацию плазмиды или друГого вектора.

Фрагмент рестрикции — любая линейная последовательность генерировэййая одной или несколькими рекстриктрирующими эндонуклеазами, Восприимчивая клетка хозяина — кото- рая не может расти в присутствии данного антибиотика или другого токсичного соединения без устойчивого к нему ДНК-фрагмента.

Ser — остаток серина.

Структурный ген — любая ДНК вЂ” после5 довательность, кодирующая функциональный полипептид, начало включения трансляции и стопсигналы.

Т вЂ” деокситимидин.

Tc — тетрациклинустойчивый фенотип

10 или ген, несущий этот фенотип, Thr — остаток треонина.

Trp — остаток триптофана.

Туг — остаток тирозина;

Val — остаток валина.

15 На фиг,1 показана схема конструкции плазмиды PL32 (для наглядности фиг. точно не соответ ст-вую т масш табу); на фиг.2 — сайт рестрикции и функциональная кэрта плаэмиды pNM789; на фиг,3 — схема конструкции

20 плазмиды 120; на фиг,4-схема конструкции плазмиды PL110; на фиг.5 — сайт рестрикции и функциональные карты ВК вЂ” вируса и плазмиды рВК neol; на фиг,6 — сайт рестрикции и функциональные карты-плазмид

25 pLPCat и pPLcat; на фиг.7 — схема конструкции плазмиды pL133; на фиг.8 — сайт рестрикции и функциональные карты плазмид

pLPC, pSV 2hyg и р PChygl; на фиг.9 — схема конструкции плазмйды pBW25; на фиг.10—

30 схема конструкции плазмиды pBW32; на фиг.11 — сэйт рестрикции и функциональные карты плазмид pLPChd и phd; на фиг.12— сайт рестрикции и функциональные карты плазмид СНКС2-6 и СНКС2-18; на фиг.13—

35 сайт рестрикции и функциональные карты плазмид СН2А5 и CH2A51G2; на фиг.14— сайт рестрикции и функциональные карты плазмид CH2A51G3 и СН2А5104.

Предметом настоящего изобретения яв40 ляется способ экспрессии, заключающийся в том, что конструируют рекомбинантную

ДНК-плазмиду pHI-Н!, которая кодирует вариабельную область тяжелой цепи антитела

KS1/4 с аминокислотной последовательно45 стью, состоящей в основном из

Gln 11е Gln Låu Чаl Gln Ser Gly Рга Glu Leu Lys

Lys Pro CTy Glu ТЬг Чаl Lys 1Iе Ser Cys Lys Ala Ssr Cly Туг

Thr Phe Thr Asn Tyr Gly ttet Asn Тгр Чаl Lys Gln ТЬг Pro Gly

50 Lys Gly Leu Lys Tsp tIet Gly Trp I le Asn Thr Tyr Thr Cly Glu

Pro Thr Туг Ala Asp Asp Phe Lys Сlу Агу Phe Ala Phe Бег Leu

Glu Thr Ser Ala Seг Thr AIa Phe Leu G1n Ile Cln Cln Pro Gln

Аьо Net АгБ Thr Нег Аlа Thr Туг Phe Суа Чаl Arg РЬе Ile Бег

Lys Gly Asp Tyr Тгр Gly Gln Gly Thr Бег Чаl ТЬг Ча1 Ser Бег

55 трансформируют штамм культивируемых клеток, являющихся эмбриональными клетками почкй*человека, трансформированными аденовирусом т ипа 5, с помощью плазмиды pHI-HI, а затем культивируют

1780541 клетки, которые экспрессируют цепи химерного антитела, Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи является следующей

GAc стс ААС

ТСТ CGG TAT

ACY CCA GGA

CAG A?C CAC TTG CAC GGA сст мс сст GcA GAG AcA стс AAG A?c тсс тсс AAG Gc?

AAC ТГО СТО AAG CAG

TGG АТА AAC ACC" ТАС

АСС YYC ACA AAC TAT ССД ATG

AAG GCT TYA AAG TCC ATG GGC

CCA ACA ТАТ GCT GAT GAC ТТС

CAA ACC GCC AGC ACT GCC

АСТ GCA GAA

ТТС ТСТ TTG

AAG CGA CGG ТТТ GCC

TTT TTG CAG ATT CAA CAA CCT CAG

ААТ ATC AGG ACT ATG GCT АСА ТАТ ТТС TGT GTA AGA

ТТТ АТТ TCT

GTC TCC TCA

AAG GCC GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACG TCA GTC ACC

Молекулы легкой и тяжелой цепи насто- 15 ящего изобретения ассоциируются с отчетливыми сигнальными пептидами.

Последовательность аминокислотных остатков сигнального пептида тяжелой цепи в основном является следующей 20

Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met

Ata Ala Ala Gln Ser Ala Gin Ala

Нуклеотидная последовательность этого сигнального пептида является следующей 25

ATG GAT TGG CTG TGG AAC TTG CTA TTC

CTG ATG GCA GCT GCC САА AGT GCC САА . GCA.

Новые ДНК-соединения настоящего изобретения являются производными от . 30 кДНК-клонов, полученных из мРНК от линии клеток гибридомы, которая продуцирует моноклональное антитело KS1/4. Плазмида рСКС2310 содержит полную кодирующую последовательность легкой цепи монокло- 35 нального антитела К$1/4; кодирующую последовательность сигнального пептида, ассоциируемую с легкой цепью, и 5 и 3

I нетранслированные участки этой молекулы, 5 — нетраслйрованный участок имеет ДНК- 40

1 последовательность;

5 -ТС TGA CAG ACA СТА CTG TGC СТС GTC

GT TGG GAC CTA ААА GGG СТА GTA GAA

СС GCA AGC ТТТ ТТА АТС ТСТ ССА AAG

AAG ATG АТОТСС ОССАОТАТОТТО TCAGGA 45

AGC ССТТАА АСА AAG ААО GTA АТТ AGC TAG

GGA CCA ААА ТТС ААА GAC ААО-3 .

3 - нетранслированный участок имеет.

gHK-последовательность:

5 — TAG AGA САА AGG ТСС TGA ОАС GCC 50

АСС ACC AGC ТСС CCA GCT ССА TCC TAT

СТТ ССС ТТС ТАА GGA GGT СТТ GGA GGC

ТТС CCC ACA AGC GAC АТА ССА CTG TTG

CGG TGC ТСС AAA ССТ ССТ ССС САС СТС

СТТ СТС СТС СТС СТС ССТ TTC GGC ТТТ 55

ТАТ САТ GCT ААТ АТТ TGC AGA ААА ТАТ

TCA АТА AAG TGA ОТС ТТТ GCA CTT G-3

Плазмида рСКС2310 может быть выделена обйчным способом из Е,соИ К 12

ММ294 (pGKC2310), штамм депонирован и находится в постоянном фонде коллекции культур Северной областной исследовательской лаборатории (И?тВ(), Peoria, Иллинойс. Культура Е.coll К12 MM294/ рКС2310 может быть получена иэ NRRL под входящим номером В-18356.

Плаэмида рС2А52 содержит полную кодирующую последовательность тяжелой цепи моноклонального антитела К$1/4. кодирующую последовательность сигнального пептида, связанного с тяжелой цепью и 5 и 3 — нетранслированные области

1 этой молекулы, Тяжелая цепь, кодируемая этой молекулой, является цепью подкласса

IgG 2А, 5 — нетранслированная область

I имеет ДН К-последовательность:

5 — TCG ТТТ GTC ТТА AGG САС САС

TGA GCC САА GTC ТТА GAC АТС-3 а 3 — нетранслируемая область имеет ДНКI последовательность:

5 — TGA GCT CAG САС ССА САА ААС

ТСТ CAG GTC САА AGA GAG АСС САС

АСТ САТ СТС САТ GCT TCC СТТ GTA

ТАА АТА AAG CAC ССА CGA ATG ССТ GGG

АСС ТАА ААА ААА ААА ААА AAA ААА AGA

CG-3

Плазмида рС2А52 может быть выделена обычным способом из E.coll

K12MM294/pG22A52, также депонированным и находящимся в постоянном фонде коллекции культур NRRL. Культура Е. coll К12

ММ294/pG2A52 может быть получена из

NRRL под входящим номером NRRL В-18357, Плазмидв СНКС2-6 содержит кодирующую КДН К-последовательность вариабельной области природной легкой цепи моноклонал ьного антитела KS1/4, к ДНК кодирующую последовательность сигнального пептида, связанного с этой легкой цепью, и геномную ДНК-последовательность, которая кодирует постоянную область легкой цепи человеческого иммуноглобулина.

Плазмида СНКС2-6 может быть выделена обычным способом из Е. coll К12

DH5/ÑÍÊÑ2-6, также депонированном и находящимся в постоянном фонде коллекции культур NRRL. Культура Е. coll К12.ДН5СНКС2-6 может быть получена из NRRL под входящим номером В-18358. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды

СНКС-2-6 представлены на фиг.12.

Плазмида СН КС-2-18 содержит кодирующую кДНК-последовательность вариабельной области производного с легкой цепью моноклонального антитела KS1/4, кодирующую кДНК-последовательность сигнального пептида, ассоциируемого с легкой цепью, и геномную ДНК-последовательность, которая кодирует постоянную область легкой цепи человеческого имму1780541

10 ноглобулина. Вариация этой последовательности включает альтерацию кодона в 3

-конце, Вариабельная область природной легкой цепи содержит кодон агригина в 3 конце, тогда как кодон в том же положении в плаэмиде СНКС2-18 кодирует остаток глицина. Плазмида СНКС2-18 может быть выделена обычным способом из Е. coll К12

Д Н5/Сн КС2-18, также депонирован нам и находящимся в постоянном фонде коллекции культур NRRI. Культура Е. соИ К12

ДН5/СНКС2-18 может быть получена из

NRRL под входящим номерам NRRL

B/18359. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды СНКС2-18 представлены на фиг.12.

Плазмида СН 2А5 содержит кодирующую кДНК-последовательность вариабельной области тяжелой цепи манаклонального антитела KS1/4; кодирующую кДНК-последовательность сигнального пептида, ассоциированного с указанной тяжелой цепью, и геномную ДН К-последовательность, которая кодирует постоянную область тяжелой цепи человеческого иммуноглабулина lgGI.

Плазмидэ СН2А5 может быть выделена обычным способом из Е. coll К12 MM294/СН2А5, также депонированном и находящимся в постоянном фонде коллекции культур ЙЯИ .

Культура Е. coll К12 MM294/СН2А5 может быть получена из NRRL под входящим номером NRRL В-18360. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды СН2А5 представлены на фиг,13.

Плазмида СН2А551С2 содержит кодирующую кДН К-последовательность вариабельной области тяжелой цепи монаклонального антитела KS1/4, кодирующую кДНК-последовательность сигнального пептида, ассоциированного с тяжелой цепью, и геномную

ДНК-последовательность, которая кодирует постоянную область тяжелой цепи, человеческого иммуноглобулина IgG2. Плазмида

СН2А51С2 может быть выделена обычным способом из Е. соИ К12 ДН5/СН2А51С2, также депонированном и находящимся в постоянном фонде коллекций культур NRRL.

Культура Е. соИ К12 Н5/СН2А5102 может быть получена из NRRL под входящим номером ИЯЯ(В-18361. Сайт ресктрикции и функциональная карта плазмиды CH2A51G2 представлены на фиг,13.

Плазмида СН2А5103 содержит кодирующую кДНК-последовательность вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела KS1/4; кодирующую кДНК-последовательность сигнального пептида, ассоциированного с тяжелой цепью, и геномнуюДНК-последовательность, . которая кодирует постоянную область тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина

IgG3. Плазмида CH2A51G3 может быть выделена обычным способом из Е. соИ К12

ДН5/CH2A51G3, также депонированном и

5 находящимся в постоянном фонде коллекции культур NRRL, Культура Е. coll К12

ДН5/CH2A51G3 может быть получена иэ

NRRL под входящим номером NRRL B18362, Сайт рестрикции и функциональная

10 карта плазмид CH2A51G3 представлены на фиг.14.

Плазмида CH2A51G4 содержит кодирующую кДНК-последовательность вариабельной области тяжелой цепи моноклонального

15 антитела KS1/4, кодирующую кДНК-последовательность сигнального пептида, ассоциированного с тяжелой цепью. и геномную

ДНК-последовательность, которая кодирует постоянную область тяжелой цепи человече20 ского иммуноглобулина IgG4. Плазмида

CH2A5iG4 может быть выделена обычным способом из Е. соИ К12 ДН5/CH2A51G4, также депонираванном и находящимся в постоянном фонде коллекции культур NRRL.

25 Культура E. coll К12 ДН5/СН2А5164 может быть получена из NRRL под входящим номерам NRRL В-18363, Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды CH2A51G4 представлены на фиг.14.

ДН К-соединения настоящего изобретения, кодирующие рекомбинантное KS1/4 и их производные, особенно предпочтительны для конструирования векторов для трансфор35 мации и экспрессии различных цепей антитела в клетках млекопитающих и других эукариотических клетках. Хозяйские клетки многих млекопитающих обладают. необходимым механизмам для распознавания и соответствую40 щей обработки-сигнальных пептидов, находящихся на эминоконцах различных цепей антитела, рассматриваемых в настоящем изобретении. Клетки хозяина некоторых млекопитающих также обеспечивают посттранс45 ляцианные модификации, как, например, гликосилирование, наблюдаемое в молекулах антитела. Существует много разновидностей векторов для трансформации эукариотических клеток хозяина; и специфические векто50 ры, описываемые ниже, не ограничивают объема настоящего изобретения.

Векторы экспрессии настоящего изобретения, которые способствуют получению рекомбинантного KS1/4 и его химерных

55 производных, конструируются при помощи плазмиды phd. Плазмида phd конструируется из широко известных доступных исходных материалов. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды phd представленМ на фиг.11.

1780541

Плазмида phd конструировалась сначала при помощи выделения плазмиды рКС283 от Е, coll К12 ВЕ1201/рКС283. Эта культура может быть получена из NRRL под входящим номером NRRL В-15830. Плазмида рКС283 содержит промотор гибрида IpppZ бактериофага il. Эту плазмиду получали иэ клеток Е. coll К12 ВЕ1201, так как эти клетки содержат термовосприимчивый с I репрессор, интегрируемый в клеточную

ДНК. Ненужный участок IacZ плазмиды рКС283 вырезали сначала путем переваривания плазмиды рекстриктирующим ферментом РЧ и 11. Затем добавляли к перевареннойДНКспецифические ДНК линкеры для превращения PV и 11 сайтов в одиночный Xhof сайт, который создавал плазмиду рКС28РХ. Подробные описания выделения плазмид рКС283 и рКС283РХ представлены соответственно в примерах 1 и 2. Сайт рестрикции и функциональные карты плазмид рКС283 и рКС283РХ представлены на фиг.1. Как описано в примере 3, плазмида рКС283РХ трансформируется в Е.

coil К12 MO (Х) E. coli К12 MO (А+) может быть получена из NRRL под входящим номером NRRL B-15993.

Затем при помощи рестриктирующих ферментов Bg Ill u Xhol переваривали плазмиду рКС283РХ. После этого вектор очищали, ДНК линкеры с Bglii u Xhol-концами лигировали в вектор для образования плазмиды рКС283-п, Bglll-Xhol линкер также одержал Xba 1-сайт. Xho-сайт плазмиды рКС283-Z затем трансформировали в

BamHI-сайт. Это достигалось путем полного переварирования плазмиды рКС283-L рестриктирующим ферментом Xh01, с последующей обработкой ф-м Кленова и добавлением BamHI-линкерами для образования плазмиды pKC283LB.

Подробное описание конструирования плаэмид рКС283-L и pRC283-L В приводится соответственно в примерах 4 и 5, Сайт рестрикции и функциональные карты плаэмид рКС283-L u рКС283-L В представлены на фиг.1;

Периферическую ДНК Е. coll затем вырезали иэ плаэмиды рКС283РХ путем полно. го переваривания рестриктирующим ферментом Sal I с последующей обработкой

4,0kb вектора ф..том Кленова идобавлением

EcoR 1-линкероа. После рециркуляриэации путем лигиробания получали плазмиду рКС283Р RS. Затем плазмиду r ереваривали рестриктазами Pä и l выделяли 085

kb. Фрагмент рестрикции ЯЙ+ 1 - 3gh I.

Аналогичным образом плазмиду рКС283-2 В переваривали рвстриктазами Язт+ 1 и Зри l и выделяли 0,3 kb орагмент

0,85 kb ЯМ+ 1 - ЯрЬ I фрагмента плазмиды рКС283Р RS затем лигировали в

3,0 kb ? + 1 - ЯрЬ 1 фрагмента вектора плазмиды рКС282-L В для образования

5 плазмиды pL32. Подробные описания конструирования плазмид рКС283 PRS и pL32 приведены в примере 6, Сайт рестрикции и функциональные карты плаэмид рКС283

PRS и pL32 представлены на фиг.1.

10 Плазмида pNM789 была получена .из

1чйй! в Е. coll К12 PV 308 (pNM789 под входящим номером В-18216. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмид

pNM789 представлены на фиг.2. Плаэмиду

15 pNM789 частично переваривали рестриктазой QQJ Il, полностью переваривали реотриктазой. Яап Н1, а затем обрабатывали щелочной фосфатазой. Затем в переваренный, обработанный фосфатаэой вектор

20 pNM789 лигировали новый Яй2 11- Ыдп1М1 линкер с целью получения плазмиды 120.

Затем плазмиду 120 полностью переваривали рестриктазами ba и BamHI и выделяли

0,6 kb КЬд1 - EgglHI ЕК-BGH-кодирующий

25 фрагмент рестрикции. Плазмиду pL32 также переваривали рестриктазамиЯа1 и Ядд Н! и выделяли 3,9 kb фрагмента вектора, Затем во фрагмент 3,9 kb вектора плазмиды р1 32 лигировали 0,6 kb Xbal — BamHI

30 фрагмента плаэмиды 120для получения плазмиды р1 47, Подробные описания конструирования плаэмид 120 и pL47 приводятся в примерах 6 и 7.

Сайт рестрикции и функциональные карты плаэмид 120 и pi47 представлены

35 соответственно на фиг.3 и 4.

Плазмида pPR 12 содержит ген с 1857 термовосприимчивого pZ репрессиора, а плазмида рВ R 322 — ген, несущий устойчивость к тетрациклину. Плазмида р PR 12

40 раскрыта и заявлена в патенте США М

4436815, выданном 13 марта 1984 г. Сачт рестрикции и функциональная карта плазмиды р PR12 представлены на фиг.4. Ecol;Iсайт удаляли из плазмиды pPR 12 путам

45 первого полного переваривания плазмиды рестриктазой EcoR 1 с обработкой ф-том

Кленова. Затем вектор рециркулизовали лигированием для образования плазмиды

pBL12 hRI. Затем плазмиду pP R 12 hHI

50 переваривали рестриктазой AVal с обработкой ф-м Кленова. Переваренную AVal и озработанную ф-том Кленова плаэмиду рР R

12 ЛВ1эатемлигировали в Есо RI — линкеры, разрезали рестриктазои Ecol, а затем ре55 циркулизовали с целью получения плазмиды

pPR 12А R I. Подробные описания конструирования плаэмиды pP R l2A R 1 приводятся в примере 8. Сайт рестрикции и функциональная карта представлЕны на фиг.4.

1780541

2;9 kb Pstl — ECOR I фрагмента рестрикции плазмиды pP R 12А R I выделяли после первого переваривания плазмиды" ресктриктазами Pstl и Есо R 1, Плазмиду pL47 переваривали рестриктазами Pstl и Вап1Н!, 5 и,2,6 kb Pstl-BamHI фрагмент рестрикции выделяли, При помощи отдельной реакции плазмиду р247 переваривали рестриктазами Есо R I и BamHI, а-- 1,03 kb Eco R I—

BamHI фрагмента выделяли,.--2,7 kb Pstl- 10

BamHI и..1,03 kb Eco R I — BamHI фрагмента ресктрикции плазмиды pL47 лигировали в 2,9 kb Pstl-EcoRI фрагмента рестрикции плазмиды pP R 12A R I с целью образования плазмиды pL110, Подробное описание кон- 15 струирования плазмиды pL110 приводится в примере 9, Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды рЕ110 представлены на фиг.4.

Вектор типа ВК-энхансера, рассматри- 20 ваемый в настоящем изобретении, содержит кассету ВК-энхансерэ и позднего промотора аденовируса, а также ген, несущий устойчивость к гидромицину, и мышиный ген дигидрофолат-редуктазы (dhbr). 25

Использование ВК-вируса в соединении с поздним промотором аденовируса значительно способствует усилению транскрип-. ции рекомбинатного гена в эукариотических клетках хозяина, Ген, несущий устойчивость 30 к гидромицину, используется в эукариотических клетках хозяина в качестве отборочного маркера .Машинный ген дигидрофолатредуктазы при соответствующих условиях амплифицируется в хромосоме хозяина, 35

Эта амплификация, описанная в обзоре

Schimke 1984, Cell 37:705-713, может также включать ДНК-последовательности, близко соприкасающиеся с dhfr геном. Этот dhfr. ген является селектируемым маркером в 40

dhfr отрицательных клетках и может быть использован для увеличения числа копий сегментов ДНК путем экспонирования клеток хозяина для увеличения уровней метотрексэта. 45

Плазмида pLPChd может быть использована для построения эукариотического . вектора экспрессии для экспрессии нового айтитела К$I/4, рассматриваемого в настоящем изобретении. Плазмида pLPChd со- 50 держит ген dhfr промотор аденовируса типа-2 и энхансер ВК-вируса. BK-вирус, содержащий энхансер ВК-вируса, может быть закуплен или легко выделен в больших количествах так, как описано в примере 10. 55

ВК-вирус также имеется в Американской коллекции типовых культур под входящим номером ATCCVR-837. Сайт рестрикции и функциональная карта ВК-вируса представлены на фиг,5, ВК-вирусный геном комбинировали с частью плазмиды pdBPV. MMT neo с целью построения плазмиды рВК neol и рВК пео 2.

Плазмида pdBPV-MMT пео размером около

15 kb, имеющаяся в ATCC под номером

АТСС 37224, содержит репликон и ген

P лактомазы от плазмиды рВ R 322, промотор мышиного металлотионина, помещенного в целях стимуляции экспрессии структурного гена, который кодирует фермент, несущий устойчивость к неомицину, и

8 kb ДНК бычьего вируса папилломы (В PV). Пл азмиду pd В PV-MMTneo можно переваривать рестриктирующим ферментом BamHI для получения двух фрагментов; . 8 kb фрагмента, содержащего BPV

Д Н К, и -7 kb фрагмента, содержащего другие последовательности, описанные выше, ВК-вирус имеет только один сайт рестрикции BamHI и плазмиды рВК neol и рВК пео 2 конструировали путем лигирования 7 kb BamHI фрагмента рестрикции плазмиды pdBPV ММТ пео в ДНК BamH1 — линеаризованного ВКвируса. Конструирование плаэмид рВК neol и рВК пео 2, которые отличаются только ориентацией дНК ВК-вируса, описано в примере 11. Плазмида pBK neol содержит -.2,1

kb фрагмента рестрикции Sall*-Hindlll, тогда как плазмида рВК пео 2 содержит;,1,0 kb фрагмента рестрикции. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды рВК neol представлены на фиг,5, Каждая из плазмид рВК neol и рВК пео

2 содержит полный геном ВК-вируса, включающий последовательность энхансера; поэтому являются ценными исходным материалом для вектора экспрессии настоящего изобретения, Вектор экспрессии, плазмида рВв cat, содержит последовательность ВК-энхансера в тандеме с поздним и ромотором аденовируса типа 2, помещенного для стимуляции экспрессии фермента хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT).

Плазмида pSV2 cat служит в качестве подходящего источника САТ-гена и может быть взята из АТСС под входящим номером АТСС

37155, ДНК человеческого аденовируса типа 2 является коммерчески доступной и может быть взята из АТСС под номером

ATCCVR-2, Иллюстративную плазмиду

pBZcat конструировали путем лигирования содержащего поздний промотор Accl-PVU II фрагмента рестрикции ДНК человеческого аденовируса типа 2 в BCII-линкеры с тупым концом, которые соединяются только с PVU

II-концом Accl-PVU II фрагмента рестрикции. Полученный в результате фрагмент затем лигировали в 4,51 kb ACCI-PVU фрагмента рестрикции плазмиды pSV2cat с целью получения промежуточной плэзмиды

1780541

10

45

55

pLPcat. Целевую плазмиду pBLcat конструировали иэ плазмиды pLPcat путем лигирования начала репликации и энхансер-содержащего(1,28kb) АссН Чи И-фрагмента рестрикции

ДНК BK-вируса в 4,81 kb Accl-Stu фрагмента рестрикции плазмиды р1 Рсва. Конструирование плазмиды рВ1сатописзно ниже в примере

12. Сайт рестрикции и функциональные карты плазмид pLPcat u pBLcat представлены на фиг.6.

Затем из плазмид рНС7, pSV2-dpt и pSV2

Р-глобина конструировали плазмиду pL133.

Плазмида рНС7 содержит ДНК-последовательность, которая кодирует человеческий белок. С, Плаэмида рНС7 может быть выделена из Е. coll К12 RR1/ рН С7, которая имеется в NRRL под номером NRRL 1-15926.

Плазмиду рНС7 разрезали рестриказой

Baml и выделяли 1.25 kb фрагмента рестрикции. Затем добавляли линкеры и фрагмент разрезали рестриказами Apal u HI nd И, а после этого выделяли 1,23 kb фрагмента рестрикции. Далее плазмиду рНС7 разрезали рестрикаэой Pst, 0,88 kb фрагмента рестриказы выделяли, добавляли линкеры, фрагмент снова разрезали рестриктазами и выделяли 0,19 kb Apal-Bg II фрагмента рестрикции. Плазмиду pSV2 gpt (АТСС 37145) переваривали рестриктазами Hind III u Bg

lll и выделяли 5,1 kb фрагмента. - 1,23 kb фрагмента рестрикции Hlndl1l-Apal,- 0,19 kb фрагмента Apal-Bg III и 5,1 kb фрагмента

Hindlll-Bglll ëèrèðoâaëè вместе для получения промежуточной плазмиды pSV 2-НРС8.

Более подробное обьяснение конструирования плаэмиды psV2-НРС8 приводится в примере 13. Схема этого конструирования представлена на фиг,7.

Затем плаэмиду pSV2-НРС8 разрезали рестриктазами Hindlll u Sall и выделяли

-0,29 kb фрагмента рестрикции. Таким же образом разрезали также плазмиду pSV2НРС8 рестриктазами Bg ill u Sall и выделяли фрагмент рестрикции (1,15 kb).

Плазмиду pSV2- Р-глобин (ЯВИ B-15928) разрезали рестриктазами Bg IИ и Hind 1И, выделяли 4,2 kb фрагмента рестрикции. Эти три фрагмента затем лигировали вместе с целью получения р1 133.Плазмиду pL133 переваривали рестриктазой Hlndlll, затем обрабатывали щелочной фосфатаэой.

Плазмиду pBLcat также разрезали рестриктазой Htndlll и выделяли n0,87 kb фрагмента рестрикции. Этот фрагмент лигировали в вектор разрезанной Hind Ill.è обработанной фосфатаэой плазмиды pL133 с целью получения плазмиды pLPC. Так как фрагмент

Hlndlll плаэмиды pBLcat может быть встав. лен в плазмиду pL133 в двух ориентациях следует отметить, что pLPC является плазмидой, где надлежащая ориентация обеспечивает 1 kb фрагмента Ndll Stul. Плаэмида

pLPC подобно плаэмиде pL133 содержит энхансер, ранний и поздний промоторы, Т-антиген связывающие сайты и начало репликации

SV40. Подробные протоколы конструирования плаэмид pL133 и pLPC приведены в примерах

13 и 14. Сайт рестрикции и функциональные карты плазмид pL133 и pLPC представлены соответственно на фиг.7 и 8, Элементы SV40, присутствующие на плазмиде pLPC, расположены слишком близко и трудно различимы. Связывание Тантигена с Т-антигенсвязывающими сайтами, необходимое для SV40 репликации и применяемое для усиления транскрипции из SV40 позднего промотора, неожиданно имело подобное действие на ВК поздний промотор. Так как высокий уровень Т-антигенстимулированной репликации плазмиды, содержащей SV40 начала ренликации, является обычно летальным для клеток хозяина ни плазмида pLPC, ни плазмида р1 133 не могут стабильно поддерживаться в качестве эписомных (экстрахромосомных) элементов в присутствии SV40 T-антигена, а скорее эти две плазмиды должны интегрироваться в хромосомной ДНК-клетке хозяина для своего стабильного существования.

Полная структура области ВК-энхансера полностью совпадает со структурой 40 для

ВК-энхансера начала репликации, ранних и поздних промоторов и ВК-аналога Т-антигенсвяэывающих сайтов являются близко расположенными и поэтому трудно различимыми на ВК-вирусной ДНК. Однако при выращивании в присутствии BK-Ò-антигена плазмида, содержащая ВК начало репликации и Т-антигенсвязывающие сайти, не реплицируется до некоторого предела, который . является летальным, и стабильно поддерживается в качестве эписомного элемента в клетке хозяина. Более того репликация, стимулированная Т-антигеном, может быть использована для увеличения числа копий вектора, содержащего ВН-начало репликаций, так, что если приложить давление отбора, большее число копий плазмиды, будет интегрироваться в хромосомную ДН К-клетки хозяина. Очевидно, вследствие сходных структурно-функциональных соотношений между ВК- и SV40 Т-антигенами и их соответствующих связывающих сайтов ВК-репликация также стимулируется SV40 Т-антигеном.

Эписомное поддержание вектора экспрессии рекомбинантной ДНК не всегда является предпочтительным при интеграции в хромосому клетки хозяина. Однако из-за отсутствия селектируемого маркера, функцио17

1780541

10

30

55 нирующего в эукариотических клетках, идентификация стабильных эукариотических трансформантов плаэмиды pLPC является затруднительной, если только плазмида pLPC не трансформируется совместно с другими плазмидами, содержащими селектируемый маркер.

Следовательно, плазмида pLPC была модифицирована с целью получения производных плаэмид, являющихся селектируемыми в эукариотических клетках хозяина. Это достигается лигированием плазмиды pLPC в часть плазмиды pSV2 hyg плазмиды, которая содержит ген, несущий устойчивость к гидромицину. Плаэмида pSV2 hyg может быть получена из Северной региональной исследовательской лаборатории (NRRL), Пеория, 1 61640, под номером NRRL В-18039.

Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды pSV2 hyg представлены на фиг.8.

Плаэмиду SV2 hyg переваривали рестриктазой BamHI, и выделяли 2,5 kB фрагмента ректрикции BamHI, который содержит полный ген, несущий устойчивость к гидромицину, затем обрабатывали ферментом Кленова (большой фрагмент, полученный при дроблении субтилизином

Е, coli ДНК-полимеразы 1) и после этого лигировали в обработанные ферментом

Кленова 5.82 kb Ndel-Stul фрагмента рестрикции плазмиды pLPC с целью получения плазмид pLPChyg 1 и pLPChyg 2.

Плаэмиды pLPChyg 1 и pLPChyg 2 отличаются между собой только ориентацией фрагмента, несущего устойчивоСть к гидромицину. Плаэмида pLPChyg содержит п 5,0 kb фрагмента Hindll, тогда как плазмида

pLPChyg 2 содержит 1,0 kb фрагмента. Протокол конструирования для плазмид р РСйу9 и pLPChyg 2 приводится в примере 15, Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды pLPChyg 1 представлены на фиг.8.

Затем конструировали плазмиду pBL32, которая содержит мышиный ген (dhfr) гидрофолат-редуктазы. Плазмиду рТРА102 (NRRL В-15834) разрезали рестриктазой 1й

ill и выделяли 4,4 kb фрагмента ресктрикции. Этот фрагмент обрабатывали ферментом Кленова, добавляли линкеры и затем разрезали рестриктазами HindiÈ вЂ” BamHI c целью получениям2 kb фрагмента рестрикции, затем путем лигирования 288 п,о, Cla1 — EcoRI фрагмента рестрикции плазмиды рТРА102 в Cia I — EcoR I в разрезанный вектор рКС7. Плазмида рКС7 может быть получена из АТСС под номером ATCC 37083.

Плазмиду рКС переваривали рестриктаэами

BamAI и Hindlll, затем лигировали в 2 kb фрагмента рестрикции плазмиды рТРА102, полученной выше, и получали плазмиду рТРА103. Протокол конструирования плаэмиды рТРА103 приводится в примере 16А, Схема этого конструирования представлена на фиг.9, Плазмиду рТРА103 разрезали рестриктазой Bglll, обрабатывали ферментом Кленова и добавляли линкеры Ndel. Затем эту смесь лигировали и получали плазмиду

pTPA103 der Nde1. Плаэмиду pTPA103-der

Ndel разрезали рестриктаэой и выделяли.1,4 kb фрагмента. Этот фрагмент обрабатывали ферментом Кленова, затем после добавления Hpal линкеров разрезали рестриктазой Есор!к770 п.о. фрагмента, содержащего trp PO и аминоконцы ТРА, лигировали в EcoRI Smal переваренный вектор ри С19 и получали плазмиду ри С19ТРАЕЕ.

Плазмиду ри C19TPAFE частично переваривали рестриктазой Hpal, затем полностью разрезали рестриктазой BamHI. Полученные - 3,42 kb Hpal-BamHI фрагмента рестрикции затем лигировали в 1,015

Seal-BamHI — фрагмент, полученный из плазмиды рТРА103 и получали плаэмиду

pBW25. Протокол конструирования плазмиды pBW25 приводится в примере 16В. Схема этой конструкции представлена йа фиг.9.

Плазмиду pBW25 разрезали рестриктазами Hlndlll è EcoR I è полученные в результате -810 п.о. фрагмента лигировали в Hind

Itl — EcoR l-разрезанный фаг М13-mp8 (биолаборатории Новой Англии) и получали фаг

pM8BW26. Затем на фаге pM8BW26 (при делеции ДНК, кодирующей аминокислотные остатки) осуществляли in vitro реакцию мутагенеза, в результате чего получали фаг

pM8BW27. Фаг pM8BW27 разрезали рестриктазами Есо Rl u Ndel и выделяли-560 п,о, фрагмента рестрикции. Затем синтезировали 48 п,о, линкера Ndel — Xbal. Плазмиду рТРА103 разрезали рестриктазами Есо R

I u BamHI и выделяли 689 п.о. фрагмента..

Плазмиду pL 110, построенную по методу примера 9, частично переваривали рестриктазой BamHI, затем полностью разрезали

Xbal и выделяли 6 kB фрагмента. Эти-.6 kb фрагмента вектора. 689 п.о. фрагмента плазмиды рТРА103, 560 п.о. фрагмента

pM8BW27, и.48. п.о. линкера затем лигировали вместе, в результате чего получали плаэмиду pBW28. Протокол конструирования плазмиды pBW28 приводится в примере 16С, Схема этой конструкции представлена на фиг.10.

Затем путем лигирования 2 kb Hind (!!—

Bg III фрагмента плазмиды pTRA103 в 4,2

kb Hind III — Bg III фрагмента плаэмиды pSV2

j3-глобин плазмиду pSV2 — dhfr (ATCC

37146) разрезали рестриктаэой PVUII. После добавления BamHI линкеров в BamHI

1780541

20 разрезанную и обработанную фосфатазой плазмиду рТРА301 лигировали 1,9 kb фрагмента, несущего ген dhfr, в результате чего получали плазмиду рТРА303. Плазмиду рТРА301 разрезали рестриктазами EcoR I u

Bg I I и получали-2,7 kb фрагмента. Плазмиду рТРАЗОЗ разрезали рестриктазами Hind

III u EcoR и получали- 2340 п.о. фрагмента, содержащего ген dhfr. Плазмиду рТРА303 разрезали рестриктазами Hind III u Sst и получали 1,7 kb фрагмента. Плазмиду

pBW28 разрезали рестриктазами Xhoil u

Sstl и получали „680 п.о. фрагмента, С целью получения плазмиды рВЧЧ32 лигировали вместе; 2,7 Есо R I — Bg II фрагмента плазмиды рТРА301, 2340 п.о. Hind !!! — Есо

R I фрагмента плазмиды рТРАЗОЗ, 1,7 kb

HindlII — Sst1фрагмента плазмиды рТРА303 и 680 п,о. Xball — Sst! фрагмента плазмиды

pBW28. Протокол конструирования плазмиды рВЧЧ32 приводится в примере 16D, Схема конструкции представлена на фиг.10. ж 1,9 kb BamHI dhfr ген содержащего фрагмента плазмиды pBW32 изолировали. обрабатывали ферментом Кленова и вставляли в частично Есо R — переваренную плазмиду pLPC hyg1 с целью получения плазмид pl PChyg1 и pLPChd2, Плазмида

pLPChyg1 содержит два сайта распознавания рестриктазы Eco R I; один в гене, несущем устройчивость к гидромицину, и один в последовательностях, происходящих от плазмиды РВР322. Фрагмент, содержащий ген dhfr вставляли в Есо R ) сайт, расположенный в рВ R 322-производных последовательностях плазмиды pLPChyg1, и получали плазмиды pLPChd 1 и pLphd 2. В целях раскрытия настоящего изобретения плазмиду

pLPChd 1 обозначали как празмиду pLPChd.

Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды pLPChd представлены на фиг,11.

Конструирование плазмид pLPChd1 и

pLPChd2, которые отличаются только ориентацией ДНК-сегмента, содержащего ген

dhfr, описано в примере 17, Затем путем трансформирования и повторного выделения плазмиды pLPChd npu помощи dam-штамма Е. со!! конструировали плазмиду phd. После этого плазмиду

pLPCnd переваривали растриктазой Bcli u рециркулизовали для получения плазмиды

phd. Плазмида phd образовывалась отделеции экстра Bell линкеров, прицепленных при построении плазмиды pLPcat, и двух смежных Вс!! фрагментов рестрикции с общим размером около 1,45 kb от плазмиды

pLPChd. ДНК, кодирующую полную кДНК, которая кодируетлегкую цепь моноклонального антитела KSI/4, лигировали в плазмиду

phd для получения вектора экспрессии pLKSL1100 п.о. Есо R — фрагмента плазмиды рСКС2310 обрабатывали ферментом Кленова, лигировали в BamHI линкеры, а затем лигировали в Bell — переваренную плазмиду

phd. Подробные описания конструирования плазмид phd u pL-KSL приводятся в примерах 18 и 19. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды представлены на фиг.11.

Плазмида рН-KS является вектором на5

10 ла KS1/4, связанную с геномной ДНК, кодирующей постоянную область человеческого

IgG1, конструировали из плазмиды phd u плазмиды СН2А5. Плазмиду СН2А5 переваривали рестриктазой Eco R I, обрабатывали

55 ферментом Кленова. а затем лигировали в

BamHt-линкеры. Затем плазмиду переваривали растриктазой Bam HI и выделяли -7,4 kb фрагмента рестрикции, Этот фрагмент лигировали с Bell-переваренную плазмиду phd u стоящего изобретения, происходящим от плазмиды phd и плазмиды рС2А52. 1,6 kb

Есо R I — фрагмента плазмиды рС2А52 выделяли, обрабатывали ферментом Кленова и

15 соединяли с BamHI линкерами. Этот фрагмент содержит полную кДНК, которая кодирует тяжелую цепь моноклонального антитела KS 1/4. Затем этот фрагмент лигировали с Bell — переваренную плазмиду phd

20 с целью получения плазмиды экспрессии рН-KS, Плазмида pL-HD является вектором экспрессии, построенном из плазмиды phd и плазмиды СНКС2-18, который содержит

ДНК, кодирующую производное вари25 абельной области легкой цепи KS1/4, связанной с постоянной областью легкой цепи человека, 1,3 kb Рпи Д !! — Hind lil фрагмента плазмиды СЕКС2-18 выделяли и обрабатывали ферментом Кленова. Затем

30 этот фрагмент лигировали в Bell-переваренную, обработанную ферментом Кленова плазмиду phd, в результате чего получали плазмиду экспрессии pL-НД. Подробные описания конструирования плазмид рН Я35 KS u pL-НД приводятся в примерах 20 и 21.

Плазмида pL-НД 2 является вектором экспрессии, построенным из плазмиды phd и плазмиды СНКС2-6, который содержит

ДНК, кодирующую природную последова40 тельность вариабельной области легкой цепи KS1/4, связанной с постоянной областью легкой цепи человека,-1,3 kb Fnu Д!! — Hind

II I фрагмента плазмиды СН КС2-18 выделяли и обрабатывали ферментом Кленова. Затем

45 этот фрагмент лигировали в Bell-переваренную, Кленов — обработанную плазмиду phd, в результате чего гголучали плазмиду экспрессии р! -НД 2. Плазмиду рН 1-НД, которая содержит кДН К, кодирующую

50 вариабельную область тяжелой цепи антите21

1780541

22 получали плазмиду экспрессии рН1-НД.

Подробные описания конструирования плазмид р1 -НД и рН1-НД, приводятся соответстенно в примерах 22 и 23, Плазмиду рН2-НД, которая содержит кДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи KS 1/4, связанную с геномной

ДНК, кодирующей постоянную область человеческого 19G2, конструировали из плазмиды phd и плазмиды CH2A51G2. Плазмиду

CH2A51G2 переваривали рестриктазой

Есо R I, обрабатывали ферментом Кленова, затем лигировали Bam Hl линкеры. После этого плазмиду переваривали рестриктазой

BamHI и выделяли л 6,1 kb фрагмента рестрикции. Этот фрагмент лигировали в Bcllпереваренную плаэмиду phd в результате чего получали плазмиду экспрессии рН2НД. Плаэмиду рНЗ-НД, которая содержит кДНК; кодирующую вариабельную область тяжелой цепи KS1/4, связанную с геномной

ДНК, кодирующей постоянную область человеческого 1963, конструировали из плазмиды phd и плазмиды СН2А5163, Плазмиду

CH2A51G3 переваривали рестриктазой Есо

R l, обрабатывали ферментом Кленова, а затем лигировали в BamHI линкеры, После этого, плазмиду переваривали рестриктазой

BamHl и выделяли 7,4 kb фрагмента рестрикции. Этот фрагмент лигировали в Bell — переваренную плазмиду phd, в результате чего получали плазмиду экспрессии рНЗ-НД. Подробные описания конструирования плазмид рН2-НД и рНЗ-НД и риводятся соответственно в примерах 24 и 25.

Плазмиду рН4-НД, которая содержит кДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи KS1/4, связанную с геномной

ДНК, кодирующей постоянную область человеческого !964, конструировали из плазмиды phd и плазмиды СН2Ф5164. Плазмиду

CH2A51G4 переваривали рестриктазой

EcoR1, обрабатывали ферментом Кленова, а затем лигировали в BamHI линкеры, После этого плазмиду переваривали рестриктазой

BamH1 и выделяли 6,4 kb фрагмента рестрикции. Этот фрагмент лигировали в

Bell — переваренную плазмиду ркиб, в результате чего получали плазмиду экспрессии рН4-НД. Более подробные описания конструирования плазмиды приводятся в примере 26.

Настоящее изобретение не ограничивается использованием конкретных эукариотических промоторов, представленных в изобретении. Другие промоторы, например промоторы гомологичногно или гетерологичного иммуноглобулина, поздний промотор

ЯЧ40 или промоторы от эукартиотических генов, в частности от экстроген-индуцируемо5

15

25

50 .ДН К, Так как продукт непосредственно ран55

45 го гена циплячьего яичного альбумина, гена интерферона, гл юкокортикоид-индуцируемого гена тирозин-аминотрансферазы. главного раннего гена аденовируса и раннего промотора SV40, могут быть легко выделены и модифицированы для использования на векторах экспрессии рекомбинантной ДНК, построенных для получения антител в эукариотических клетках хозяина. Эукариотические промоторы могут быть также использованы в совокупности в целях стимулирования таких антител. Кроме того, известно большое количество ретровирусов, инфецирующих широкий ряд эукариотических клеток хозяина, Длинные концевые дупликации в ДНК ретровирусов часто кодируют активность промотора и могут быть использованы вместо позднего промотора ВК-энхансераденовируса, описанного выше, в целях экспрессии антитела KS1/4 и его производных. Настоящее изобретение также не ограничивается приведенными селектируемыми маркерами на описанных плазмидах. Существует большое разнообразие селектируемых маркеров для эукариотических клеток и прокариотических клеток, которые являются пригодными для использования при клониррвании рекомбинантной ДНК или вектора экспрессии, содержащего ДНК-соединение или последовательность настоящего изобретения.

Различные векторы экспрессии могут быть трансформированы и экспрессированы в целый ряд эукариотических клеток хозяина, в частности клеток млекопитающих.

Векторы экспрессии содержат также последовательности. которые получают для репликации в Е.coll, так как более эффективно получать ДНК плазмиды в Е.coli. чем в других клетках хозяина, Экспрессия антител происходит в клетках хозяина, в которых конкретный промотор, ассоциированный с антителом, является функцией структурного гена, Для специалистов очевидно, что ряд эукариотических клеток хозяина может быть использован для экспрессии различных антител при использовании позднего промотора ВК-энхансера-аденовируса, поскольку клетка хозяина экспрессирует продукт непосредственно раннего гена вируса него гена может быть введен в клетки хозяина многими способами, например трансформация плазмидой или другим вектором, практически любая эукариотическая клетка может быть использована в настоящем способе. Предпочтительными клетками хозяина в способе настоящего изобретения являются клетки человека, так как человеческие клетки являются естественными хозяевами для ВК-вируса и могут заключать

1780541 клеточные факторы, которые служатдля стимуляции ВК-энхансера. Хотя человеческие клетки могут быть использованы в качестве клеток хозяина, линия 12 — трансформированных клеток Syrian Kamster аденовируса 5

AV12, которые экспрессируют гена Е1А, является наиболее предпочтительной и имеется в Американской коллекции типовых культур в Роквилле, шт. Мэриленд, под входящим номером АТСС С RL9595 (депонирована 24 10 ноября 1987 г.). Стандартная процедура трансформации описана подробно в примере 27.

При трансформации вектором экспрессии, кодирующим тяжелую цепь иммуногло- 15 булина, AV12 клетки выделяют обработанную тяжелую цепи в супернатанте. Однако AV12 клетки,.трансформированные вектором экспрессии, кодирующим легкую цепь", не выделяют указанную легкую цепь, если только эти 20 клетки не являются также трансформированными вектором экспрессии, кодирующйм тяжелую цепь. Способ выделения клонов, экспрессирующих различные цейи иммуноглобулинов настоящего изобретения. описан в 25 примере 28. Функциональные KS1/4 и производные KS1/4 могут быть очищейы"от супернатанта клеток AV12. которые являются трансформированными совместно векторами, кодирующими легкую и тяжелую цепи. 30 . Таким образом, путем подбора и смешивания различных легких и тяжелых цепей настоящего изобретения можно получить множество вариантов К$1/4.

Эксйрессия молекул иммуноглобулина 35 с легкой и тяжелой цепью в нелимфоидной системе имеет значительное преимущество по сравнению с лимфоидными системами.

Обычно моноклональные антитела выделяются и очищаются от лимфоидных систем, 40 например миеломные и гибридомные клетки. Такие клетки часто экспрессируют значительное количество гетерогенных антител. Это явление объясняется тем, что лимфоидные клетки являются естествен- 45 ными секреторами антител. При трансформации посредством ДН К, кодирующей отдельные антитела или слияния с другими . клетками, продуцирующими различные антитела, эти лимфоидные клетки иногда ста- 50 новятся двойными секреторами. Клеточные линии с двойной секрецией производят много антител с гибридноймолекулярной структурой, большая популяция которых яв- ляется нежелательной. Эти нежелательные 55 гибриды должны затем отделяться от целевого продукта с использованием дорогой и занимающей много времени технологии.

Способ настоящего изобретения устраняет эту проблему путем использования нелимфоидных клеток, которые не секретируют молекул антител естественным образом.

Поэтому, целевым гомогенным продуктом являются только антитела, которые секретируются в супернатанте.

Возможны много модификаций и вариантов рассматриваемых в настоящем изобретении последовательностей ДНК и плазмид. Например, деградация генетического кода корректируется заменой нуклеотидов на протяжении областей, кодирующих полипептиды, а также заменой, например, ТАС или ТСА — трансляционных стоп-сигнаАТС АСТ лов на ТАА — трансляционный стоп-сигнал.

АТТ

Такие последовательности могут быть получены из ныне известных аминокислотной или ДНК-последовательности антитела

KS1/4 и могут быть сконструированы в соответствии со стандартными синтетическими методами. Такие синтетические методы могут быть выполнены в соответствии с методикой Itakura et al 1977; Science 198:1956 и

Crea et al., 1978, Proc.Nat,Acad, Sci USA

75:5765. Кроме того, синтетические гены и линкеры могут быть синтезированы также с использованием синтезатора ДНК (Systec

1450А Systec Inc, 3816 Chaulder Drleve, Minneapolis, MN) или синтезатор ABS380A (Applied Blpsystems Inc, 50 Zlucolu Center

Drive, Forsber City СА 94404). Существуют также и многие другие синтезаторы ДНК, которые также могут быть использованы для синтеза ДНК-фрагментов. Поэтому настоящее изобретение не может быть ограничено

ДН К-последовательностями и плазмидами, представленными в настоящем описании в качестве примеров.

Специалистам в данной области нетрудно понять, что векторы экспрессии настоящего изобретения используются для трансформации эукариотических клеток хозяина так, чтобы полипептиды с различными структурами легкой и тяжелой цепей экспрессировались клеткой хозяина. Если клетка хозяина трансформируется вектором, со-: держащим промотор, который функционирует в этой клетке хозяина и стимулирует транскрипцию структурных генов иммуноглобулина, и если эта клетка хозяина обладает клеточным механизмом для обработки сигнальных пептидов, то зрелые антитела или цепи антител вырабатываются клетками. При другйх условиях экспрессии, когда только легкие цепи иммуноглобулина экспрессируются клеткой хозяина, эти легкие цепи должны быть выделены из клетки хозяина.

Как установлено выше, векторы, методы, трансформированные клетки и антите25

1780541

50

55 ла, рассматриваемые в настоящем изобретении, могут быть весьма эффективными в борьбе против рака. Моноклональное антитело KS1/4 является эффективным агентом в диагностике, прогнозе и лечении аденокарциномы у Bumol in Reisfeld, R.À. и $еИ S

eds Monoclonal Antibodies and Cancer

therapy, New York Alan R.Llss inc, 1985, 257259. Spearman et al., 1987, I.Pharmacol and

Ехр. Therap. 241:695-703, данные которых вводятся в настоящее описание посредством ссылки, раскрывают использование коньюгата; моноклональное антитело-винкаалкалоид в распознавании локализации и лечении опухолей. Это KS1/4 — DAVL В (4дезацитилвинобластин) — коньюгат вызывает также супрессию опухолевого роста, как описано Bumol et al. In Cerianl, R.L. ed

Immunologic Approaches to the Diagnosis

and Therapy of Breast Cancer, New York and

London; Plenum Press 1987. 205-215. данные которых вводятся в описание настоящего изобретения посредством ссылки.

Биохимические и иммунологические исследования показали, что рекомбинантные и химерные молекулы KS1/4 настоящего изобретения обладают такой же антигенной реактивностью, как и молекулы KS1/4:,. происходящие из клеток гибридомы.

Однако использование мышиных антител имеет тот недостаток, что указанные антитела часто вызывают неправильный иммунологический ответ в организме человека. Это наблюдалось у некоторых пациентов, лечащихся KS1/4. Этот недостаток можно устранить, если использовать химерные антитела настоящего изобретения, Если заменить постоянные области антитела

1, K51/4 постоянными областями человеческого происхождения, иммунная система пациента распознает химерное антитело как "свое" и поэтому вырабатывает меньше . анти-KS1/4 антител, Более того использование человеческих постоянных областей способствует активации комлемента и других клеточн ых ответов.

Специалистам в данной области также нетрудно понять, что неизвестные до сих пор аминокислотные и ДНК-последовательности KS1/4 могут быть использованы для создания новых производных с высокой или низкой степенью сродства,Различные части антитела могут быть подвергнуты делеции или мутации для создания новых антител или же части одной цепи могут быть заменены участками другой цепи. Рентгеновское кристаллографическое исследование показывает, какие именно аминокислотные . остатки антитела появились в непосредственной близости аминокислотными остатками антигена, с которым связывается антитело KS1/4. Используя белковую инженерию, антитело KS1/4 можно модифицировать для получения негативных остатков около позитивных остатков на антигене. Такие "сконструированные" антитела затем отображают модифицированное родство к поверхностному антигену клетки у больных раком.

Приведенные ниже примеры иллюстрируют осуществление настоящего изобретения, В этих примерах даются описания способов конструирования объектов настоящего изобретения и объяснения к ним, там, где это целесообразно, Пример 1, Выделение плазмиды рКС283, Лиофилы Е. coll К12 ВЕ1201/рКС283 были взяты из Северной региональной исследовательской лаборатории, Пеория, Иллинойс 61604. под номером NRRL В15830. Эти лиофилы сливали в пробирки, содержащие 10 мл 1 В-среды (10 г бактотриптона, бактодрожжевого экстракта и 10 г

NaCI на литр; рН доведен до 7,5) и инкубировали в течение 2 ч при 32 С, после чего культуру помещали в 50 мкгlмл ампициллина и инкубировали при 32 С в течение ночи.

Клетки Е. coli К12 ВЕ1201/рКС 2283 культивировали при 32 С, так как эти клетки содержат ген термовосприимчивого с репрессора, интегрированный в клеточной

ДНК. Если клетки, которые содержат ген дикого типа лямбда pL-репрессора или не содержат лямбда pL-промотор, используются в процессе выделения плазмиды, как описано в нижеследующих примерах, температура инкубации равна 37 С.

Небольшую часть ночной культуры помещали в чашки с, . В-агаром (В-среда с 15 г/л бактоагара), содержание 50 мкг/мл ампициллина для получения одноколониевого изолята Е. соИ К 12 ВЕ1201/р С283. Полученную одноколониевую культуру инокулировали в 10 мл LB-среды. содержащей 50 мкгlмл ампициллина, и инкубировали в течение ночи при 32 С при энергичном встряхивании.10 мл ночной культуры инокулировали в 50 мл 1 В-среды, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, и инкубировали при 32 С энергично встряхивая при этомдо тех пор, пока культура не достигнет стационарной фазы.

Последующая методика была заимствована из работы Manlalls et al. 1982, Molecular

Cloning (СОИ Spring Harboriaboratory), Урожай клеток собирали при помощи центрифугирования при 400 r за 10 мин при

4 С, а супернатант отбрасывали. Клеточный осадок промывали в 100 мл охлажденного

1780541

28 льдом STE-буфера (0,1M NaCI 10 мМ трисHCI, рН 7,8 и 1 мМ ЭДТК). После промывания клеточный осадок ресуспендировали в

10 мл раствора 1 (50 мМ глюкозы; 25 мМ трис-HCI, рН 8 и 10 мМ ЭДТК), содержащего

5 мгlмл лизоцима, и оставляли на 10 мин при комнатной температуре, 20 мл раствора

2 (0,2 н. NaOH и 1 ДДС), затем добавляли к клеткам, обработанным лизоцимом, и полученный раствор осторожно смешивали путем инверсии. Эту смесь инкубировали на льду в течение.10 мин.

К смеси лизированных клетЬк добавляли 15 мл охлажденного льдом 5 мМ ацетата калия, рН 4,8 и раствор смешивали инверсией, Полученный раствор инкубировали на льду в течение 10 мин. 5 М раствор ацетата калия изготовляли путем добавления 11,5 мл деляной уксусной кислоты к 28,5 мл воды и 60 мл 5М ацетата калия; полученный раствор имел соотношение: ЗМ относительно калия и 5М относительно ацетата.

Смесь лизированных клеток центрифугировали в аппарате Beckman SW27 (или его эквиваленте) при 4 С со скоростью 20000 об/мин. в течение 20 мин. На дне пробирки образуетСя осадок из клеток ДНК и продукта распада клеток, Около 36 мл супернатанта восстанавливали и добавляли 0,6 объема изопропанола, смешивали и полученный в результате раствор оставляли при комнатной температуре на 15 мин. Плазмидную

ДНК собирали при помощи центрифугирования при 12000 г за 30 мин при комнатной температуре. Суйернатант отбрасывали, а осадок ДНК промывали 70 этанола при комнатной температуре. Затем этанол сливали, а остаток высушивали в вакуумном испарителе. Затем осадок ресуспендировали в 8 мл ТЕ-буфера (10 мМ трис-HCI, рН 8 р

1 мМ ЭДТК).

К раствору ДН К добавляли 8 г CSCI. Ha каждые 10 мл CSCI — ДНК-раствора добавляли около 0,8 мл 10 мг/мл раствора броми да этидия в воде. Конечная плотность раствора составляла около 1,55 г/мл, а концентрация бромида этидия составляла около 600 мг/мл. Раствор помещали в пробирку . центрифуги Hackman типа 50, которую наполняли до краев парафиновым маслом, герметично закрывали и центрифугировали при 40000 об/мин в течение 24 ч при 20 С.

После центрифугирования визуально прослеживались две полосы ДНК. После удаления крышки из пробирки нижнюю полосу

ДНК удаляли при помощи шприца с иглой (821) для подкожных инъекций, введенной через боковую сторону пробирки центрифуги.

Бромид этидия удаляли путем многократного экстрагирования водонасыщен5

10 ным 1-бутанолом, CSCt удаляли посредством диализа против ТЕ-буфера. После экстрагирования буферным фенолом, а затем хлороформом, ДНК осаждали, промывали

707-ым этанолом и высушивали. После чего получали 1 мг плазмиды рКС283, которую хранили при 4 С в TE-буфере с концентрацией около 1 мкг/мкл. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды рКС283 представлены на фиг.1.

Пример 2. Конструирование плазмиды рКС283РХ.

Около 10 мкм ДНК плазмиды рКС283, 15 полученной в примере 1, смешивали с 20 мкл 10-кратного солевого буфера рестрикции (500 мМ NaCI, 100 мМ трис-HCI, рН 7,5, 100 мМ Mg CI2 и 10 мМ ДТТ), 20 мкл 1 мг!мл

БСА, 5 мкл рестриктазы PVU It (50 ед;, как

20 определено Bethesda Research Laboratoria (BRL), где были получены все рестриктирующие ферменты) и 145 мкл воды, полученную в результате реакционную смесь инкубировали при 37 С в течение 2 ч. Ре25 акции рестрикции, описываемые в настоящем изобретении, обычно заканчиваются экстрагированием фенолом и затем хлороформом с последующей преципитацией

ДНК, промывкой этанолом и ресуспендиро30 ванием ДНК в TE-буфере. После переваривания PVUlt, как описано выше, PVU— переваренная ДНК плазмиды рКС283 осаждали, затем ресуспендировали в 5 мкл ТЕбуфера.

35 Около 600 пикомолей (рМ) Xhol линкеров (5 — ССТ CGA GC-3 ) киназировали в смеси, содержащей 10 мкл 5-кратного киназного буфера (300 мМ трис-HCI, рН 7,8, 50 мМ MgCtz,25 мМ ДТТ), 5 мкл 5 мМ АТФ, 24

40 мкл Н20, 0.5 мкл Т4 полинуклеотидкиназы (около 2,5 ед. как определялось при помощи

Р-L-биохимического анализа), 5 мкл 1 мг/мл

БСА и 5 мкл 10 мМ спермидина путем инкубирования смеси в течение 30 мин при 37 С.

45 К 5 мкл ДНК РЧ0П-переваренной плазмиды рКС283 добавляли около 12,5 мкл киназированных Xhot линкеров, затем 2,5 мкл

10-кратного лигазного буфера (300 мМ трисH CI, р Н 7,6: 100 MM и 50 м М ДТТ), 2,5 мкл t

50 мг/мл БСА, 7 мкл 5 мМ АТФ, 2,5 мкл (около

2,5 ед. как определено Р-L-биохим. анализом) Т4 ДНК-лигазы, 2,5 мкм 10 мМ спермидина и 3 мкл воды добавляли к ДНК.

Полученную в результате реакцию лигиро55 вания инкубировали в течение ночи при 40С.

После реакции лигирования реакционную смесь корректировали до состава высокосолевого буфера (0,1 М NaCI; 0,05 М трис-HCI: рН 7,5; 10,0 мМ МдС12 и 1 мМ ДТТ). Затем в смесь добавляли около 10 мкл (100 ед.) ре29

1780541

30 стриктазы Xhol и полученную реакционную смесь инкубировали в течение 2 ч при 37 С, По окончании реакции и преципитации

Xhol-переваренной ДНК последнюю ресуспендировали и лигировали, как было описа- 5 но выше, за исключением того, что в смесь лигирования Xhol-линкеры не добавлялись, Лигированная ДНК образовывала "желаемую плазмиду рКС283РХ. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды 10 рКС283РХ представлены на фиг,1.

Пример 3, Конструирование Е. coll

К12 МО (Л ) /pKC283PX.

Е.coll К12 MO (Л ) может быть получен из Северной региональной исследовательской лаборатории влиофилизированйом виде под номером NRRL В-15993. Е. coll К12

МО (Л ) содержит ген дикого типа лямбда 20

+ р L c1-репрессора для того, чтобы транскрипция от гибридного pL-Lpp-промотра настоящего изобретения не происходилэ в клетках Е. coll К12 МО (Л ), Лиофилы восстанавливали, одиночные колонии изолировали, затем приготовляли 10 мл ночной культуры МО (il } — клеток в соответствии

+ с методикой, описанной в примере 1, за исключением того, что температура инкуби- 30 рования составляла 37 С и в среде роста ампициллин не использовали, Для инокуляции 5 мл LB-среды, содержащей также 10 MM MgSO4 и 10 мМ MgGlz, использовали 50 мкл ночной культуры. Куль- 35 туру инкубировали в течение ночи при 37 С с интенсивным встряхиванием, На следующее утро культуру разбавляли до 200 LBсредой, содержащей 10 MM MgSO4 и 10 мМ

MgCi2, Разбавленную культуру инкубирова- 40 . ли при 37 С, интенсивно встряхивая до тех пор, пока оптическая плотность при 550 нм (Astro) не достигнет величины около 0,5, которая соответствует клеточной плотности около 1х10 кл./мл. Затем культуру ох- 45

8 лаждали в течение 10 мин в ледяной бане, а клетки собирали путем центрифугирования при 4000 гза 10 мин при 4 С. Клеточный осадок ресуспендировали в 100 мл охлажденного 10 мМ Mg SO4, а затем тот же час 50 снова осаждали путем центрифугирования.

Клеточный осадок ресуспендировали в 100 мл 30 MM СэС!г и инкубировали на льду в течение 20 мин.

Эти клетки снова собирали путем цент- 55 рифугирования и ресуспендировали в 10 мл

30 мМ CaClz 1/2 мл аликвоты клеток добавляли к легированной ДНК, приготовленной в соответствии с описанием в примере 2; эту

ДНК смешивали с 30 мМ CaClz. Смесь клеток с ДНК инкубировали на льду в течение часа, затем резко повышали температуру до

42 С в течение 90 с, а затем охлаждали на льду в течение 2 мин. Клеточную ДН К-смесь разбавляли в 10 мл 1 В-среды в 125 мл флаконах и инкубировали при 37 С в течение 1 ч. 100 мкл аликвот высеивали на чашки с

Г.В-агаром, содержащим ампициллин и инкубировали при 37 С до тех пор, пока не появлялись колонии.

Эти колонии культивировали отдельно и плазмидную ДНК отдельных колоний подвергали анализу рестриктирующими ферментами и гельэлектрофорезу, Выделение плазмидной ДНК осуществляли в меньшем масштабе в соответствии с методикой, описанной в примере 1, но стадию градиента

CSCi пропускали до тех пор, пока не было проведена индентификация трансформантов Е. соИ К12 MO (Л+) /рКС283РХ. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды рКС283РХ. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды рКС283Х представлены на фиг.1.

Пример 4. Конструирование Е. coll

К12 МО (Л ) /рКС283-L, 10 мг ДНК плазмиды рКС283РХ, изготовленной в соответствии с методикой, описанной в примере 1. растворяли в 20 мкл

10-кратного высокосолевого буфера, 20 мкл

1 мг/мл БСА, 5 мкл (50 ед.) рестриктазы Bg

ill,5 мкл (-50 ед,) рестриктазы Xhol и 150 мкл воды и полученную реакционную смесь инкубировали при 37 С в течение 2 ч, Затем реакцию прекращали и после преципитации

Bg ill-Xhol-переваренной ДН.К последнюю ресуспендировали в 5 мкл ТЕ-буфера, ДНК-линкера с признаками расщепления рестриктазами Bglll u Xhoi и с концами однонитевой ДНК синтезировали и киназировэли. Линкер киназировали в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 2.

ДНК вЂ” линкер имеет следующую структуру:

5 — ОАТС А ТТА АСТCAA ТРА(АС вЂ” 3

3 - АЬ, АТТ САС ТТА САФ < . ФАУСТ - 5

Линкер, изображенный выше, синтезировали из однонитиевых деоксйолигойуклеотидов по известной специалистам методике.

Однонитиевые деоксиолигонуклеотиды могут быть синтезированы при помощи коммерчески приемлемой аппаратуры, как, например, 380А ДНК-синтезатора, маркированный

Applied Blosystem (850 Lincoln Center Drive, Foster City, СА 94404), с использованием фосфорамидэтов. Известны также и другие спо31

1780541

32 собы синтеза ДНК. Стандартный модифици рованный способ синтеза однонитевой ДНК при помощи фосфотриэфира описан в

Itakura et al., 1977, Sclerice 198:1056 и в Crea

et aI„1978, Proc. Nat, ACad. Scl USA 75;5765.

Кроме того, особенно предпочтйтельный способ синтеза ДНК описан в Asinng et al., 1983, Nucleic Acid Research ii: 3227 и Harany

et al., 1980, Methods in Enzymology 68:90.

Линкер и Bg III — Xho! переваренную плазмиду рКС283Х лигировали в соответствии с методикой, описанной в примере 2.

Лигированная ДНК образовывала целевую плазмиду рКС283-L Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды, рКС283-( представлены на рис.1 ДНК плазмиды, р КС283-L использовали для трансформа ции

Е. coll К12 МО (А ) и полученные в реэуль+ тате трансформаты Е. coll К12 МО

Я )/рКС283-L были индентифицированы в

+ соответствии с методикой, описанной в примере 3, .

Пример 5. Конструирование Е. coli

К12 МО (Х+) /рКС283-1. В.

Около 1.0 мкг плаэмидной рКС283-2

ДНК, полученной в соответствии.с методикой, описанной в примере 1, растворяли в

20 мкл 10-кратного высокосолевого буфера, 20 мкл 1 мг/мл БСА, 5 мкл -50 ед.) рестриктазы Xho I и 155 мкл HzO, полученную в результате реакционную смесь инкубировали при 37 С в течение 2 ч. Затем Xho I— переваренную плазмиду рКС283-L-ДНК осаждали из реакционной смеси путем добавления трех объемов 95 этанола и

1/10 объема ЗМ ацетата натрия, инкубиро. ванием в сухой бане из льда и зтанола в течение 5 мин и центрифугированием. Пол чбнный ДНК-осадок промывали 70 этанола, высушивали и ресуспендировали в 2 мкл 10-кратного ник-трансляционного буфера (0,5 М трис-HCI, рН 7,2, 0,1 мМ MgS04, и 1 мМ ДТТ), -1 мкл раствора 2 мМ в каждом из деоксинуклеотид-трифосфатов, 15 мкл

Hz0, 1 мкл (6 ед, как определено P-1 биохимическим анализом) фермента Кленова, который является большим фрагментом Е. coll

ДНК-полимеразы, 1, и 1 мг/мл БСА. Полученную в результате реакционную смесь инкубировали в течение 30 мин при 25 С, затем реакцию прекращали путем инкубирования этого раствора при 70 С в течение

5 мин.

BamH1 линкеры (5 — CGGGATCCCC — 3 ) киназировали"и сшивали с Xhol-переваренной Кленов-обработанной плазмидной рКС283-1 ДНК в соответствии с методикой, описанной в примере 2. После реакции ли5

15 гирования указанную ДНК переваривали . 100 единицами BamHI в течение 2 ч при

37ОС в высокосолевом буфере. После BamHI переваривания указанную ДНК изготавливали для лигирования в соответствии с методикой, описанной в примере 2.

5.9 kb фрагмента рестрикции BamHI циркуляризовали путем лигирования и трансформировали в Е,coll К12 МО(1 ) в соответствии с методикой, описанной в примерах 2 и 3. Е. coli К12 МО (Л ) /рКС283-3 В-трансформанты идентифицировали, а затем в соответствии с методикой, описанной в примере 1, изготавливали плазмидную рКС293-ZB-ДН. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды рКС283-LB представлены на фиг,1.

Пример 6. Конструирование Е, coll

К12 МО (Л. ) /р 32.

Около 10 мкг плаэмиды рКС283РХ переваривали рестриктаэой Sall в высокосолевом буфере, обрабатывали ферментом

25 Кленова и сшивали с Eco R I-линкерами (5 — CAGGAATTCCTC — 3 ) в соответствии с методикой, описанной в примере 5, с тем лишь исключением, что в данном примере используются другие исходные материалы, 30 рестриктазы и линкеры. После переваривания рестриктазой Есо R 1, в результате чего вырезалось 2,1 kb ДНК, 4,0 kb Eco R I фрагмента рестрикции циркуляризовали путем лигирования с полученной плаэмидой

35 рКС283РР. Лигированную ДНК использовали для трансформации Е. coll К12 МО (il ) в соответствии с методикой, описанной в примере 3, После идентификации Е. соИ К12 МО

4p (it )/pKC283PRS трансформантов, в соог+ ветствии с методикой, описанной в примере

3, изготавливали плазмиду pKC283P RS—

ДНК. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды рКС 283P RS представлены

45 на фиг.1 приложенных иллюстраций.

Около 10 мкг плазмиды pKC283P RS переваривали в 200 мкл высокосолевого буфера каждой из рестриктаз (около 50 ед,) Pst u

Sph !. После инкубирования реакционной

5р смеси в течение 2 ч при 37 С, реакционную смесь подвергали электрофорезу на 6 ниэкотемпературном агароэном геле (FMC

Corporation, Marine CoIloids-Division

Rockland) втечение 2-3 ч при 130 U 75мА

55 в трис-ацетатном буфере.

Укаэанный гель окрашивали в разбавленном растворе бромистого этидия и полосу ДНК, составляющую 0,85 kb Pstl-Sphl фрагмента рестрикции. который визуалировали длинноволновым УФ-излучением, вы33

1780541

34 резали из геля в небольшом сегменте. Объем сегмента определяли по весу и плотности сегмента и в пробирку. содержащую данный сегмент, добавляли такой же объем 10 мМ

Трис-HCI; рН 7,6, Затем этот сегмент расплавляли путем инкубирования при 72 С. В объеме около 1 мкл получали 1 мкг 0,85 kb

Pstl-Sphl фрагментов ресктрикции плазмиды рКС283Р RS. Аналогичным способом Pstl и Sphl — рестриктазами переваривали плазмиду рКС283 — В, полученные в результате рестрикции,.3.0 kb фрагмент изолировали при помощи электрофореза на эгарозном геле и готовили для лигирования, 0,85 kb Pstl Sphl фрагмента рестрикции плазмиды рКС283 P RS сшивали с- 3,0

kb Pstl-Sphl — фрагмента рестрикции плэзмиды рКС283 — LB в соответствии с методи- кой, описанной в примере 2. Легированная

ДНК составляла целевую плазмиду pL32, Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды pL32 представлены на фиг.1.

Плазмиду pL32 трансформировали в Е. coll

К12 МО (А+) — клетках в соответствии с методикой, описанной в примере 3. Плазмидную pL32 — ДНК получали из Е, coll К12 МО (А+)/pL32-трансформаторов в соответствии с методикой, описанной в примере 1. Ана-лиз плазмидной р 32-ДН К показал, что обработанный ферментом Кленова Sall-концы плэзмиды рКС283РХ сцеплены с более чем одним Есо R I — линкером. Присутствие более одного Есо R I-линкера нежелательно для плазмиды pL32 или производных плазмиды pL32 и может быть обнаружено по присутствию Xhol-сайта рестрикции, который образуется всегда, когда два Есо R 1линкера сшиваются вместе. Альтернативно, плазмида pL32 может быть построена путем

Sall — Есо R 1-вырезания и лигирования, выполненных в соответствии с описанием в . первом абзаце настоящего примера по отношению к плазмиде рКС283-LB.

10

Пример 7, Конструирование Е. coll

К12 МО (iL+) /pL47.

Е. соП К12 RV 308-pNM789 может быть получен из Северной Региональной исследовательской лаборатории в лиофилизированном виде под номером NRRL В-182216.

Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды рММ789 представлены на фиг,2, Плазмидную ДНК извлекали из культуры в соответствии с методикой, описан ной в п римере 1, за исключением того, что температура инкубирования составляет 37 С. 10 мкг

pNM789 суспендировали в 200 MKn PVUIIбуфере(50 мМ трис-HCI, рН 7,5; 60 мМ NaCI и 6 мМ Mg Clz). Затем добавляли 1 ед. PVUII

55 и реакционную смесь инкубировали в течение 5 мин при 37 С. Фермент инактифировали путем нагревания при 65 С в течение

10 мин. Затем. добавляли 30 мкл 10-кратного

BamH1 — буфера (200 мМ трис-HCI, рН 8; 1 M

NaCI и 70 мМ М9О2), 70 мкл Н20 и 10 ед.

BamHI и реакцию инкубировали в течение 1 ч при 37 C. После этого добавляли 5 ед. алкалин-фосфатазы и смесь инкубировали в течение 1 ч при 65 С, ДНК-фрагменты отделяли на 1 агарозном геле и один отрезанный фрагмент (фиг.3) очищали.

ДНК-линкер с тупым концом и с Bamll— концом синтезировали в соответствии с методикой, описанной в примере 4. Этот линкер (показан на фиг.3) имеет следующую структуру:

5 — CTGTG С CTTCTAG — 3

3 — GACACGGAACATCCTAG — 5

Этот линкер киназировэли и лигировали в BamHI-PVUII — переваренную плазмиду

pNM789 в соответствии с методикой, описанной в примере 2. Указанную смесь лигирования использовали для трансформации клеток Е, coll К12 RV 308 и после трансформации плазмиду выделяли по способу, описанному в примере 3. Затем отбирали несколько плазмид. которые содержали

PVUII — фрагмент (494 п,о,) и Xhoal — BamHI фрагмент (628 п.о,). Последовательность, состоящую по меньшей мере из двух этих фрагментов, определяли секвенированием от

BamHI — сайта по направлению к специфическому Smal-сайту, а затем отбирали один клон с нужной последовательностью. Эту промежуточную плазмиду обозначали плазмидой 120. Схематическое описание этой процедуры, сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды 120 представлены на фиг,3 приложенных иллюстраций, В целях изолирования ЕК-BGH-кодирующей ДН К около 10 мкг плазмиды 120 переваривали в 200 мкл высокосолевого буфера, содержащего около 50. ед. каждого из Хва

1-Baml рестриктаз. Продукты переваривания отделяли при помощи электрофореза на гарозном геле. a 0,6 kb Хва 1-BamHi-фрагмента рестрикций, кодирующих ЕК-BGH, выделяли и приготовляли для лигирования в соответствии с методикой, описанной в примере 6.

Плазмиду pL32 также переваривали рестриктазами Xhal u BamHI и выделяли 3,9

ks фрагмента рестрикции, который использовали для лигирования,, 3,9 kb XealBamHI-фрагмента рестрикции плазмиды.

pL32 лигировали с- 0.6 Xaal-BamHI-фрагмента рестрикции плазмиды 120 по способу, описанному в примере 2, и получали плазмиду pL47. Сайт рестрикции и функци35

1780541

36 ональная карта плазмиды pL47 представлены на фиг.4. Плазмиду pL47 трансформировали в Е. coll К12 МО (iL+) в соответствии с методикой, описанной в примере 3, и Е. coll

К12 MO (А+) /р! 47 — трансформанты иден- 5 тифицировали. Плазмидную pL47-ДНК получали из этих трансформа нтов в соответствии с методом, описанным в примере 1 °

Пример 8. Конструирование Е. соИ

К12 RV308/ðÐ R 12А Rl, Плазмида pP R 12 содержит с 1857-ген термовосприимчивого pL"ðåïðåññîðà. а плазмида pBL322 содержит ген, несущий устойчивость к тетраклину. Плазмида pP R

12 раскрыта и заявлена в патенте США М

4436815, выданном 13 марта 1984 r, Сайт рестрикции и функциональная карта представлены на фиг.4. 20

Около 20 мкг плазмиды pP R 12 переваривали 50 ед, рестриктазы Есо R I в 200 мкл высокосолевого буфера в течение 2 ч при

37 С. ДНК Eco R I — переваренной плазмиды

pP R I преципитировали и обрабатывали 25 ферментом Кленова по способу, описанному в примере 5. После реакции Кленова Есо

R I — переваренную, обработанную ферментом Кленова плаамидную pP R 12 — ДНК рециркулизовали путем лигирования в со- 30 ответствии с методикой, описанной в примере 2. Лигированная в ДНК, которая составляет нужную плазмиду рР R 12ДЙ I использовалась для трансформации Е. соИ

К12 RV308 по способу, описанному в приме- 35 ре 3, за исключением того, что селектирование было основано на устойчивости к тетрациклину 5 мкг/мл, а не на устойчивости к ампициллину Е. coll К12 RV308 имеется в NRRL под номером NRRL В-15624. После 40 того как трансформанты Е. coll К12 RV

308/рР R 12 Ьй I были идентифицированы, из этих трансформантов изготовляли ДНК плазмиды pP R 12 ЬЯ I по способу. описанному в примере 1.

Около 10 мкг плазмиды pP R 12 hR переваривали около 50 ед.; рестриктазы . AVai в 200 мкл среднесолевого буфера в течение 2ч при 37 С, ДНК АЧа! — переваренной плазмиды преципитировали и обраба- 50 тывали ферментом Кленова по способу, описанному в примере 5. После реакции

Кленова ДНК AVal-переваренной и обрабо- " танной ферментом Кленова плазмиды рР

R 12 М I лигировали с Eco R I-линкерами 55 (5 — CAGGAATTССТС вЂ” 3 ) по способу, описанному в примере 2. После лигирования линкера ДНК преципитировали, а затем ресуспендировали в около 200 мкл высокосолевого буфера, содержащего 50 ед. рестриктазы Есо R I. Полученную в результате реакцию инкубировали в течение 2 ч при 37 С.

После Есо R I — переваривания реакционную смесь погружали в агарозный гель, 5,1 kb

Есо R I фрагмента рестрикции очищали в соответствии с методикой, описанной в примере 2, Лигированная ДНК составляла желаемую плазмиду pP R 12А R I. ДНК плазмиды pP R 12А R I трансформировали в

Е. соИ К12 308 в соответствии с методикой, описанной в примере 3, за исключением того, что селекция проводилась на основании устойчивости к тетрациклину, а не к ампициллину. После идентификации Е. coll

К12 RV 308/pp R 12А R — трансформантов, в соответствии с процедурой описанной в примере 1, получали ДНК плазмиды рР И

12А R Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды рР R 12А R I представлены на фиг.4.

Пример 9. Конструирование Е, соИ

К12 RC308/pL110.

Около 10 мкг ДНК плазмиды pP R 12А R

l суспендировали в около 200 мкг высокосолевого буфера, содержащего около 50 ед. каждого из рестриктаз Pstl и Есо R !, и реакцию переваривания инкубировали при 370С в течение 2 ч. Затем реакционную смесь погружали в агарозный гель, а л 2,9 kb Pstl — Есо R — фрагмента рестрикции плазмиды рР R 12А R I выделяли и готовили для лиги-. рования в соответствии с методикой, описанной в примере 6.

Около 10 мкг плазмиды pL47 переваривали Pstl u BamHI рестриктазами в 200 мкл высокосолевого буфера в течение 2 ч при

37 С. Затем Psti — BamHI переаренную ДНК погружали в агарозный гель, и 2,7 кв. Pstl — BamHI — фрагмента рестрикции, содержащего начало репликации; и часть гена, несущего устойчивость к ампициллину, выделяли и готовили для лигирования в соответствии с методикой, описанной s примере 6.В вы-, деленной реакции около 10 мкг ДН К плазмиды

pL47 переваривали Есо R I и ВаеН! — рестриктазы в 200 мкл высокосолевого буфера при 37 С в течение 2 ч, а 1,03 kb Eco R I—

Ham HI — фрагмента рестрикции, соде ржащего новую транскрипционную и трансляционную активирующую последовательность и

EK-BGH-кодирующую ДНК; выделяли и подготавливали для лигирования в соответствии с методикой. описанной в примере 6. г 2 мкг из 1,0kb полученного Есо R I—

BamHI — фрагмента рестрикции использовались в конструировании плазмиды pL110, 2,7 kb Pstl — BamHl и 1,03 kb Eco R I — BamHI — фрагмента рестрикции плазмиды

1780541

pL47 лигировали с 2,9 кЬ Pstl — Есо R I— фрагмента рестрикции плазмиды pP R 12А

R 1 с целью конструирования плазмиды

pL110, а лигированную ДНК использовали для трансформации Е. coll K12 RV308 в соответствии с методикой, описанной в примерах 2 и 3, за исключением того, что выделение трансформантов проводилось на основе устойчивости к тетрациклину. а не к ампициллину.

В рестрикционном сайте и функциональных картах, приведенных на приложенных рисунках, не обозначена ЕК-BGH— кодирующая область, в которой находятся сэйты распознавания двух Pstl — плазмиды

pL 110 представлены на фиг.4.

Пример 10. Получение ДНК вируса

BK

Вирус ВК получают из Американской

Коллекции Типовых культур под депозитарным номером ATCCVR 837. Вирус доставляют в лиофилизированной формЕ и ресуспендируют в уравновешенных солях

Хэнка (Гибко, 3 175 Стэйли Роду, Грэнд

Айланд, Нью-Йорк 14072) до титра около 10 бляшкообразующих единиц (б,о.е,) на миллилитр. Хозяином для получения ДНК виру-. са ВК являются клетки человеческой первичной почки (РНЕК), которые могут быть получены иэ Флоу Лабораториез, Инк., 7655 Олд Спрингхауз Роуд, Мак Лин, Виргиния 22101, под каталожным номером 0 — 100 или из М.А. Биопродактс под каталожным номером 70 — 151, Около пяти 75 мм полистироловых колб, содержащих конфлуентные монослои около10 клеток РНЕК, используют для получения вируса. Около 1 мл вируса ВК при титре 10 б.о.е./мл прибавляют в каждую колбу, которую затем инкубируют при 37 С в течение часа, после чего прибавляли свежую кул ьтурал ьную среду (Дул ьбекко Модифицированная среда Игл, Гибко, пополненная

100 -ной сывороткой плода коровы) и зараженные клетки инкубируют при 37 С в течение

10 — 14 дней или до полного цитопатогенного эффекта вируса. Этот цитопатогенный эфект варьируется от линии клеток до линии клеток и от вируса до вируса, однако обычно состоит в том, что клетки округляют сверху. обособляются популяционно и отторгаются от культурального диска, Вирус высвобождают из клеток при ïîмощи трех циклов замораживания-оттаивания и продукты распада клеток удаляют центрифугированием при 5000 х г. Вирус в

1 л надосадочной жидкости осэждают и собирают прибавлением 100 г ПЭГ-6000, инкубированием раствора в течение 24 ч при 4ОC

20

30

40

45 осадок ДНК вируса ВК суспендируют в буфере ТЕ при концентрации 1 мгlмл. Ре5

55 и центрифугированием при 5000 х г в течение 20 мин.Осадок после центрифугирования растворяют в 0,1X SSC буфере (IXSSC

= 0,15 М NaCI и 0,015 М Na цитрат, рН 7) при концентрэии. равной одна сотая. первоначального объема. Вирусную суспенэию расслаивают на 15 мл раствора насыщенного

KBr в пробирке, которую центрифугируют при 75000 х r в течение 3 ч. После центрифугирования в растворе KBr видны — две полосы. Нижнюю полосу, которая содержит полный вирион, собирают и обессоливают на колонке Сефадекс G-50 (Сигма Кемикал

Ко., P.O. Бокс 14508. Сент-Луис, Миссури

63178), используя ТЕ (10 мМ трис-HCI; рН =

7,8 и 1 MM ЭДТА) в качестве буферного раствора для элюирования.

Додецилсульфат натрия (ДДС-Na) прибавляют в раствор очищенных вирианов, полученный из колонки, до концентрации

1. . проназу прибавляют до концентрации

100 мкг/мл и раствор инкубируют при 37 С в течение 2 ч, Затем в раствор прибавляют хлорид цезия до плотности 1,56 г/мл, после чего прибавляют бромид этидия до конечной концентрации, равной 100 мкг/мл. Раствор центрифугируют в роторе Сорвалл 865 (Дю Пон Инст. Продактс, Биомедицинское отделение, Ньютон, Коннектикут 06470) или аналогичном вертикальном роторе при

260000 х г в течение 24 ч. После центрифугирования полосу вирусной ДНК выделяют и экстрагируют 5 раз с использованием изоамилового спирта, насыщенного 100 мМ трис-H CI, рН 7,8. Затем раствор ДНК вируса

BK диализируют по буферу ТЕ до тех пор, пока отношение оптической плотности 260 нм/280 ДНК не станет равным от 1,75 до

1,90. ДНК осаждают путем приведения концентрации МэГ! к 0,15 М, прибавления двух объемов этанола, инкубирования раствора при -70"С в течение по крайней мере 2 ч и центрифугирования раствора при

12000 х г в течение 10 мин. Полученный стрикционный сайт и функциональная карта вируса ВК представлены на фиг,5.

Пример 11. Конструирование плазмид рВКпео 1 и рВКпео 2.

Клетки Е. coll К12 HB101/р4 BPV—

ММТпео получают в лиофильной форме из американской коллекции типовых культур под депозитарным номером АТСС 37224, Лиофилизировэнные клетки высеивают на чашки с L-агаром, содержащие 100 мкг/мл ампициллина, и инкубируют при 37ОС с получением одноколониевых изолятов.

1780541

10

20

30

1 л бульона 1 (10 r триптона, 10 г NaCI u

5 г дрожжевого экстракта на 1 л), содержащего 50 мкг/мл ампициллина, инкулируют колонией Е. coll К12 НВ 101/ pdBPV- MMTneo и инкубируют в воздушной качалке при 37 С до достижения О. Дмо, равной около 1 единицы спектральной поглощательной способности, при которой 150 мг хлорамфеникола прибавляют в смесь. Инкубирование продолжают в течение приблизительно 16 ч, прибавление хлорамфеникола ингибируют синтез белков и тем самым ингибирует дальнейшее деление клеток, однако позволяет продолжение плазмидной репликации, Затем из этой культуры выделяют плазмидную ДНК в соответствии с методикой примера 1 и около 1 мкг ДНК йлазмиды

pdBPVMMT neo, полученной этой методикой, суспендируют в 1 мл буфера ТЕ и сохраняют при-20 С.

Около 5 мкг. (5 мкл) ДНК плазмиды

pdBPV-MMT neo, полученной выше и 5 мкг (5 мкл) ДНК вируса ВК, полученной в примере 10, переваривают каждые отдельно при

37 С в течение 2 ч в растворе; содержащем

2 мкл 10Х буфера BamHI (1,5 M.NaCI, 60 мМ трис-НС!, рН 7,9, 60 мМ М9О2 и 1 мг/мл

БСА), 1 мкл рестрикционного фермента

Ваей! и 7 мкл воды. Реакцию останавливают путем экстракции равным объемом фенола с последующими двумя экстракциями хлороформом. Каждую BamHI переваренную ДНК затем осаждают, собирают фильтрацией и ресуспендируют в 5 мкл воды.

Около 1 мкл 10Х лигазного буфера прибавляют в смесь BamHI-переваренйой плазмидной pdBPV-MMT пео (1 мкл) и BamHI— .переваренной ВК-вирусной ДНК(1 мкл). После прибавления 1 мкл (около 1000 единиц)

ДНК вЂ” лигазы Т4 и 6 мкл воды полученную реакционную смесь инкубируют при 16 С в течение ночи. Лигированная ДНК составляет желаемые плаэмиды рВК пес 1 и рВК пео

2, которые отличаются только в отношении ориентации ДНК вируса ВК. Плазмида рВК пео 1 содержит около 2,1 kb фрагмент рестрикции.

Клетки Е, coll К12 НВ101 поставляются в лиофилизированной форме из Норверы

Риджионал Рисерч Лаборатори под депозитарным номером НВВ1 В-15626. Клетки НВ

101 К12 Е. coll культивируют; делают компетентными для трансформации и трансформируют лигированной ДНК, полученной выше, в соответствии с методикой примера

3. Трансформированные клетки. высеивают на чашки с L-агаром, содержащие 100 мкг/мл ампициллина. Трансформанты Е.

coll К12 НВ101/рВК пео 1 и Е. соИ К12/рВК пео 2 идентифицируют по их ампициллинустойчивому фенотипу и посредством анализа на рестрикционный фермент их плазмидной

ДНК. Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды рВКпео1 представлены на фиг.5 прилагаемых чертежей.

Пример 12. Конструирование плазмиды pBLcat, А. Конструирование промежуточной плазмиды pLPcat.

Вирионная ДНК аденовируса 2 (Ad2) представляет собой двухспиральную линейную молекулу размером около 35,94 ко. Поздний промотор Ad2 может быть выделен на рестрикционном фрагменте Асс!-PVUII около 0,316 kb генома Ad2, этот рестрикционный фрагмент размером около 0,32 kb соответствует последовательности между нуклеотидными положениями 5755 и 6071 генома Ad2. Для выделения желаемого рестрикционного фрагмента Accl-PVUII размером около 0,32 kb ДНК Ad2 вначале переваривают рестрикционным ферментом

Ball и выделяют рестрикционный фрагмент

Ball размером около 2,4 kb, который содержит полную последовательность рестрикционного фрагмента Accl-PVUII размером около 0,32 kb. Затем рестрикцион н ый фрагмент Ball размером около 2.4 kb переваривают Accl u PVUII с получением требуемого фрагмента.

Около 50 мкг ДН К Ad2 (поставленной иэ

В R 2 или АТСС VR-2) растворяют в 80 мкл

Ъоды и 10 мкл 10Х буфера Ва) (100 мМ трис-HCI, рН 7,6, 12-мМ М9С(2, 100 мМ

ДТФ и 1 Mr/ìë БСА). Около 10 мкл (около

20 ед.) рестрикционного фермента Ball прибавляют в раствор ДНК Ad2 и полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 4 ч, Ball-переваренную ДНК помещают на агарозный гель и подвергают электрофорезу до полного отделения рестрикционных ферментов. Визуализацию электрофорезованной ДН К осуществляют путем окрашивания геля в разбавленном растворе (0.5 мкг/мл) бромида этидия и экспонирования окрашенного геля длинноволновому ультрафиолетовому(УФ) свету, Один способ выделения ДН К из агарозы заключается в следующем. В геле впереди желаемого фрагмента небольшой продольный разрез, маленький кусок диэтиламиноэтилцеллюлозной мембраны А-45 (Шлейчер энд Шуелл, Кин.

Нью-Хемпшир 03431) помещают в каждый разрез. После дальнейшего электрофореза

ДНК нековалетно связывается с дизтиламиноэтилце люлозной мембраной. После того, как требуемый фрагмент привязался к

42

1780541

5

35

45

55 мембране, мембрану извлекают и промывают буферным раствором с низким содержанием соли (100 мМ KCI, 0,1 мМ ЭДТК и 20 мМ трис-HCI, рН 8). Затем мембрану помещают в маленькую пробирку и погружают в буферный раствор с высоким содержанием соли (1 М NaCI, 0,1 ММ ЭДТК и 20 MM трисHCI, рН 8) и затем инкубируют при 65 С в течение часа с тем, чтобы извлечь ДНК из бумаги диэтиламиноэтилцеллюлозы. После инкубирования при 65 С инкубационный буфер собирают в мембрану промывают буферным раствором с высоким содержанием соли, Высокосолевой промывочный раствор объединяют с высокосолевым инкубационным буфером.

Объем высокосолевого ДНК-раствора регулируют так, чтобы концентрация NaCI составила 0,25 М, после чего прибавляют в раствор 3 объема холодного абсолютного этанола. Полученную смесь перемешивают и помещают при -70 С на 10-20 мин отстаиваться, Затем раствор центрифугируют при 15000 об/мин, в течение 15 мин. После осуществления осаждения с тем, чтобы удалить остаточную соль осадок ДНК промывают этанолом, сушат, ресуспендируют в 20 мкл буфера ТЕ и получают около 3 мкг тре; буемого рестрикционного фрагмента Ad2.

Полученный очищенный фрагмент растворяют в 10 мкл бункера ТЕ.

Около 6 мкл воды и 2 мкл 10Х буфера

Accl (60 MM NaCI, 60 мМ трис-H CI, рН 7,5, 60 мМ MgClz, 60 мМ ЭДТК и 1 мг/мл БСА) прибавляют в раствор рестрикционного фрагмента Bal 1 размером около 2,4 kb аденовируса 2. После прибавления около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикцион ного фермента Accl к раствору ДНК реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч. После переваривания Accl ДНК собирают осаждением этанолом и ресуспендируют в 16 мкл воды и 2 мкл 10Х буфера PVUII/600 мМ

NaCI, 60 мМ трис-HCI, рН 7,5, 60 мМ МЦС12, 60 MM ДТФ и 1 мгlмл ВСА). После прибавления около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента PVUII к раствору

ДНК реакционную смесь инкубируют при

37 С в течение 2 ч.

Accl-PVUII-переваренный, растрикционный фрагмент Ad2 Ball размером около

1,4 kb нагружают на приблизительно б, ный полиакриламидный гель и подвергают электрофорезу до тех пор, пока из других продуктов переваривания не выделится рестрикционный фрагмент Acci-PVUII размером 0,32 kb; который содержит поздний промотор Ad2. Гель окрашивают бромидом этидия и наблюдают в ультрафиолетовых лучах, после чего сегмент tåëÿ, содержащий рестрикционный фрагмент Accl — PVUII размером около 0,32 kb отрезают от геля, дробят и пропитывают в течение ночи при комнатной температуре в приблизительно

250 мкл экстракционного буферного раствора (500 мМ NH40Ac, 10 мМ MgOAc, 1 мМ

ЭДТК и 0,1 ДДС Na). На следующее утро смесь центрифугируют и осадок сливают.

ДНК в надосадочной жидкости осаждают этанолом, прибавляют около 2 мкг тРНК с тем, чтобы гарантировать полное осаждение требуемого фрагмента. Около 0,2 мкг рестрикционного фрагмента Accl — PVUlf размером около 0,32 kb получают и суспендируют в 7 мкл воды.

Около 0,25 мкг (в 0,5 мкл) линкеров Ball (5 — CTATCAC — 3 ), поставляются Нью Ингланд Биолабс), которые киназированы по существу в соответствии с методикой, описанной в примере 2, прибавляют раствор рестрикционного фрагмента Accl — PVUI I размером около 0,32 kb и затем в ДНК прибавляют 1 мкл (около 100 единиц) ДНК-лигазы Т4 и 1 мкл 10Х лигазного буфера и полученную реакционную смесь инкубируют при 16 С в течение ночи. Линкеры Bell могут лигировать только к концу PVUII рестрикционного фрагмента Accl — PVUII. Секвенирование ДНК позднее выявляет, что четыре линкера ВсИ присоединены к концу

PVUll рестрикционного фрагмента Асс!—

PVUII. Эти добавочные линкеры Bell могут быть извлечены перевариванием Bell и повторным лигированием, однако добавочные линкеры BCII не были извлечены, поскольку линкеры не препятствуют должному функционированию векторов, которые составляют добавочные линкеры.

Клетки Е. coll К12 НВ101/pSV2 cat получают в лиофилизированной форме из АТСС под депозитарным номером АТСС 37155, ДНК плазмиды pSV2 cat выделяют из клеток в соответствии с методикой примера 1, Около 1 мг ДН К плазмиды pSV2 cat получают и растворяют в 1 мл буфера ТЕ, Около 3 мкг (3 мкл) ДНК плазмиды pSV2 cat прибавляют в раствор 2 мкл 10Х буфера Accl и 16 мкл воды, после чего 3 мкл (около 9 единиц) рестрикционного фермента Accl прибавляют в раствор ДНК плазмиды pSV-2 cat u полученную реакционную смесь инкубиру от при 37 С в течение 2 ч. Accl — переваренную ДНК плазмиды pSV2 — cat затем переваривают рестрикционным ферментом

Stul путем прибавления 3 мкл 10Х буфера (1

M NaCI, 10 мМ трис-H CI, рН 8, 100 мМ Mg С1г, 60 мМ ДТФ и 1 мг/мл БСА). 6 мкл воды и около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикциснного фермента Stul. Полученную реакциснную смесь инкубируют при 37 С в течение 2

43

1780541

44 ч. Реакцию оканчивают экстрагированием реакционной смеси один раз фенолом, затем дважды хлороформом. Около 0,5 мкг требуемого фрагмента получают и растворяют в 20 мкл буфера ТЕ.

Около 4 мкл Accl — Stui — переваренной

ДНК плазмиды pSV2cat смешивают с приблизительно 7 мкл рестрикционного фрагмента Accl — PVUII размером около 0,32 kb (с присоединенными линкерами Bell) аденовируса 2, после прибавления 3 мкл 10 Х лигазного буфера, 15 мкл воды и 2 мкл (около 1000 единиц) ДНК-лигазы Т4 реакционную смесь лигирования инкубируют при

16 С в течение ночи. Лигированная ДНК составляет требуемую плазмиду pLPcat, плазмиду, которая содержит поздний промотор Ad2, расположенный так, чтобы стимулировать транскрипцию и тем самым экспрессию хлорамфениколаметилтрансферазагена. Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды pLPcat представлены на фиг.6.

Лигированную ДНК используют для трансформации клеток Е. coll К12 НВ101 в соответствии с методикой примера 3.

Трансформированные клетки высеивают на

-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина; анализ на рестрикационный фермент плаэмидной ДНК используют для идентификации трансформантов Е. coll К12 НВ102/pLPcat.

ДНК плазмиды pLPcat выделяют из трансформантов для использования в последующих конструированиях по существу в соответствии с методикой выделения плазмиды, описанной в примере 1.

В. Конечное конструирование плазмиды рBLcat.

Около 88 мкг ДНК плазмиды pBI neo 1 в

50 мкл буфера TB прибавляют в 7,5 мкл 10Х буфера Acct, 30 мкл воды и 15 мкл (около 75 единиц) рестрикционного фермента Accl u полученную реакционную смесь инкубиру ют при 37 С в течение 2 ч. Accl-переваренную ДНК вируса ВК нагружают на агарозный гель, фрагмент размером около

1,4 kb, который содержит энхансер ВК, отделяют от других продуктов переваривания.

Рестрикционный фрагмент Accl размером около 1,4 kb затем выделяют в соответствии с методикой, описанной в примере 12А.

Около 5 мкг фрагмента ресуспендируют в 5 мкл 10Х буфера РЧОИ, 45 мкл воды и 5 мкл (около 25 единиц) рестрикционного фермента PVUII, полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч. РЧ0И переваренную ДНК затем выделяют и приготавливают для лигирования в соответствии с методикой примера 12А. Около 2 мкг желаемого фрагмента Accl-PVUII размером

55 ды р1 133.

А. Конструирование промежуточной плазмиды pSV2-НРС8.

Плазмида рНС7 содержит ДНК-последовательность, которая кодирует человеческий протеин С. Один литр -бульона, содержащего 15 мкг/мло тетрациклина, инокулируют культурой Е, соИ К12 RRI (рНС7) МНВК В-15926), ДНК плазмиды рНС7 выделяют и очищают в основном в соответствии с методикой примера 1. Рестрикционный сайт и функциональная карта плаэмиды около 1,28 kb получают и растворяют в 5 мкл буфера ТЕ, Около 1 мкг ДНК плазмиды pLPcat растворяют в 5 мкл 10Х буфера Accl и 40 мкл

5 воды. Около 5 мкл (около 25 единиц) рестрикцион ного фермента Accl прибавляют в раствор ДНК плазмиды pLPcat, полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С.

Accl — переваренную ДНК плэзмиды pLPcat

10 осаждают этанолом и ресуспендируют в 5 мкл 10Х буфера Stul, 40 мкл воды и 5 мкл (около 25 единиц) ресктрикционного фермента Я ul, полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч. Accl—

15 Stul — переваренную ДНК плазмиды pLPcat осаждают зтанолом несколько. раэ с тем, чтобы очистить рестрикционный фрагмент

Accl — Stul размером около 4,81 kb, который содержит Е. coll — начало репликации и позд20 ний и ромотор Ad2 вдали от других продуктов переваривания, причем рестрикционный фрагмент имеет размер около 16 пар оснований. Около 1 мкг требуемого рестрикционного фрагмента размером около 4,81 kb

25 получают и растворяют в 20 мкл буфера ТЕ.

5 мкл рестрикцион ного фрагмента Accl — Stul размером около 4,81 kb плазмиды

pLPcat прибавляют к 5 мкл рестрикционного фрагмента Accl — PVUII размером около

30 1,28 kb вируса ВК. После прибавления 3 мкл

10Х лигазного буфера 15 мкл воды и 2 мкл (около 1000 единиц) ДНК-лигазы Т4 полученную лигационную смесь инкубируют при 16 С в течение ночи. Лигированная ДНК

35 составляет требуемую плазмиду pBLcat. Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды pBLcat представлены на фиг.6.

Лигированную ДНК используют для трансформации клеток Е. coll К12 НВ101 в

40 соответствии с методикой, описанной в примере 3. Трансформанты Е.coll К12

НВ101/pBLcat идентифицируют анализом на рестрикционный фермент их плэзмидной

ДНК. ДНК плазмиды pBLcat получают для использования в последующих конструктивных в основном в соответствии с методикой примера 1.

Пример 13. Конструирование плэзми45

1780541

46 смесь охлаждают на льду, после чего прибавляют 2 мкл 0,2 М дитиотрейтола, 2,5 мкл

5 мМ АТФ и 15 единиц Т4-полинуклеотидкиназы прибавляют в реакционную смесь и перемешивают, после чего реакционную смесь инкубируют еще 30 мин при 37 С в течение 10 мин и осуществляют охлаждение реакционного продукта "йа льщ. " "

Хотя и киназированные отдельно две

0 одиночные спирали ДНК-линкера смешивают друг с другом после кийазной реакции, Для ренатурации спиралей киназную реакционную смесь инкубируют при 100 С в течение 10 мин в водяной б не, содержащей около t50 мл воды. После инкубации водяную баню отключают и охлаждают до комнатной температуры, что занимает около 3 ч.

Водяную баню, все еще содержащую пробирку кина=ированной ДНК, затем инкубируют при 4 С в течение ночи. Этот процесс позволяет денатурировать одиночные спирали. Построенный линкер имеет следующую структуру

5 — AG CTT7GATCA9 — 3

3 — AACTAGTCCACG — 5

Линкер сохраняют при -20 С до его использования.

Около 8 мкг фрагмента Bant размером около 1,25 kb прибавляют в реакционную смесь и смешивают с 50 мкл линкера (около

500 пикомолей), 1 мкл ДНК вЂ” лигазы Т4 (около 500 единиц), 10 мкл 10Х лигазного буфера и 19 мкл воды и полученную лигационную смесь инкубируют при 4 С в течение ночи.

Реакцию лигирования прекращают путем

10-минутного ийкубирования при 65 С.

ДНК осаждают путем прибавления аОАс до конечной концентрацйи 0,3М прибавления

2 объемов этанола, охлаждения в ванне с сухим льдом и этанолом и центрифугирования раствора, Осадок ДНК растворяют в 10 мкл 10Х реакционного буфера Apat (60 мМ NaCI, 60 мМ трис-HCI, рН 74, 60 мМ MgCtz и 60 мМ

2-меркаптоэтанола), 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Apal и 85 мкл воды и реакциойную"смесь й0мещают при

37 С на 2 ч. Затем реакцию останавливают и ДНК осаждают, как описано выше. Осадок

ДНК после центрифугирования растворяют в 10 мкл 10Х реакционного буферного раствора Hindltl, 5 мкл (около 50 единиц) ресктрикционного фермента Hindlll и 85 мкл воды, реакционную Смесь помещают при

37 С на 2 ч, После переваривания Hindtll реакционную смесь нагружают на 3,5 ный полиакриламидный гель и желаемый рестрикционный фрагмент Hindi ll-Ара! размером около 1,23 kb выделяют в основном в соответствии с методикой, описанной в прирНС7 представлены на фиг.7, Около 1 мг

ДНК плазмиды рНС7 получают этой методикой, суспендируют в 1 мл буфера ТЕ и сохраняют при -20 С.

50 мкл ДНК плазмиды рНС7 смешивают 5 с 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Bant, 10 мкл 10Х реакционного буфера Banl (1,5 М NaCI, 60 мМ трис-HCI, рН

7,9, 60 MM MgCI2 и 1 мг/мл ВСА) и 35 мкл воды и инкубируют до завершения перева- 1 ривания. Banl-переваренную ДНК плазмиды рНС7 затем подвергают электрофорезу на 3,5 -ном полиакриламидном геле (29:1, экрилэмид: бисакриламид) до тех пор, пока рестрикционный фрагмент Banl размером 15 около 1,25 kb не отделится от других продуктов переваривания, Область геля, содержащую рестрикционный фрагмент Banl размером около 1,25

kb, отрезают от геля, помещают в acnai а- 20 тельную пробирку и разбивают на маленькие кусочки. 1 мл экстракционного буфера (500 мМ NH40Ac. 10 мМ MgOAc, 1 мМ ЭДТК, 1% ДДС Na и 10 мг/мл тРНК) прибавляют в пробирку, содержащую фрагменты, и про- 25 бирку помещают при 37 С на ночь. Центрифугирование используют для осаждения продуктов распада клеток и надосадочную. жидкость переносят в новую пробирку, Продукты распада промывают один раз 200 мкл 30 экстракционного. буфера, промытую надосадочную жидкость обьединяют с первым надосадочным слоем от ночной экстракции.

После пропускания надосадочного слоя че- рез пробку из стекловаты прибавляют два 35 обьема этанола и смешивают с надосадочной жидкостью, Полученный раствор помещают в ванну с сухим льдом и этанолом нэ

10 мин, после чего ДНК осаждают центрифугировэнием;- - -- -- — — - - -- 40

Приблизительно 8 мкг рестрикционного фрагмента Banl размером около 1,25 kb получают этой методикой, Очищенный фрагмент суспендируют в 10 мкл буфера ТЕ и сохраняют при -20 С, Рестрикционный 45 фрагмент Banl необходимо модифицировать путем прибавления линкера с тем, чтобы построить плэзмиду pSV2-НРС8, 500 пикомолей каждого одиночной спирали линкера киназируют в 20 мкл реакци- 50 онного буферного раствора, который содержит в 20 мкл реакционного буферного раствора, который содержит 15 единиц (около 0,5 мкл) полинуклеотид — киназы Т4, 2 мкл

10Х лигазного буфера, 10 мкл из 500 мкМ 55

АТФ и 7,5 мкл воды. Киназную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 30 мин и реакцию завершают инкубированием при 100 С в течение 10 мин. Чтобы гаранти.ровать полную кинацию, реакционную

1780541

45

55 мере 12А. Приблизительно 5 мкг требуемого фрагмента получают, суспендируют в 10 мкл буфера ТЕ и сохраняют при -20 С, 50 мкл ДНК плазмиды рНС7 смешивают с 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Pstl, 10 мкл 10Х реакционного буфера Pstl (1,0 М NaCI, 100 мМ трис-HCI, рН 7,5, 100 мМ MgCIz и 1 мгlмл БСА) и 35 мкл воды и инкубируют при 37 С в течение

2 ч. Рзт1-переваренную ДНК плазмиды рН

С7 затем подвергают электрофорезу на 3,5 ном полиакриламидном геле, желаемый фрагмент размером около 0,88 kb очищают в основном в соответствии с методикой, описанной выше. Приблизительно 5 мкг желаемого фрагмента получают, суспендируют в 10 мкл буфера ТЕ и сохраняют при -20 С.

Около 5 мкг фрагмента Pstl размером около 0,88 kb прибавляют и смешивают с 50 мкл следующего линкера, который конструируют в автоматизированном ДНК-синтезаторе:

5 — GTGATCAA — 3

3 — ACGTCAGTACTTCTAG — 5

Около 1 мкл ДНК-лигазы Т4 (около 10 единиц), 10 мкл 10Х лигазного буфера и 29 мкл воды прибавляют к смеси ДНК и полученную лигазную реакционную смесь инкубируют при 4 С в течение ночи.

Реакцию лигирования прекращают пу тем 10-минутного инкубирования при 65 С.

После осаждения лигирован ной ДН К осадок

ДНК растворяют в 10 мкл 10Х реакционного буфера Apal, 5 мкл (около 50 единиц) рестрикцион ного фермента Apal и 85 мкл воды и реакционную смесь помещают при 37 С на 2 ч. Затем реакцию прекращают и ДНК осаждают еще раз. Осадок ДНК растворяют в 10 мкл 10Х реакционного буфера Bglll (1

М NaCI, 100 MM трис-HCI, рН 7,4, 100 мМ

MgClz, 100 мМ 2-меркаптоэтанола и 1 мг/мл

БСА), 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционого фермента Bglll и 85 мкл воды, реакционную смесь оставляют при 37 С на 2 ч. После переваривания Bglll реакционную смесь нагружают на 3,5%-ный полиакриламидный гель и желаемый рестрикционный фрагмент

Apal-Bglll размером около 0,19 kb выделяют в

- основном в соответствии с методикой, описанной выше. Приблизительно 1 мкг желаемого фрагмента получают, сусиендируют в 10 мкл буфера ТЕ и сохраняют при -20 С.

Приблизительно 10 мкг ДНК плазмиды

pSV2gpt (АТСС 37145) растворяют в 10 мкл

10Х реакционного буфера Hindlll, 5 мкл (около 50 единиц), рестрикционного фермента Hlndlll и 85 мкл воды и реакционную смесь помещают при 37 С на 2 ч. Затем реакционную смесь доводят до 0,25 М в

NaOAC, после прибавления двух объемов

40 этанола и инкубирования в ванне в сухим льдом и этанолом ДНК осаждают центрифугированием, Осадок ДНК растворяют в 10 мкл 10Х буфера Bglll, 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Bglll и 85 мкл воды, реакционную смесь помещают при 37 С на 2 ч. После переваривания В91И реакционную смесь нагружают на 1 -ный агарозный гель и фрагменты отделяют электрофорезом. Гель окрашивают этидия бромидом и наблюдают при УФ-свете и полосу, содержащую желаемый фрагмент Hindlll—

Bglll размером около. 5,1 kb, отрезают от геля и помещают в пробирку для диализа, электрофорез осуществляют до тех пор, пока ДНК не отсоединится от агарозы. Буферный раствор, содержащий ДНК из пробирки для диализа, экстрагируют фенолом и

СНС!з, после чего ДНК осаждает. Осадок ресуспендируют в 10 мкл буфера TF и он составляет около 5 мкг желаемого рестрикционного фрагмента Hindi II — Вglll размером около 5,1 kb плазмиды pSV2gpt.

2 мкл рестрикционного фрагмента

HlndlIl-Ара! размером около 1,23 кл. 3 мкл фрагмента Apal-Bglll размером около 0,19

kb и 2 мкл фрагмента Hindlll-Bglll размером около 5,1 kb смешивают и затем инкубируют с 10 мкл 10Х лигазного буфера, 1 мкл ДНКлигазы Т4 (около 500 единиц) и 82 мкл воды при 16 С в течение ночи. Лигированная ДН К составляет желаемую плазмиду pSV2-Í ÐÑÇ.

Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды pSV2-ÍÐÑ8 представлены на фиг.7.

Клетки Е, coll К12 RRI (ММВБ В-15210) делают компетентными за трансформацию в основном в соответствии с методикой, описанной в.примере 3, Полученную лигированную ДНК используютдля трансформации клеток, аликвоты трансформационной смеси высеивают на чашки с L-агаром, содержащие 100 мкг/мл ампициллина. Затем чашки инкубируют при 37 С, Трансформанты Е. coll К12 RRI/pSV2-НРС8 оценивают анализом на рестрикционный фермент плазмидной ДНК.

В. Окончательное конструирование плазмиды рИ33.

50 мкг плазмиды pSV2-HPC8 растворяют в 10 мкл 10Х реакционного буфера

Hindlll, 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Hlndlll и 85 мкл воды, реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч. После переваривания Htndlll

ДНК осаждают и осадок ДНК растворяют в

10 мкл 10Х реакционного буфера Sall (1,5 М

NaCl, 60 мМ трис-KCI, рН 7,9 мМ М9С!2, 60 мМ 2-меркаптоэтанола и 1 мг/мл БСА). 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермен49

1780541

50 та Sall и 85 мкл во ы, Пол чен д, у ную реакци- миды pSV2- Р-глобин смешивают и лигиронную смесь Sall инк би ют в т ч 2 у ру е ение 2 ч ют в основном в соответствии с методикой при 37 С, Hindllt — Sall — и — ереваренную примера 13А, Лигированная ДНК составляплазмиду pSV2-ÍÐÑ8 нагружают на 3,5 - етжелаемуюплазмидур! 133. Рестрикционный полиакриламидный гель и подвергают 5 ныйсайтифункциональнаякартаплазмиды электрофорезу до тех пор, пока желаемый р!133 представлены на фиг.7. Требуемые рестрикционный фрагмент Hlndlll — Salt трансформанты E. cot! К12 RRI/р 133 конст размером около 0,29 kb не отделится отдру- руируют в основном в соответствии с метогих реакционных продуктов, Требуемый дикой примера 16А за исключением того, фрагмент выделяют из геля, при этом пол- 10 что вместо плазмиды SV2-НРС8 у кг фрагмента и суспендиру- pL133 используют в качестве трансформичают около 2 мкг ют в 10 мкл буфера ТЕ, рующей ДНК.

50 мкг плазмиды pSV2-НРС8 растворя- Пример 14. Конструирование плазмиют в 10 мкл 10Х реакционного буфера Bglltl, ды pLPC, 5 мкл (50 единиц) рестрикционного фермен- 15 Около 20 мкг плазмиды pBLcat раствота ВоИ! и 85 мкл воды, реакционную смесь ряют в 10 мкл 10Х буфера Н!пбИ! и 80 мкл инкубируют при 37 С в течение 2 ч. После воды. Около 10 мкл (около 100 единиц) репереваривания Bglll ДНК осаждают и оса- . стрикционного фермента Hlndtll прибавлядокДНК растворяютв10мкл10Хреакцион- ют в раствор ДНК пл BL уфера а, мкл (около 50 единиц) 20 полученную реакционную смесь инкубирурестрикционного фермента Salt Ь 85 мкл ют при 37 С в течение 2 ч. Hindi!i-переваводы. Полученную реакционную смесь ЯаИ ренную ДНК плазмиды pBLcat нагружают инкубируют в течение 2 ч при 37oC. Sall — на агарозный гель и подвергаютэлектрофоBglll — переваренную плазмиду pSV2-ÍÐÑ8 резу до выселения рестрикционного фрагнагружают на 3,5 -ный полиакриламидный 25 мента Hindll t разме м 0 87 kb гель и по ве га двергают электрофорезу до тех который содержит энхансер ВК и поздний пор, пока желаемый рестрикционный фраг- промотор Ad2 затем мент SaÈ вЂ” В !II азме ом атем данныи фрагмент вы.А мент а — g размером около 1,15 kb не деляют и подготавливают для лигирования отделится от других реакционных продук- в основном в соответствии с методикой притов. Рестрикционный фрагмент Salt — Bglll 30 мера 12А, размером около 1,15 kb выделяют из геля

1 коло мкг желаемого фрагмента полпри этом получают около 8 мкг фрагмента и учают и растворяют в 5 мкл буфера ТЕ.

Пили

Около l,5 мкг ДНК плазмиды L133 р pacSV2- -гл н р б зительнс 10 мкг ДНК плазмиды творяют в 2 мкл 10Х буфера Н!пбИ! 16 р -,о -глобина (NRRL В-15928) растворя- 35 воды, Около 1 мкл (около 10 единиц) реют в 10 мкл 10Х реакционного буфера стрикционного фермента Hlndllt прибавляют

Н!пбИ!, 5 мкл (около 50 единиц) рестрикци- в раствор ДНК, полученную реакционную онного фермента Hind!It и 85 мкл воды и смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч. реакционную смесь оставляют при 37оС на Затем ДНК разбавляют до 100 мкл б ф м

2 ч. Затем к ля т до мкл уфером

02 М реа ционную смесь доводят до 40 ТЕ и обрабатывают телячьекишеч, 5 в NaOAc и после прибавления двух ной фосфатазой в основном в соответствии с объемов этанола и инкубации в ванне с су- методикой примера 7, Hindllt-перева енн ю хим льдам — этанолом ДНК осаждают цент.-. ДНК плазмиды pL133 экстрагируют дважды рифугированием. Hindlll — переваренную фенолом и один раз хлороформом с ду pSV - 8-глобин растворяют в 10 45 ют этанолом и ресуспендируют в 10 мкл — мом, осаждамкл 10Х буфера Bgtll, 5 мкл (около 50 еди- буфера ТЕ. ниц) рестрикционного фермента Bgllt и 85 Около 5 мкл рестрикционного фрагменмкл воды и реакционную смесь оставляют та Hindttl размером около0,87 КЬ плазмиды на2чпри37 С. После Bglll — переваривания pBLcat прибавляют к 1,5 мкл Hindlll-перереакционную смесь нагружают на 1 -ный 50 варенной плазмиды р! 133, а затем 1 мкл агарозный гель и фрагмент Hindlll — Bgllt 10Х лигазного буферА, 1 мкл (около 1000 размером около 4,2 kb выделяют из геля, единиц) ДНК-лигазы Т4 и 1 5 мкл воды припри этом получают около 5 мкг желаемого бавляют к раствору ДНК, полученную реакфрагмента и суспендируют в 10 мкл буфер- ционную смесь инкубируют в течение ночи

55 при 16 С, Лигированная ДНК составляет

2 мкл фрагмента Hind!I t-Sall размером желаемую плазмиду р! РС. Рестрикционный около 0,29 kb плазмиды pSV2 — НРС8, 2 мкл сайт и функциональная карта плазмиды фрагмента Sali — Bgltl размером около 1,15 pLPC представлены на фиг.8.

kb плазмиды pSV2 — НРС8 и 2 мкл фрагмента Лигированную ДНК используют для

Hindlll — Bgll! размером около 4,2 kb плаз- трансформации Е. cali К12 НВ101 в основ52

1780541

51 ном в соответствии с методикой, описанной в примере 3. Трансформированные клетки высевают íà L"àãàð, содержащий амипициллин и плазмидную ДНК ампициллин-устойчивых трансформантов, исследуют анализом нерестрикционный фермент с тем, чтобы идентифицировать трансформанты Е. coll К12

Н В101/ — pLPC. Рестрикционный фрагмент

Himdlll размером около 0,87 kb, кодирующий энхансер ВК и поздний промотор Ad2 можно инсерцировать в Hindi l I-переваренную плазмиду pL133 в одной или двух ориентациях, единственная конструкция, которая содержит фрагмент Ndel-Stul размером около 1 kb, и приводит к получению плазмид pLPC, Пример 15, Конструирование плэзмид

pLPChyg и pLPChyg2.

Клетки Е. соИ К12 RRI/ðS×2hóg получают из Норзерн Риджионал Рисерч Лаборатори под депозитарным номером В-18039.

ДНК плазмиды pSV2hyg получают из клеток в основном в соответствии с методикой примера 1, Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды pSV2hyg представлены на фиг.8.

Около 10 мкг (в 10 мкл буфера ТЕ) плазмиды pSV2hyg прибавляют в 2 мкл буфера

BamHI и б мкл воды. Около 2 мкл (окола 20 единиц) рестрикционного фермента ВатН1 прибавляют в раствор ДНК и полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч.

Реакционную смесь экстрагируют вначале фенолом и затем дважды хлороформом, BamHI2 переваренную ДНК плазмиды

pSV2hyg нагружают на агарозный гель и гигромицин-устойчивый генсодержащий рестрикционный фрагмент размером около

2,5 kb выделяют в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 12А, Около 5 мкл 10Х буферйого раствора

Кленова (0,2 мМ в каждой из четырех дНТФ, 0,5 трис-HCI, рН 7,8, 50 мМ MgCIz, 0,1 M

2-меркаптоэтанолэ и 100 мкг/мл ВСА) и 35 мкл воды прибавляют к раствору BamHI-переваренной ДНК плазмиды pSV2hyg, затем около 25 единиц фермента Кленова (около 5 мкл, поставляемых на рынок фирмой в RL) прибавляют к смеси ДНК, полученную реакционную смесь инкубируют в течение 30 мин при 16 С. Обработанную ферментом

Кленова BamH1 — переваренную ДН К плазмиды pSV2hyg экстрагируют один раз фенолом и один раз хлороформом и затем осаждают этанолом, Около 2 мкг желаемого фрагмента получают и суспендируют в 5 мкл буфера ТЕ.

Около 10 мкг (10 мкл) ДНК плазмиды

pLPC прибавляли к 2 мкл 10Х буфера Stul u

6 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционнога фермента Stul прибавляют к раствору ДНК, полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч, St

5 осаждают этанолом, собирают центрифугированием ресуспендируют в 2 мкл 10Х буфера Nde 1 (1,5 M NaCI, 0,2 М трис-HCI, рН 7,8, 70 мМ MgCI2, 60 MM 2-меркаптоэтанола и 1 мг/мл БСА) и 16 мкл воды. Около 2 мкл

10 (окало 10 единиц) рестрикционного фермента Ndt 1 прибавляют к раствору Stul-переваренной ДНК и полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч, Ndel u Stul переваренную ДНК плазми15 ды pLPC осаждают этанолом, собирают центрифугированием и ресуспендируют в 5 мкл

10Х буфера Кленова и 40 мкл воды, Около 5 мкл (около 25 единиц) фермента Кленова прибавляют к раствору и ДНК и полученную

20 реакционную смесь инкубируют при 16 С в течение 30 мин, После завершения реакции

Кленова реакционную смесь нагружают на агаразный гель и рестрикцианный фрагмент размером около 5,82 kb Ndel-Stul выделяют

25 из геля. Около 5 мкг желаемого фрагмента получают и суспендируют в 5 мкл буфера TE.

Около 2 мкл Кленов-обработанного рестрикцианного фрагмента BamHI размером около 2,5 kb плазмиды рЯЧ2 пуц смешивают

30 с приблизительно 1 мкл Кленов-обработанного рестрикционнаго фрагмента Nde1Stu1 размерам около 5,82 kb плазмиды

pLPC, в раствор ДНК прибавляют около 3 мкл 10Х лигазного буфера, 2 мкл Т4 ДНК-ли35 газы (около 1000 единиц), 1 мкл Т4 PHK лигазы (около 1 единицы) и 14 мкл воды.

Полученную реакционную смесь инкубируют при 16 С в течение ночи. Лигированнэя

ДН К составляет желаемые плэзмиды

40 pLPChyg1 и pLPChyg2, которые отличаются друг от друга только в отношении ориентации рестрикционного фрагмента BamHI, обработанного ферментом Кленова, размером около2,5kb, плазмиды pSV2hyg. Рестрикци45 онный сайт и функциональная карта плазмиды pLPChyg1 представлены на фиг,8.

Лигированную ДНК используют для трансформации Е. cali К12 НВ101 в основном в соответствии с методикой примера 3. Желаемые

50 трансформанты Е. coll К12 НВ101/pLPChyg1 и

E. coll К12 НВ-101/pLPChyg2 высевэют íà Lагар, содержащий ампициллин, и идентифицируют анализом на рестрикциан ный фермент их плазмиднай ДН К.

55 Пример16. Конструирование плазмиды pBW32.

А, Конструирование промежуточной плазмиды рТРА103.

Плазмида рТРА102 содержит кодирующую последовательность тканевого актива1780541

53

54 тора плазминогена (АПТ) человека. Плазмиду рТРА102 можно выделить из Е. coll К12

ММ294/рТРА102, штамма, поставляемого

Норзерн Риджионал Рисерч Лаборатори под депозитарным номером ЙЯЯ! В15834. Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды рТРА102 представлены на фиг.9. ДНК плазмиды рТРА102 выделяют из Е. coll К12

ММ294/рТРА102 в основном в соответствии с методикой примера 1.

Около 5 мкг плазмиды рТРА102 (в приблизительно 50 мкл буфера ТЕ) прибавляют к 10 мкл 10Х буфера Tthllll (0,5 М NaCI, 80 мМ трис-HCI, рН 7,4. 80 мМ М9С12, 80 мМ

2-меркаптоэтанола и 1 мг/мл 6CA) и 80 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Tthllll прибавляют к раствору ДН К и полученную реакционную смесь инкубируют при 65 С в течение 2 ч. Реакционную смесь нагружают на агарозный гель, рестрикционный фрагмент Tthl Ill размером около 4,4 kb, который содержит последовательность, кодирующую АПТ, выделяют из геля. Другие продукты переваривания, рестрикционные фрагменты размером около

3,1 kb и 0,5 kb удаляют. Около 10 мкг желаемого рестрикционного фрагмента Tthllll размером около 4,4 kb получают и суспендируют в 10 мкл буфера ТЕ.

Около 5 мкл 10Х буфера Кленова и 30 мкл воды прибавляют к раствору, содержащему рестрикционный фрагмент Tthllll размером около 4,4 kb, и после прибавления около 5 мкл фермента Кленова (около 5 единиц) реакционную смесь инкубируют при

16 С в течение 30 мин. После завершения реакции Кленова ДН К осаждают этанолом и ресуспендируют в 3 мкл 10Х лигазного буфера и 14 мкл воды.

Линкеры BamHI (Нью-Инглэнд иолабо), имеющие следующую последовательность

5 — CGGATCCG — 3

3 — (э ССТА(эб С вЂ” 5 киназируют и подготавливают для лигирования следующим образом. 4 мкл линкера (около 2 мкг) растворяют в 20,15 мкл воды и

5 мкл 10Х киназного буфера (500 мМ трисHCI, рН 7,6 и 100 мМ MgClz), инкубируют при 90оС в течение 2 мин и затем охлаждают до комнатной температуры. 5 мкл у -Р—

АТФ (около 20 мкС), 2,5 мкл 1М ДТТ и 5 мкл полинуклеотидкиназы (около 10 единиц) прибавляют в смесь, которую затем инкубируют при 37 С в течение 30 мин, Затем прибавляют 3,35 мкл 0,01 М АТФ и 5 мкл киназы и реакцию продолжают еще 30 мин при

37 С. Радиоактивная АТФ помогает в определении лигированы или нет линкеры к искомой ДНК.

Около 10 мкл киназированных линкеров

BamHI прибавляют к раствору рестрикционного фрагмента Tthllll размером около 4,4

kb и после прибавления 2 мкл Т4 ДНК-лига5 зы (около 1000 единиц) и 1 мкл Т4 ДНК-лигазы (около 2 единиц) смесь реакции лигирования инкубируют при 4 С в течение ночи. Лигированную ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в 5 мкл 10Х буфера

10 Hlndlll и 40 мкл воды. Около 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Hlndlll прибавляют к раствору ДНК и полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч.

15 Hlndlll-переваренную ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют 10 мкл 10Х буфера BamHI и 90 мкл воды. Около 10 мкл (около 100 единиц) рестрикционного фермента BamHI прибавляют к раствору

20 ДНК и полученную реакционную смесь инкубируют в течение 2 ч при 37 С. После

BamHl-перевариванйя реакционную смесь нагружаЮ г на ага"розйьУй гель и рестрикционный фрагмент BamHI-Hindlll

25 размером около 2 kb выделяют из геля. Около 4 мкг желаемого фрагмента получают и суспендйруют в 5 мкл буфера ТЕ, 30 Для построения плазмиды рТРА103 рестрикционный фрагмент BamHI-H Indi ll раз. мером около 2 kb, полученный из плазмиды рТРА102, инсерцируют в BamHI — Н1псИ11-переваренную плазмиду pRC. Плаэмиду pRC

35 конструируют путем инсерции рестрикционного фрагмента Есо R I — Clal размером около 288 пар оснований, который содержит последовательности промотора и оператора(trpPO) оперона trp Е. coll Ь Есо R 1-Сlаl40 переваренную К12Й100/рКС7 плазмиду

РКС7, Плазмида рКС7 может быть получена под депозитарным номером АТСС37084;

Рестрикционный фрагмент из Американской коллекции Типовых культур в Е. coll Eco

45 R I — Clal размером около 288 пар оснований, который содержит trp PO, может быть выделен из плазмиды рТРА102, которую можно выделить из Е. со11 К12 MM294/рТРА102 (МВВ1 В-15834). ДНК плаэмид рКС7 и

50 рТРА102 могут быть получены из упомянутых клеточных линий в основном в соответствии с методикой примера 1. Этот рестрикционный фрагмент Есо R 1 — Cfal размером около 0,29 kb плазмиды рТРА102 со55 держит последовательность активации транскрипции и большую часть последова-. тельности активации трансляции тена trp Е.

coll и имеет следующую последовательность.

56

1780541

БО БО sa ° о sa

5 -ААТТСАСССТ CTCGIGIIAT CCTCGGICCI CGCTAGCGIG CCGACGCGCA

llllll ll1lllllll llllllllll llllllllll llllllllll

3 -CTCCCA САССАСААТА CCAQCCACCA СССАТСССАС GGCTCCGCGT

СО 1О ао оо 100

ТСТССЛСТСС ЯСС ТССЯСС БАТССТТСТС СССТСЯСССЯ СССЯЯТССТЛ

IIIIIIIIII IIIII IIIII 1111111111 IIIIIIIIII IIIIIIIIII

АСАССТСАСС TCCCACCTCC TTACGAACAC СССАСТСССТ CCGITACCCT

Б

22O 22О 1sa 1аа Б 50

ЛССТСТССТА TCGCTGTCCA ССТССТАТЛЯ TCACCGCATA АТТССЛСТСС

1lllllllll lllllllll1 llllllllll llllllllll IlllllllIl

ТССАСАССАТ ЛСССЛСАССТ CCACCATAIT ACTCGCCIAT ТААССТСАСС

ББО 110 гао 150 200

CTCAACCCGC ACTCCCGTTC CGCATAATGT TTTTTGCTCC CACATCATAA

IIIIIIIIII IIIIIIIIII IIII111I1I IIIIIIIIII IIIIIIIIII

CAGIICCGCC TGACCCCAAG GCCTATTACA ЯЯЯЛЯССЯСС CTGTAGTATT гго ггЬ sso 240 220

CCCTTCCCCC AAATATTCTG AAATCAGCTC TTGACAATTA АТСЯТССЯЛС

1Il1111III 1111111111 IIIIIIIIII 1111111111 1111111111

СССАЯССССС TTTATAACAC ТТТАСТССЯС ААСТСТТААТ TAGTACCTTG

2ОО гго 2ао 221

TAGTTAACTA GTACCCAAGT ТСТССТАЯЯЯ ЯСССТЯТ-3

11!1111111 IIIIIIIIII IIIIIIIIII 1111111

ЯТСААТТСАТ СЯТСССТТСЯ AGAGCAIIIT TCCCATAGC-5 15

Таким образом, для построения плазмиды PRC около 2 мкг плазмиды рКС7 в 10 мкл буфера ТЕ прибавляют к 2 мкл 10Х буфера

Clal (0,5 M NaCI, 60 мМ трис-Н С1, рН 7,9, 60

MM MgCI2 и 1 мг/мл БСА) и 6 мкл воды. 20

Около 3 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента Clal прибавляют к раствору

ДНК плазмиды рКС7, полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч. Clai-переваренную ДНК плазмиды 25 рКС7 осаждают этанолом и ресуспендируют в 2 мкл 10Х буфера Есо R I и 16 мкл воды, Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента Есо R I прибавляют к раствору Gal-переваренной ДНК плазмиды рКС7 30 и полученную реакционную смесь инкубируют в течение 2 ч при 37 С, Есо R I-Clal-переваренную ДНК плазмиды рКС7 экстрагируют один раз фенолом и затем дважды хлороформом. Затем ДНК 35 осаждают этанолом и ресуспендируют в 3 мкл 10Х лигазного буфера и 20 мкл воды, Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды рКС7 могут быть получены из работы Маниатиса и др„Молекулярное 40 клонирование (Коулд Спринг Харбор Лаборатори, 1982, с.8).

Около 20 мкг плазмиды рТРА102 в приблизительно 20 мкл буфера TE прибавляют к 10 мкл 10Х буфера Cial и 60 мкл воды. 45 .Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Clal прибавляют к раствору ДНК плазмиды рТРА102, полученную реакционную смесь инкубируют при 37оС в течение 2 ч. Cial-переваренную ДНК плаз- 50 миды рТРА102 осаждают этанолом и ресус- . пендируют в 10 мкл 10Х буфера Есо R I и 80 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Есо R I прибавляют к раствору Clal-переваренной ДНК плаз- 55 миды рТРА102 и полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч, Есо R I-Clal-переваренную ДНК плазмиды рТРА102 экстрагируют один раз фенолом, нагружают на 7 g,-ный полиакриламидный гель и подвергают электрофорезу до тех пор, пока от других продуктов переваривания не отделится рестрикционный фрагмент Есо R I— - Clal размером около 288 пар оснований, который содержит trpPo. Данный рестрикционный фрагмент Есо R I — Clal размером около 288 пар оснований выделяют из геля; около 1 мкг желаемого фрагмента получают, суспендируют в 5 мкл буфера ТЕ и прибавляют к раствору Fco RI Clal-переваренной ДНК плазмиды рКС7, полученной, как описано выше, Около 2 мкл (около 1000 единиц) ДНКлигазы Т4 затем прибавляют к смеси ДНК, полученную реакционную смесь для лигирования инкубируют при 16 С в течение 2 ч, Лигированная ДНК составляет требуемую

ДНК плазмиды pRC.

Лигированную ДН К используют для трансформации компетентных клеток НВ101 К12 Е, coil в основном B соответствии с методикой примера 3. Трансформированные клетки высевают на L-arap, содер>кащий 100 мкгlмл ампициллина, и ампициллинустойчивые трансформанты подвергают скринингу посредством анализа на рестрикционный фермент их плазмидной ДНК с тем, чтобы идентифицировать желаемые колонки E. coll К12 НВ101/pRC. ДНК плазмиды pRC получают из трансформантов Е. соИ К12 HB101/pRC в основном в соответствии с методикой примера 1, Около 2 мкг ДНК плазмиды pRC в 2 мкл буфера ТВ прибавляют к 2 мкл 10Х буфера

Hindlll и 16 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента Hindlll прибавляют к раствору ДНК плазмиды pRC, полученную реакционную смесь икубируют при 37 С в течение 2 ч. Hindlll-переваренну1о ДН К плазмиды PRC осаждают этанолом и ресуспендируют в 2 мкл 10Х буфера

BamHI и 16 мкл воды, Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента BamHI прибавляют к раствору Hindlll-переваренной ДНК плазмиды pRC, полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч.

BamHI — Hindlll-переваренную ДН К плазмиды pRC экстрагируют один раз фенолом и затем два раза хлороформом, ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в 3 мкл 10Х лигазного буфера и 20 мкл воды, Приблизительно 4 мкг (в приблизительно 5 мкл буфера ТЕ) рестрикционного фрагмента Hindlil-BamHi размером около 2 kb плазмиды рТРА102 затем прибавляют к раствору BamHI — Hindlllпереваренной ДНК плазмиды pRC. Около 2 мкл (около 100 единиц) Т4 ДНК-лигазы прибавляют к смеси ДНК, полученную реакциО онную смесь инкубируют при 16 С в течение

57

1780541

2 ч, Лигированная ДНК составляет желае- ДНК плазмиды рТРА103, полученную реакмую Д К плазмиды рТРА103. ционную смесь инкубируют при 16 С в течеДля уменьшения количества нежела- ние 2 ч, Обработанную ферментом Кленова тельных трансформантов лигированную Bglll-переваренную ДНКплазмиды рТРА103

ДН переваривают рестрикционным фер- 5 осаждают этанолом и ресуспендируют в 3 мкл ментом Ncoi, который отрезает плазмиду 10Хлигазногобуфераи22мкл воды.

pR, но не плазмиду рТРА103. Таким обра- Около 2 мкл (0,2 мкг) некиназированных зомперевариваниелигированнойДНКфер- линкеров (Нью Инглэнд Биолабс) последоментом Ncol, уменьшает количество вательности нежелательных трансформантов, поскольку 10 5 — $CATATGG — 5 линеаризованная ДНК трансформирует Е. 3 — GGTATACC — 5 соИ с более низкой частотой, нежели закры- прибавляют в раствор, обработанный фертая кольцевая ДНК. Для переваривания ли- ментом Кленова, Bgllt-переваренной ДНК гированной ДНК последнюю вначале плазмиды рТРА103вместес2мкл(около100 осаждают. этанолом и затем ресуспендиру- 15 единиц) Т4 ДНК-лигазы и 1 (2 ют в мкл уфера Ncol (1,5 М NaCI, 60 единиц) Т4 РНК-лигазы и полученную смесь мМ трис-HCI, рН 7,8, 60 мМ MgCI2 и 2 мг/мл для реакции лигирования инкубируют в

С ) и 16 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 чение ночи при 4 С. Лигированная ДНК соиру т в теединиц) рестрикционного фермента Ncol ставляет плазмиду рТРА103 der Ndei, прибавляют к раствору ДНК, полученную 20 которая в основном аналогична плазмиде реакционную смесь инкубируют в течение 2 рТРА103 за исключением того, что плазми а рТРА103 — der Ndel имеет последователь, что плазмида

Лигированную, а затем Ncol-перева- ность распознавания Ndet так, где плазмиренную ДНК используют для трансформа- ды рТРА103 имеет последовательность ции Е. соИ К12 RV 308/NRRL 15624). Клетки 25 распознавания Bglll.

RV308 К12 Е. соИ делают компетентными и Лигированную ДНК используют для трансформируют в основном в соответствии трансформации компетентных клеток Е, соli с методикой примера 3, Трансформацион- К12 RV308 в основном в соответствий с ме,ную смесь высеивают на L-агар, содержащий тодикой, описанной в примере 3. Трансфор1000 мкг!мл ампициллина. Ампициллину- 30 мированные клетки высевают íà L-агар, стойчивые трансформанты испытывают на содержащий ампициллин, и трансформанты чувствительность к канамицину, поскольку Е. coll К12 ЯЧ308/рТРА103 der Ndel идентиесли плазмида pRC придает устойчивость к фицируют анализом нерестрикционный канамицину,то плазмида рТРА103 не придает. фермент их плазмидной ДНК. ДНК плазмиАмпициллинустойчивые, канамицинчувстви- 35 ды рТРА103 — der Ndel выделяют из трансфо тельные трансфарманты затем используют мантов для использованИя в последующих для получения плазмидной ДН К, плазмидную построениях в основном в с м соответствии с меД исследуют анализом на рестрикцион- тодикой,описанной впримере1. ный фермент с тем, чтобы идентифицировать трансформанты Е. соИ К12 RV308/рТРА-103. 40 der Ndel в 10мкл буфера ТЕ прибавляют к 2

Рестрикционныйсайтифункциональная кар- мкл 10Х буфера AVall (0,6 М NaCt, 60 мМ та плазмиды рТРА-103 представлены на трис-HCI, рН 8, 0,1 М MgClz, 60 мМ 2-мерфиг.9. ДНК плазмиды рТРА103 выделяют из капроэтанола и 1 мкг/мл БСА) и 6 мкл воды. клеток Е. coll K12RV308/рТРА103 в основ- Около2мкл(около10единиц)рестрикционном в соответствии с методикой, описанной 45 ного фермента AVall прибавляют к ДНК и в примере 1. полученную реакционную смесь инкубируБ. Конструирование промежуточной ют при 37 С в течение 2 ч. AVall-переваренплаэмиды pBW25, ную ДНК нагружают на агарозйый гель и кало 1 мкг ДНК плазмиды рТРА103 в1 подвергают электрофорезу до отделения от мкл буфера ТЕ прибавляют к 2 мкл 10Х бу- 50 других продуктов переваривания рестрикфера Bglll и 16 мкл воды, Около 1 мкл (около ционного фермента размером около 1,4 kb, 5 единиц) рестрикционного фермента Bglll Рестрикционный фрагмент AVall размером

ТРА1 и прибавляют к раствору ДНК плаэмиды около 1,4 kb плаэмиды рТРА103 d r Nd I р 03, полученную реакционную смесь выделяют из геля, получая при этом около 2 инкубируют в течение 2 ч при 37 С. Bglll-пе- 55 мкг желаемого фрагмента, которые суспенреваренную ДНК плазмиды рТРА103 осаж- дируют в 5 мкл буфера ТЕ. дают этанолом и ресуспендируют в 5 мкл

10Хб е

Около 5 мкл 10Х буфера Кленова 35 ленова, мкл уфера Кленова и 44 мкл воды, Около 1 воды и 5 мкл (около 5 единиц) фермента мкл фермента Кленова (около 1 единицы) Кленова прибавляют к раствору рестрикциприбавляют к раствору Bgill-переваренной онного фрагмента AVall размером около 1.4

1780541

60 рованием и ресуспендируют в 2 мкл 10Х

50 буфера Есо R I и 16 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермен-та Есо R I прибавляют к раствору Smal-переваренной ДНК плазмиды pUC19, полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч. Есо Я. 1-Smal-neреваренную ДНК плазмиды pUC19 экстрагируют один раз фенолом, затем два раза хлороформом и ресуспендируют в 5 мкл буфера ТЕ. кЬ, полученную реакционную смесь инкубируют при 16 С в течение 30 мин. Кленов-обработанную ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в 3 мкл 10Х лигазного буфера и 14 мкл воды. 5

Около 2 мкг линкеров Hpal последовательности

5 -CqrrAAqq-3

3 — ОСАА1 ТОС вЂ” 5 киназируют в основном в соответствии с 10 методикой примера 2. Около 10 мкл киназированных линкеров прибавляют k раствору

Кленов-обработанного рестрикционного фрагмента AVall размером около 1,4 kb плазмиды рТРА103 der Ndel вместе с 2 мкл 15 (около 100 единиц Т4 ДН К вЂ” лигазы и 1 мкл) около 1 единицы Т4 ДНК-лигазы, полученную реакционную смесь инкубируют при

16 С в течение ночи.

Лигированную ДНК экстрагируют один 20 раз фенолом, дважды хлороформом, осаждают этанолом и ресуспендируют в 2 мкл

10Х буфера Есо R I и 16 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента Есо R I прибавляют к раствору ДНК, 25 полученную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч. Есо R 1-переваренную ДНК экстрагируют один раз фенолом, дважды хлороформом, осаждают этанолом и ресуспендируют в 3 мкл 10Х лигазного бу- 30 фера и 20 мкл воды. Фрагмент, имеющий около 770 пар оснований в размере и кодирующий trpPO и аминоконец тканевого активатора плазминогена человека (АПТ), имеет один Eco R 1-совместимый конец и 35 один тупой конец и его лигируют в Есо R

1-Smal переваренную плазмиду PUCI с образованием плазмиды PUC19NPAFE.

Около 2 мкл плазмиды pUC19 (поставляется Бетесда Рисирч Лабораториез) раство- 40 ряют в 2 мкл 10Х буфера Smal (0,2 М KCI, 60 мМ трис-HCI, рН 8, 60 мМ MgClg, 60 мМ

2-меркаптоэтанола и 1 мг/мл БСА) и 16 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента Smal прибавляют 45 к раствору ДНК, полученную реационную смесь инкубируют при 25 С в течение 2 ч.

Smal переваренную ДНК плазмиды pUC19 . осаждают этанолом, собирают центрифугиЕсо R 1-Smai-переваренную ДНК плазмиды pUC19 прибавляют к раствору, содержащему тупоконечный рестрикционный фрагмент Eco R I размером около 770 пар оснований, полученный из плазмиды

pTPA103 der NdeI. Около 2 мкл (около 1000 единиц) Т4 ДНК-лигазы прибавляют к смеси

ДНК, полученную реакционную смесь инкубируют при 16 С в течение ночи. Лигированная ДНК составляет желаемую плазмиду

pU019TPAFE. Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды pUC19TPAFE представлены на фиг.9.

Многоклонирующий сайт плазмиды

pUC19 содержит последовательности распознавания Есо R I и Smal, используемые при конструировании плазмиды

pUC19TPAFE, расположен в пределах кодирующей последовательности для фрагмента

lacL2, Экспрессия фрагмента lacL2 в клетках, содержащих мутацию М I5 )ас2, мутацию в гене lacL, который кодирует Р-галактозидазу, позволяет этим клеткам экспрессировать функциональную молекулу j3-галактозидазы и тем самым позволяет этим клеткам гидролизовать X-Gal (5-бром-4-хлор-3-индолил- Р-0 галактопиранозид, бесцветное соединение) в его индиго-окрашенный продукт гидролиза. Инсерция ДНК в многоклонирующий сайт плазмиды pUC19 мешает кодирующей последовательности для фрагмента

lac2Lи клеткам с мутацией М15 1ас так, что хозяин, например плазмида, не в состоянии гидролизовать X-Gal Лигированную ДНК. которая составляет плазмиду pUC19TPAFE, используют для трансформации клеток Е, coll К12 RRI М15 (NRR LB-15440), которые делают компетентными для трансформации в основном в соответствии с методикой примера 3.

Трансформированные клетки высевают на (=агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина, 40 мкг/мл X-Gal и 1 MM IPTG, Колонии, которые не проявляют индиго-окраску, субкультивируют и используют для получения плазмидной ДНК; трансформанты E. coll

К12 RRI hM15/pUC19TPAF Е идентифицируют анализом на рестрикционный фермент их плазмидной ДНК. ДНК плазмиды

pUC19TPAF Е выделяют из клеток Е. coll К12

RRl ЬМ15/рОC19TPAF Е, для использованйя в йоследующих постфоеййях в основном в соответствии с методикой примера 1.

Около 7 мкг плазмиды pUC19TPAF Е в

20 мкл буфера ТЕ прибавляют к 10 мкл 10Х буфера Hpal (0,2 М KCI. 0,1 М трис-HCI, pH

7,4и0,1 М М9С1)и70мкл воды, Около3мкл (около 6 единиц) рестрикционного фермента Hpal прибавляют в раствор ДНК плазми61

1780541

62 ды pUC19TPAF Е, полученную реэкционйую размером околб 1,015 kb плаэмиды рТРА103 смесь инкубируют при 37ОС в течение 20 вместе с 2 мкл 10Х лигазного буфера и 1 мкл мин; короткий период реакции предназна- (около 1 единицы Вейса); лигаза получена из чен для получения частичного Hpal-перева- Промега Биотек, 2800 С,Фиш Хэтчери Роуд, ривания. Реакционную смесь доводят ""до 5 Мэдисон, Биосконсин 53711/Т4 ДНК-лига150 мкл IX буфера BamHI (150 мМ NaCI, 10 мМ зы, и полученную реакционную с бт ис НС! Н8и1 трис-, р и 0 MM MgClz, поднимая кон- руют при 16 С в течение ночи. Лигированная центрацию соли, инактивирующую Hpal). ДНК составляет желаемую плазмиду pBW25.

Около 1 мкл (около 16 единиц) рестрикцион- Рестрикционный сайт и функциональная карного фермента BamHI прибавляют к раство - 10 та плазмиды pBW25 представлены на фиг,9. ру частично-Hpal-переваренной ДНК, Лигированную ДНК используют для полученную реакционную смесь инкубиру- трансформации Е,.col! К12 М105(поставляют при 37 С в течение 90 мин. ют их BRL), которые были сделаны компеBamHI-частично-Hpal-переваренную тентными для трансформации в основном в

ДНК плазмиды pUC19TPAF Е концентриру- 15 соответствии с методикой примера 3 эа ис1,5 -ный ага ют осаждением этанола, нагружаЮт "на ключением того, что в методике ис о -ный агарозный гель и рестрикцион- 50 мМ CaCI2. Трансформированные клетки ный фрагмент Hpai-BamHl размером около вИсевают íà BHI (Дифко Лабораториез, Де.3,42 kb, содержащий репликон, ген j3-лак- тройт, Мичиган), содержащий 100 мкг/мл тамазы и всю АПТ-кодирующую ДНК плаз- 20 ампициллина, и транспорируют Е. coll К12 миды pUCATPAF Е, выделяют из геля путем !М105/pBW25, идентифицируют анализом отрезания сегмента геля, который содержит на рестрикционный фермент их плазмидной р режелаемый фрагмент, замораживания cer- ДНК. Переваривание плазмиды BW25 емента и последующего выдавливания жид- стрикционным ферментом Есо R приводит кости из сегмента, ДНК осаждают из 25 к получению рестрикционных фрагментов жидкости осаждением этанола, Около 1 мкг размером 3 38 kb и около 1,08 kb. Плазмиду желаемого фрагмента получают и суспенди- pBW25 получают для использования в дальруют в 20 мкл буфера ТЕ. нейших конструированиях в основном в соОколо 10 мкг плазмиды рТРА103 в 10 ответствии с методикой, описанной в мкл буфера ТЕ растворяют в 10 мкл 10Х 30 примере 1, буфера Seal-(1 М NaCI, 60 мМ трис-HCI, рН С. Сайт-специфический мутагенез АПТ7,4, и 60 мМ MgCI2, 10 мМ ДТТ и 1 мг/мл кодирующей области и конструирование

ВСА) и 80 мкл воды, Около 3 мкл (около 18 плазмиды pBW28. единиц) рестрикционного фермента Seal Около 5 мкл плазмиды pBW25 в 10 мкл, прибавляют к рЬ1твбру ДНК плазмиды 35 дистиллированной через стекло воды прирТРА103, полученную реакционную Смесь бавляют к приблизительно 10 мкл 10Х реакинкубируют в течение 90 мин при 37 С. Ре- ционного буфера Hindlll и 80 мкл воды. акционный объем доводят до 150 мкл IX Около 1 мкл (около 20 единиц) рестрикционбуфера BamHI и около 1 мкл (около 16 еди- ного фермента Hindlll прибавляют к рэствониц) рестрикциойного фермента BamHI 40 ру ДНК плазмиды рВЧЧ25, полученную прибавляют в смесь, которую затем ийкуби- реакционную смесь инкубируют при 37ОС в руют при 37 С в течение 90 мин. ДНК осажда- течение 90 мин. Около 3 мкл (около 24 едиют этанолом, собирают центрифугированием ниц) рестрикционного фермента Есо R I и 10 и ресуспендируют при получениидля электрб- мкл ТМ трис-HCI, рН 7,6, прибавляют в расфореза, Seal-BamHI-переваренную ДНК плаз- 45 твор Hindlll-переваренную ДНК плазмиды миды pTPA -103 нагружают на" 1,5 -ный рВЮ25, полученную реакционную смесь инагарозный гель и подвергают электрофорезу кубируют в течение 90 мин при 37 С. Есо R . до отделения отдругих продуктов йеревэрива- — Hindlli-переваренную ДН К плазмиды ния рестрикциойного фрагмента Sea!-BamHI pBW25 концентрируют осаждением этаноразмером около 1,015 kb, 50 ла, нагружают на 1,5 -ный агарозный гель

Данный рестрикционный фрагмент, со- и подвергают электрофорезу до тех пор, подержащий АПТ-карбоксиконец-кодирую-- ка реакционный фрагмейт EcoRI — Hindlll щую ДНК плазмиды рТРА103, выделяют из размером около 810 пар оснований не отдегеля, получая при этом около 0,5 мкг желае- лится от других продуктов переваривания. мого фрагмента, которые растворяют в 20 55 Около 0,5 мкг рестрикционного фрагмента мкл дистиллированной через стекло воды. Есо R I Hindi!i размером около 810 пар ос-.

Около 2 мкл рестрикционного фрэгмен- нований выделяют из геля, приготавливают та ВагпН!2Нра! размером около 3,42 kb для лигирования и ресуспендируют в 20 мкл плазмиды pUC19TPAF Е прибавляют в 2 мкл дистиллированной через стекло воды. рестрикциьнного фрагмента Seal-8am*!-II

17.80541

5

30

40

Около 4,5 мкг репликативной формы (РФ) ДНК M13mp8 (поставляется иэ НьюИнглэнд Биолабс) в 35 мкл дистиллированной через стекло воды прибавляют к 10 мкл

10Х буфера Hlndlll и 55 мкл воды. Около 1 мкл (около 20 единиц) рестрикционного фермента Hindlll прибавляют к раствору ДНК

M13mp8, и полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение часа. Около

3 мкл (около 24 единиц) рестрикционного фермента Есо R1 и около 10 мкл IM трис-Н Cl, рН 7,6, прибавляют к раствору Hindi ll-переваренной M13mpS ДНК, полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение часа. Hindi ll — EcoRI-переваренную

M13mp8 ДНК собирают осаждением этанола, ресуспендируют в препарате для электрофореза в агарозном геле и большой рестрикционный фрагмент выделяют гельэлектрофореэом. Около 1 мкг большого рестрикционного фрагмента Есо R I-Hindill

ДН К M13mp8 получают и суспендируют в 20 мкл дистиллированной через стекло воды;

Около 2 мкл большого рестрикционного фрагмента Есо R I — Hindlll N13 mp8, 2 мкл

10Х лигазного буфера, 12 мкл воды и около

1 мкл (около 1 единицы Вейса) Т4 ДНК-.лигазы прибавляют в 3 мкл рестрикционного фрагмента Есо R! — Hindlll размером около

810 пар оснований плазмиды pBW25, полученную смесь реакции лигирования инкубируют при 16 С в течение ночи.

Клетки IM103 Е, соИ, поставляемые фирмой BPL, делают компетентными итрансфецируют лигационной смесью в основном в соответствии с методикой, описанной в руководстве по дидезокси (секвенирования) клонирования M13 BRL за йсключением то го, что изменяют количество ДНК, используемой при трансфекции, Рекомбинатные бляшки идентифицируют инсерционной инактивацией гена, кодирующего а -фрагментр-галактозидазы, что приводит к потере способности расщеплять X-gat в его индигб-окрашенный продукт расщепления.

Для целей скрининга шесть белых бляшек собирают в 2,5 мл L-бульона, куда прибавляют 0,4 мл IM103 К12 Е. coll, культивируют в минимальных средах с тем, чтобы гарантировать удерживание эписомы Г, которая несет ргоАВ в фазе логарифмического роста, бляшкосодержащие растворы инкубируют в воздушной качалке при 37 С в течение 8 ч.

Клетки из 1,5 мл — аликвот осаждают и ДНК

РФ (репликативной формы) выделяют в основном в Соответствии с методикой щелочного минискринига, ойисанной Бернобоймом и

Доули, 1979, Nuc, Acids Res. 7:1513. Оставшуюся часть каждой культуры сохраняют при

4 С для популяции, Желаемый фаг, обозначенный pM88W26, содержит рестрикционный фрагмент Есой1 — Hindlll размером около

810 пар оснований плаэмиды pBW25, лигированный к рестрикционному фрагменту Есо R

l — Hindilt размером около 7,2 kb M13 mp8.

Около 50 мл IM103 Е, coll ëîã-фазы заражают рМ SBW26 и инкубируют в воздушной качалке при 370С в течение 18 ч. Зараженные клетки осаждают путем центрифугирования с малой скоростью, односпиральную

ДНК pMSB W26 получают из культурального надосадочного слоя путем пропорционального увеличения методики, приведенной в руководстве. Односпиральную pMSBW26 мутагенизируют в основном в соответствии с доктриной Адельмана и др., 1983. ДН К2(3). с.183 — 193, за исключением того, что реакцию Кленова осуществляют при комнатной температуре в течение 30 мин, затем. при

37 С в течение 60 мин, затем при 10 С в течение 18 ч, Кроме того, обработку Sl осуществляют при 20 С, солевая концентрация буферного раствора составляет половину той, которую рекомендуют использовать изготовители и также применяют праймер секвенирования М13 (BRL). Синтетический олигодезоксирибонуклеотидн ый праймер.

5ЧХОАЖТОСТОТОАААТАТССАССТОСООССТОАЫ-3 используют для делеции кодирующей последовательности для аминокислотных остатков с 87 по 261 нативного АПТ.

Полученную мутагенезную смесь используют для трансфекции IM103 К12 Е. coll в основном в соответствии с описанной методикой заражения. Желаемые мутанты идентифицируют анализом на рестрикционный фермент ДНК РФ и секвенированием

ДНК по Максаму и Гилберту. Желаемый мутант, который имеет кодирующую последовательность для аминокислотных остатков с

87 по 261 делецированного нативного АПТ, обозначают pM8BW27.

Для построения плазмиды pBW28 необходимо большое разнообразие ДН К-фрагмент. Первый из этих фрагментов получают путем прибавления около 20 мкг ДНК РФ

pMSBW27 в 20 мкл дистиллированной через стекло воды к 10 мкл 10Х буфера Ndll и 60 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Ndll прибавляют к смеси ДНК плазмиды pMSBW27, полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч, Ndll-переваренную

ДНК плазмиды pMSBW27 осаждают этанолом, собирают центрифугированием и ресуспендируют в 10 мкл 10Х буфера EcoRI u

90 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента EcoRI прибав65

1780541

66 ляют к раствору Ndtl-переваренной ДНК нованийвыделяютизгеляизатемресуспенплазмиды pM8BW26, полученную реакци- дируют в 10 мкл дистиллированной через онную смесь инкубируют в течение 2 ч при стекло воды. 7

37 С. Eco R I — МбИ-переваренную ДНК плаз- Последний фрагмент, необходимый для миды pMSBW27 подвергают электрофорезу 5 построения плазмиды pBW28, выделяют из на агарозном геле до отделения от других плазмиды pL110, конструирование которой продуктовперевариваниярестрикционного раскрывается в примере 9. Около 25 мкг фрагмента Ndel-Eco R размером около 560 плазмиды pL110 в 25 мкл буфера ТЕ прибавпар оснований, который содержит часть по- ляют к 10 мкл 10Х буфера Xbal (0,5 M NaCI, следовательностй;-кодирующейАПТ;которая 10 60 мМ трис-HCI, рН 2,9, 60 мМ MgCtz и 1 охватывает сайт делеции. Рестрикционный мг/мл БСА) и 55 мкл воды, Около 10 мкл фрагмент Mdel — ЕсоИ размером около 560 (около50единиц)рестрикционногофермента пар оснований выделяютиз геля, получая при Xbal прибавляют к раствору ДНК плазмиды этом около 0,5 мкг желаемого фрагмента, ко- pi110, полученную реакционную смесь инкуторые суспендируют в 20 мкг дистиллирован- 15 бируют при 37 С в течение 2ч.Xbal-переваренной через стекло воды. ную ДНК плазмиды pL110 осаждают

Второй фрагмент, необходимый для по- этанолом, собирают центрифугированием и строения плазмиды рВЧЧ28, синтезируют ресуспендируют в 10 мкл 10Х буфера BamHI (одну спираль одновременно) на автоматизи- и 89 мкл воды. Около 1 мкл (около 5 единиц) рованном ДНК-синтезаторе. Две комплемен- 20 рестрикционного фермента BamHI прибавтарные спирали, которые гибридизируют с ляют к раствору Xbal-переваренной ДНК образованием двухспирального сегмента плазмиды pL110, полученную реакционную

ДНК с областями перекрытия Xbal u Ndel смесь инкубируют при 37 С втечение30 киназируют и ренатурируют в основном в со- мин с получением частичнЪго BamHI-переответствии с методикой примера 2. Линкер 25 варивания. Xbat — частично — ВатН! — переимеет следующую структуру: варенную ДН К плазмиды pL110 нагружают на агарозный гель и подвергают электрофо5 — CTAGAGGGTATTAATAATGTATCGA резу до тех пор, пока от другйх продуктов

TCCCATAATTATTACATAGCT переваривания не отделится фрагмент

30 ХЬа! — Вап Н! размером около 6 kb. РестрикTTTAAATAAGGAGGAATAACA — У ционный фрагмент Xbal — BamHI размером

AAATTTATTCCTCCTTATTGTAT. около 6 kb выделяют из геля, получая при

Т этом около 0,5 мкг рестрикционного фрагретий фрагмент, необходимыйдля по- мента Xbal — BamHI размером около 6 kb, строения плазмиды pBW28, получают путем 35 которые суспендируют в приблизительно 40 прибавления около 20 мкг плазмиды рТРА- мкл дистиллированной через стекло воды.

103 в 20 мкл буфера ТЕ к 10 мкл 10Х буфера Этот рестрикционный фрагмент Xbal—

BamHl и 60 мкл воды. Около 10 мкл (около BamHI размером около 6 kb содержит всю

50 единиц) рестрикционного фермента плазмиду pL110 за исключением ВК-BCHBamHI прибавляют к раствору ДНК плазми- 40 кодирующей ДНК. ды рТРА103, полученную реакционную Для построения плазмиды pBW28 слесмесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч, дующие фрагменты смешиваютдругс pyro:

В àmНI" nåðåâàðåííóþ ДНК плазмиды около 0,1 MKI (около 8 мкл) рестрикционного рТРА103 осаждают зтанолом, собирают фрагмента BamHI Xbal размером около 6kb центрифугированием и ресуспендируют в 45 плазмиды pL110, около 0,5 мкг (около 2 мкл)

10 мкл 10Х буфера Есо R I и 80 мкл воды.. рестрикционногофрагмента Ndel-Eco R l разОколо 10 мкл (около 50 единиц) рестрикци- мером около 560 пар оснований плазмиды онного фермента Есо R I прибавляют к рас- pM8 — BW27, около 0,1 мкг (около 2 мкл) ретвору ВагпН!- переваренной ДНК плазмиды стрикционного фрагмента Есо R I— - BamHI р 103, полученную реакционную смесь 50 размером около 689 пар оснований плазмиТРА инкубируют при 37 С в течение 2 ч, BamHt- ды рТРА-103, а также около 0,02 мкг (около

Eco R t-переваренную ДНК плазмиды 1 мкл) синтетического линкеры Xbal — Ndet рТРА103 нагружают на агарозный гель и размером около 45 пар оснований. Около 2 подвергают электрофорезу до тех пор, пока мкл 10Х лигазного буферного раствора и 1 не отделится от других продуктов перевари- 55 мкл (около 1 единицы Вейса) ДНК-лигазы Т4 вания рестрикционный фрагмент Есо R I- прибавляютксмесиДНК,полученнуюсмесьBamHl размером около 689 пар оснований, реакции лигирования инкубируют при 4 С в который содержит последовательность, ко- течение ночи, Лигированная ДНК составлядирующую карбокси-конец АПТ. Около 0,5 ет желаемую плазмиду pBW28, Ректрикцимкг фрагмента размером около 689 пар ос67

1780541

68 онный сайт и функциональная карта плазмиды pBW28 представлены на фиг.10.

Лигированную ДНК используют для трансформации клеток ММ294 К12 Е. coll (NRRL В-15625), которые делают компетентными в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 3 за исключением того, что в методике используют 50 мМ

СаС!г. Вследствие присутствия лямбда-pLпромотора и гена, кодирующего температурно-чувствительный лямбда-pL-репрессор на плазмиде pBW28, методику трансформации и культивирование трансформантов изменяют некоторым образом. Клетки не подвергают воздействию температуры свыше 32 С во время трансформации и последующего культивирования. Искомые трансформанты Е. соП

К12 ММ294/рБР/28 идентифицируют по их тетрациклинустойчивому, ампициллинчувствительному фенотипу и путем анализа на рестрикционный фермент их плазмидной

ДН К.

Д. Окончательное конструирование плаэмиды pBW32, Приблизительно 10 мкг ДНК плазмиды

pSV2- /3-глобин (йВЯ1 В-15928) растворяют в 10 мкл 10Х реакционного буферного раствора Hindlll, 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Hindlll и 85 мкл воды, реакционную смесь помещают на 2 ч при 37 С. Затем реакционную смесь доводят до концентрации 0,15 М в LICI и после прибавления 2,5 объема этанола и инкубации в ванне с сухим льдом и этанолом ДНК осаждают центрифугированием, Осадок ДНК после центрифугирования растворяют в 10 мкл 10Х буфера Bglll, 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Bg!H и 85 мкл воды, реакционную смесь инкубируют в течение 2 ч при 37 С, После

Bglll-переваривания реакционную смесь нагружают на 0,857;,-ный агарозный гель и фрагменты разделяют электрофорезом.

Гель визуализируют с использованием бромида этидия и ультрафиолетового света и полосу, содержащую желаемый фрагмент

Н!псП!! — Bglll размером около 4,2 kb, отрезают от геля, как описано, Осадок ресуспендируют в 10 мкл воды и получают около 5 мкг желаемого рестрикционного фрагмента

Hindlll — Bglll размером около 4,2 kb плазмиды pSV2- Р -глобин. Рестрикционный фрагмент Hindlll — ВагпН! размером около 2 kb плазмиды рТРА103, который кодирует АПТ, выделяют иэ плазмиды рТРА103 в основном в соответствии с вышеприведенными положениями, Около 5 мкг рестрикционного фрагмента Hindlll-BamHI размером около 2

50 керов BamHI смешивают и инкубируют при

16оС в течение ночи вместе с 11 мкл воды, 2 мкл 10Х лигазного буфера и 1 мкл (около

1000 едйниц) ДН К-лигазы Т4.

10 мкл 10Х реакционного буфера

BamHI, 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента BamHI и 48 мкл воды прибавляют в смесь реакции лигирования, которую затем инкубируют при 37 С в течение 3 ч, Реакционную смесь нагружают на

1;4-ный агарозный гель и искомый фрагkb плазмиды рТРА103 получают, суспендируют в 10 мкл воды и сохраняют при -20 С.

2 мкл рестрикционного фрагмента

В9!П вЂ” Hindlll размером около 4,2 kb плаэми5 ды pSV2- j3 -глобин и 4 мкл фрагмента

Hln dill — Вап Н1 размером около 2 kb плазмиды рТРА103 смешивают друг с другом и затем инкубируют с 2 мкл 10Х лигазного буфера, 11 мкл воды и 1 мкл ДНК-лигазы Т4 (около 500

10 единиц) при 4 С в течение ночи. Лигированная ДНК составляет искомую плазмиду рТРА301. Л игирован ную ДН К используют для трансформации клеток RRI К12 Е. coll (Мйй(В-15210), которые делают компетентными

15 для трансформации в основном в соответствии с методикой примера 3. Плазмидную ДНК получают из трансформантов Е. coll K12

RRI/рТРА301 в основном в соответствии с методикой примера 1. Рестрикционный сайт

20 и функциональная карта плазмиды рТРА301 представлены на фиг.10.

Плазмида pSV2-дгфр содержит ген дигидрофолятредуктазы (дгфр), пригодный для селекции трансформированных эукариоти25 ческих клеток и амплификации ДНК, ковалентно связанной с геном дгфр. 10 мкг плазмиды pSV2-дгфр, выделенной из Е, coll

К12 НВ101/pSV.-2-дгфр, АТСС 37146, смешивают с 10 мкл 10Х буфера PVUII, 2 мкл

30 (около 20 единиц) рестрикцион ного фермента PVUII и 88 мкл воды, полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение

2 ч. Реакцию завершают экстракциями фенолом и хлороформом, после чего PVUII-перева35 ренную ДНК плазмиды pSV2-дгфр осаждают и собирают центрифугированием, Линкеры BamHI (5 — СССАТССС6 — 3 ) киназируют и подготавливают для лигирования следующим образом. К 1 мкг линкера

40 в 5 мкл воды прибавляют 10 мкл 5Х солей киназы (300 MM трис-HCI, рН 7,8, 50 MM

Mg CI2 и 25 мМ (ДТТ), 5 мкл 5 мМ АТФ, 5 мкл

БСА (1 мг/мл), 5 мкл 10 мМ спермидина), 19 мкл воды и 1 мкл полинуклеотидкиназы (10

45 единиц/мкл). Эту реакционную смесь затем инкубируют при 37 С в течение 60 мин и сохран,яют при -20 С. 5 мкл (около 5 мкг)

PVUII-переваренной плазмиды pV2-дгфр и

12 мкл (около 0,25 мкг) кинаэированных лин69

1780541

70 мент размером около 1,9 kb содержащий Данную реакционную смесь инкубируген дгфр, выделяют из геля, Все прибавле- ют при 37 С в течение 2 ч. Есо R I Bglli-пения линкеров, осуществляемые в данном реваренную ДНК нагружают на агарозный примере, очищают традиционным образом гель и подвергают электрофорезу до тех на агарозном геле с тем, чтобы уменьшить 5 пор, пока рестрикционный фрагмент Есо R вероятность присутствия многолинкерных — Bglll размером около 3,7 kb не отделится последовательностей в конечном векторе. от других продуктов переваривания, после

Полученный фрагмент в количестве около 3 чего фрагмент размером o bno 2,7 kb выдемкг суспендируют в 10 мкл буфера ТЕ. ляют и подготавливают Для лйгйрования .

Затем приблизительно 15 мкл (около 1 10 Для выделения рестрикционного фраг) плаэмиды рТРА-301 переваривают ре- мента, содержащего ген дгфр, плазмиду стрикционным ферментом BamHI, как указа- рТРА303 подвергаютдвойному переваривано выше. Поскольку существует уникальный нию рестрикционными ферментами Hindlll сайт BamHI в плазмиде рТРА301, данное Есо R I, в результате чего выделяют и восBamHI-переваривание генерируетлинейную 15 станавливают рестрикционный фрагме нт

Д К плазмиды рТРА301, BamHI-переварен- Есо R — Hindlll — размером около 2340 пар ную плазмиду рТРА103 осаждают этанолом и оснований, который содержит указанный ресуспендируют в 94 мкл и фосфатазируют с ген дигидрофолятредуктазы. использованием 1 мкл телячьекишечной ще- Для выделения рестрикционного фраглочной фосфатазы (Коллаборатив Рисерч, 20 мента Hindi!I — Sstl размером около 2 kb

Инк., 128 Спринг Стрит, Лексингтон, Минне- плазмиды рТРА303, который содержит обсета 02173) и 5 мкл 1 М трис-HCI, рХ 9, при ласть кодирования карбокси-концатканево65 С в течение 45 мин. ДНК экстрагируют го активатора плазминогена человека и фенол: хлороформом, затем экстрагируют пройотор SV40, плазмиду рТРА303 подверхлороформ: изоамиловым спиртом, осажда- 25 гают двойному перевариванию рестрикциют этанолом и ресуспендируют в 20 мкл во- онными ферментами Hindlll u Sstl в !Х ды. 10 мкл (около 0,25 мкг) буфере Hindlll. Фрагмент размером около фосфатазированной плазмиды рТРА301 1,7 kb выделяют из геля и подготавливают прибавляют к 5 мкл BamHI, дгфр-генсодер- для лигирования. жащего рестрикционного фрагмента (около 30 Для выделения рестрикционного фраг1,5 мкг), 3 мкл 10Х лигазного буфера, 3 мкл мента Xholl (совместимого для лигирования (около 1500 единиц) ДНК-лигазы Т4 и 9 мкл с областью перекрытия Bgl(ll) — Sstl) размеводы. Эту смесь реакции лигирования инку- ром около 680 пар оснований плаэмиды бируют при 15 С в течение ночи; лигирован- pBW28, который содержит область кодироная ДНК составляет желаемую ДНК 35 вания аминоконца модифицированного плазмиды рТРА303; АПТ, около 10 мкг плаэмиды pBW28 переваПлазмиду рТРА303 используют для ривают ферментом Xholl в IX буфере Xholl трансформации Е, coil К12 RRI (NRRL В- (0,1 М трис-НС!, рН 8, 0,1 м MgClz, 0,1

15210), полученные трансформанты Е, col! тритон X — 100 и 1 мгlмл БСА).

К12 RRI/рТРА303 идентифицируют по их 40 Xholl-переваренную ДНК извлекают а пициллинустойчивому фенотипу и анали- осаждением этанола и затем" переваривают зом на рестрикционный фермент их плаз- ферментом Sstl. Xholl-Sstl-переваренную мидной ДНК. Плазмиду рТРА303 выделяют ДНК нагружают на акриламидный гель и из трансформантов в основном в соответст- желаемый фрагмент выделяют из геля и подвии с методикой примера 1. Рестрикцион- 45 готавливают для лигирования. ный сайт и функциональная карта плазмиды Около 0,1 мкг каждого из указанных р 303 представлены на фиг,10. фрагментов: рестрикционного фрагмента

ТРА303

Для выделения рестрикционного фраг- Есо R — Bglll размером около 2,7kb плазмимента Есо R — Bglll размером около 2,7 kb, ды рТРА301, рестрикционного фрагмента который кодирует репликон рВ R 322 и ген 50 Есо R — Hindlll размером около 2,34kb плазР-лактамазы из плазмиды рТРА301, около мидырТРА303,рестрикционногофрагмента

10 мкг плазмиды рТРА301 переваривают в Sstl — Hindi!I размером около 1,7 kb плазми400 мкл полного реакционного обьема с ис- ды рТРА303 и рестрикционного фрагмента пользованием 20 единиц рестрикционного- Sst — Xholl размером около 0,68 kb плазмифермента Bglll a IX буфера Bglll при 37 С. 55 ды рВМ/28 лигируют вместе с образованием

После Bglil-переваривания концентрацию плазмиды pBW32. Лигационную смесь истрис-НС! доводят до 110 мМ и 20 единиц пользуют для трансформации Е. со!! К12 рестрикционного фермента Есо R I прибав- ММ293, как описано в примере 3 за исклюляют к Bglll-переваренной ДНК, чением того, что в методике используют 50 мМ CaCIz. Трансформанты идентифицируют

1780541

72 по их ампициллинустойчивому фенотипу и анализом на рестрикционный фрагмент их плазмидной ДНК. ДНК плазмиды pBW32 получают иэ трансформантов Е. coll К12

ММ294/pBW32 в основном в соответствии с методикой примера 1. Рестрикционный сайт и функциональная карта плаэмиды

pBW32 представлены на фиг.10.

Пример 17. Конструирование плазмид

pLPChd 1 и pLPChd 2.

Около 20 мкг плазмиды pBW32 в 20 мкл буфера ТЕ прибавляют к 10 мкл 10Х буфера

BamHI и 60 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента BamHI прибавляют к раствору ДНК плазмиды

pBW32, полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч. BamHI-переваренную ДНК плазмиды pBW32 осаждают этанолом, собирают центрифугированием и суспендируют в 5 мкл 10Х буфера

Кленова, 45 мкл воды и 2 мкл (около 100 единиц) фермента Кленова. Реакционную смесь инкубируют при 16 С в течение 30 мин, затем реакционную смесь нагружают на агарозный гель и подвергают электрофорезу до полного разделения продуктов переваривания. Обработанный раствором

Кленова BamHI-рестрикционный фрагмент размером около 1,9 kb плазмиды pBW32, содержащий ген дгфр, выделяют из геля и подготавливают для лигирования в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 12А; Окало 4 мкг искомого фрагмента получают и суспендируют в 5 мкл буфера ТЕ.

Около 200 мкг плазмиды pLPChyg 1 в

100 мкл буфера ТЕ прибавляют к 15 мкл 10Х буфера Есо R 1 и 30 мкл воды. Около 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Есо R прибавляют к раствору ДНК плазмиды pLPChyg 1, полученную реакционную смесь инкубируют при 37оС в течение 10 мин. Короткий период реакции рассчитывают для получения частичного Есо R I-переваривания. Плазмида pLPChyg1 имеет два рестрикционных сайта Есо Rl, один из которых находится в пределах кодирующей последовательности гена, придающего устойчивость к гидромицину (HmR). и желательно инсерцировать дгфр-генсодержащий рестрикционный фрагмент в сайт Есо R l плаэмиды pLPChyg1, который не содержится в гене дгфр. Частично — Есо R 1 — переварен-, ную ДНК плаэмиды pLPChyg1 нагружают на агарозный гель и подвергают электрофорезу до тех пор, пока отрезанная ДН К плазмиды pLPChyg1 не отделится от неотрезанной плазмидной ДНК и других продуктов переваривания. Отрезанную ДНК выделяют из геля и подготавливают для лигирования в основном в соответствии с методикой при5

20 лигазы и 1 мкл (около 2 единиц) Т4 ДНК-лига50

45 мера 12А, Около 2 мкг Есо R 1 — отрезанной плазмиды pLPChyg1 получают и суспендируют в 25 мкл буфера ТЕ. К данной пробе прибавляют около 5 мкл (около 25 единиц) фермента Кленова, 5 мкл 10Х буфера Кленова и 40 мкл воды, полученную реакционную смесь инкубируют при 16 С в течение 60 мин. Кленов — обработанную, частично — Есо

R — переваренную ДНК затем экстрагируют дважды фенолом и затем один раз хлороформом, осаждают этанолом и ресуспендируют в 25 мкл буфера ТЕ.

Около 5 мкл Кленов — обработанного рестрикционного фрагмента Вал Н 1 размером около 1,9 kb плазмиды pBW32 и около 5 мкл

Есо R I — разрезанной ДНК плазмиды

pLPChyg1 смешивают друг с другом, в смесь

ДНК прибавляют 1 мкл 10Х лигазного буфера, 5 мкл воды; 1 мкл (около 500 единиц) Т4 ДН Кзы и полученную реакционную смесь инкубируют при 16 С в течение ночи, Лигированная ДНК составляет искомую плазмиду

pLPChyg1 и искомую плаэмиду pLPChyg2, которые отличаются друг от друга только в отношении ориентации фрагмента размером около 1,9 kb, который содержит ген дгфр.

Лигированную ДНК используют для трансформации клеток E. col! К12 НВ101, которые делают компетентными для трансформации в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 3. Трансформированные клетки высевают íà L-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. ампициллинустойчивые трансформанты анализируют анализом на рестрикционный фермент их плазмидной ДНК с тем, чтобы идентифицировать трансформанты Е. coli К12 НВ101 (pLPChd1 и Е; coli К12 НВ101) pLPChd2. Для целей данного раскрытия плазмиду

pLPChd1 обозначают плазмидой pLPChd.

Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды pLPChd представлены на фиг.11. ДН К плазмиды р LPChd 1 и pLPChd2 выделяют из соответствующих трансформантов в основном в соответствии с методикой примера 1.

Пример 18. Конструирование плазмиды phd.

Для конструирования плазмиды phd необходимо получить ДНК плазмиды pLPChd1, используемую в качестве исходного материала при конструировании плазмиды phd из клеток хозяина Е. coli, которые не содержат аденинметилаэу, такую, которая кодируется геном dam, продукт которого метилирует адениностаток в последовательности

5 — GATC — 3 . Ecoli К12 6М48 (МЯР1 В15725) не содержит функциональную dam-ме- тилазу и поэтому представляет собой

73

1780541

74 пригодный хозяин для использованйя""в це- " Пример 19, Конструирование плазмилях получения ДНК плазмиды р1 PChd1, ды рН1-HD. применяемой в качестве исходного матери- Плазмида рСН2А5 содержит фрагмент ала при конструировании плазмйды phd. кДНК, который кодирует вариабельную обКлетки Е. coll К12 GM48 культивируют и 5 ласть тяжелой цепи мышиного моноклоделают компетентными для трансформа- нального антитела К$1/4, присоединенный ции, плазмиду pLPChyg1 используют для к фрагменту геномной ДНК, который кодитрансформации клеток Е, соИ К12 GM48 в рует человеческую постоянную область тяосновном в соответствии с методикой, опи- желой цепи иммуноглобулина Е. coll К12 санной в примере 3. Трансформирование 10 ММ294/pCH2A5 можно получить из Норклетки высевают на L-агар, содержащий ам- зерн Риджионал Рисерч Лаборатори поддепициллин и как только ампициллинустойчи- позитарным номером NRRL В-18360, вые трансформанты Е. соИ К12 GM48/ — Рестрикционный сайт и функциональная р РСпd1; одну такую ко= карта плазмиды"рСН2А5 представлены на лонию используют для получения ДНК плаз- 15 фиг.13 прилагаемых чертежей. Плазмидную миды pLPChd1 в основном в соответствии"с ДНК экстрагируют из культуру в основном в методикой примера 1. Около 1 мг ДНК плаз- соответствии с методикой примера 1, за исмиды pLPChd1 получают и суспендируют в ключением того, чтотемпература инкубации приблизительно 1 мл буфера ТЕ. составляет 37 С, Около 2 мкгДНК плазмиды pLPChd1 в2 20 Около 10 мкг плазмиды рСН2А5 разремкл буфера ТЕ прибавляют к 2 мкл 10Х бу- зают рестрикционным ферментом Eco R I в фера BCI1 (750 MM KCI, 60 мМ трис-НС(, рН основном в соответствии с методикой при7,4,100мМMgClz,10мМДТТи1мгlмл6CA) мера 5. ДНК обрабатывают Кленовым и лии14мкл воды, Около2мкл(около10единиц) керами BamHI (поставляются Нью Ингланд рестрикционного"фермента BCII прибавля- 25 Биолабэ) и затем прибавляют в основном в ют к раствору ДНК плазмиды pLPChd1, пол- соответствии с методикой примера 2, ДНК ученную реакционную смесь инкубируют переваривают рестрикционным ферментом при 50оС в течение 2 ч. Реакцию прекраща- BamHI в основном в соответствии с методиют экстрагированием смеси одинраз фено- кой примера 5. Рестрикционный фрагмент лом и два раза хлороформом, 30 BamKI — Есо R 1/BamHI размером около 7,4

Около 1 мкл BCI1 — переваренной ДНК kb затем выделяют из агарозного геля в осплазмиды pLPChd1 прибавляют к 2 мкл 10Х новном в соответствии с методикой примелигазного буфера, 8 мкл воды и 1 MK/l (около ра 12. Данный фрагмент затем лигируют в

50 единиц) Т4 ДНК-лигазы. Смесь реакции ВС11 — переваренный вектор phd в основлигирования инкубируют при 16 С в тече- 35 ном в соответствии с методикой примера 2. ние ночи и лигированная ДНК составляет ДНК затем трансформируют в Е. соИ, поискомуюплазмидурЬб, Плазмидарйб проис- вторно выделяют, плазмиду с правильной ходит в результате делецйи дополнитЕльН Й ориентацией (доказываемой фрагментом линкеров BCI1, которые присоединяются-во"" Maellt — Stu2 размером около 780 пар основремя конструирования плазмиды pLPea и 40 ваний) обозначают плазмиды pHI-HD. двух смежных рестрикционных фрагментов Пример 20. Конструирование трансBCI1, имеющих общий размер около 1,45 kb формантов эукариотных клеток хозяев, векот плазмиды pLPChd1. Рестрикционный сайт торов экспрессии. и функциональная карта плазмидьГ"phd Настоящие векторы экспрессии содерпредставлены на фиг.11. Плазмида phd со- 45 жат энхансер ВК. Энхансер ВК стимулирует действует экспрессии любой ДНК-последова- экспрессию гейа в присутствии генного dpoтельности из энхансера вируса BK-позднего дукта Е1А. Поскольку клетки 293 существенпромотора аденовируса в соответСтвий"с йэ"- " но "экспрессируют "генный. продукт Е1А, стоящим изобретением, поскольку экспресси- клетки 293 представляют собой эффективруемая ДНК легко поддается инсерции в 50 ный хозяин и для векторов эукариотической правильном положении для экспрессии в " экспрессии настоящего изобретения. Клетединствейном сайте BCI на плазмиде phd. ки 293 являются клетками человеческой перЛигированную ДНК используют для вичной почки, трансформированными трансформации E. colt К12 GM48 в основйом в аденовирусом типа 5 (следует отметить, что соответствиисметодикой,описаннойвприме- 55 в способе настоящего изобретения может ре 3. Трансформированные клетки высевавт" быть использован любой тип аденовируса с на L-агар, содержащий ампициллин- и ампи- тем, чтобы обеспечить получение генного циллинустойчивые трансформанты Е. colt К12 продукта Е1А), и они доступны из.АТСС под

GM48 (phd идентифицируют анализом на"ре-"" депози гарным йомербм С й(1573. Однако стрикационный фермент их плазмидной ДНК), векторы экспрессии настоящего изобрете75

1780541

5

15

25

30 фенотипа дгфр+

45

50 ния функционируют в широком круге клеток хозяина, даже если генный продукт Е1А отсутствет. Кроме того, генный продукт Е1А может быть интродуцирован в не-Е1А-продуцирующую клеточную линию либо трансформацией вектором, который содержит ген Е1А, либо разрезанной аденовирусной

ДНК, либо путем заражения аденовирусом.

Описанная ниже методика трансформации касается клеток 293 в качестве линии клеток хозяина, однако методика как правило приемлема для большинства линий эукариотических клеток. Клетки 293 йолучают из

АТСС под депозитарным номером CRL 1573 в 25 мм колбе, содержащей конфлюентный монослой около 5,5 х10 клеток в минимальной питательной среде игл с 10%-ной термоинактивированной лошадиной сывороткой.

Колбу инкубируют при 37 С, среду меняют дважды в неделю. Клетки субкультивируют путем удаления среды, промывки раствором сбалансированных солей Хэенка (Гибко), прибавления 0,25%-ного трипсина в течение 1 — 2 мин, промывки свежей средой, аспирации и розлива в новые колбы при соотношении субкультивации 1:5 или 1:10.

За один день до трансформации клетки высевают при 0,7 х10 клеток на чашку. Среду меняют за 4 ч до трансформации. Стерильную, этанолосажденную плазмидную

ДНК, растворенную в буфере ТЕ, используют для получения 2Х ДНК-CaCi-раствора, содержащего 40 мкгlмл ДНК и 250 мМ

Ca Cla 2Х H B S, получают содержащим 280 мМ NaC1, 50 мМ НереЯ и 1,5 мМ фосфат натрия, при этом рН раствора уоводят до

7;05.-7,15, Раствор 2Х ДНК-СаО прибавляют по каплям к равному объему стерильного

2Х HBS, 1 мл стерильную пластмассовую пипетку с хлопчатобумажной пробкой вставляют в смесительную пробирку, которая содержит 2Х HBS, и пузырьки вводят продувкой при одновременном прибавлении ДНК. Кальций фосфатный ДНК-осадок образуют без перемешивания в течение 3040 мин йри комнатной температуре.

Затем осадок смешивают путем отсасывайия пйпеткой, используя пластмассовую пипетку, и 1 мл (на чашку) осадка прибавляют непосредственно к 10 мл питательной среды, которая охватывает репйцйентные клетки, Через 4 ч инкубировали при 37 С среду заменяют DMEM с 10%-ной сывороткой плода коровы и клетки инкубируют 72 ч перед подачей селективного давления. Для плазмид, которые не содержат селектируемый маркер, функционирующйй в эукариотных клетках, методика трансформации включает смесь плазмид: вектора экспрессии, который не содержйт селектируемый маркер, и вектора экспрессии, который содержит селектируемый маркер. функционирующий в эукариотных клетках. Эта методика совместной трансформации позволяет осуществить идентификацию клеток, содержащих обе трансформирующие плаз миды; Для клеток, зараженных плазмидами, содержащими ген, придающий устойчивость к гигромицину, гигромицин прибавляют в питательную среду до конечной концентрации около 200 — 400 мкг/мл, Затем клетки инкубируют при 37 С в течение 2 — 4 недель при замене сред с 3 — 4-дневными интервалами. Полученные гиромицинустойчивые колонии переносят в отдельные колбы с культурами для определения характеристик, Выбор неомицин (G418 также используют вместо неомицина) — устойчивых колоний осуществляют в основном в соответствий с методикой отбора для гигромицинустойчивых клеток за исключением того. что неомицин прибавляют до конечной концентрации 400 мкг/мл, а не гигромицин.

Клетки 293 являются дгфр-положительными, так что трансфоманты 293, которые содержат плазмиды с геном дгфр, не отбирают просто на основании дгфр — положительного фенотипа, что является способностью расти в средах, не содержащих гипоксантин и тимин. Линии клеток, которые не содержат функциональный ген дгфр и которые трансформированы дгфр-содержащими плазмидами, могут быть отобраны на основании

Использование гена дигирофолят редуктазы (дгфр) в качестве селектируемого маркера для введения гена или плазмиды в линию клеток, лишенных дгфр. и последующее использование метотрексата для амплификации числа копий плазмиды хорошо известно в литературе, Хотя использование

"дгфр в качестве селектируемого и амплифицируемого маркера в дгфр-продуцирующих клетках еще не исследовано достаточно, можно предположить на основе литературных данных, что дгфр можно использовать в качестве селектируемого маркера в дгфрпродуцирущих клетках и для генной амплификации. Использование настоящего изобретения ограничивается селектируемым маркером. Более того могут быть использованы амплифицируемые маркеры. Такие, как гены металлотионеина, гены аденозиндеаминазы или члены многогенустойчивого семейства, например, P-гликопротеид. В клетках

293 выгодно осуществлять трансформацию вектором, который содержит селектируемый маркер, такой, как ген, придающий устойчивость к гигромицину В, а затем амплификацию

77

1780541

78 с использованием метотрексата. который не первоначальную ориентацию фильтра на может быть использован для селекции мы- чашке с тем, чтобы облегчить дальнейшую шиных дгфр — содержащих плазмид в клет- йДентификацию колонии, затем снимают и помещают и PBS (50 мМ трис-HCI, рН 7,2 и

Линия клеток AVI2 (АТСС С RL9595) 5 150 мМ NaCI). трансформируется в основном в соответст- Для сохранения клеток на чашке жизневии с методикой, описанной для клеток 293. способными во время анализа фильтров

Клетки AV12 также существенно экспресси- клетки покрывают слоем смеси объемом 8 мл, руют продукт гена Е1А и являются предпоч- содержащей 2 мл 1,8 -ного агара(47 С), 2 мл тительным хозяином для эукариотическйх 10 солей ОМЕ(37 С)и4млсолейДМЕс20 -ной векторов экспрессии настоящего изобрете- сывороткой плода коровы (37 С). Клетки зания. Однако в отличие от клеток 293 клетки тем помещают в инкубатор при 37 С, АЧ12 непосредственно отбирают метотрек- Все промывки и реакцйи осуществляесатом (200 — 500 нМ) при трансформации век- мые в отношении фильтров, проводят в тот тором, содержащим мышиный ген дгфр, Для 15 момент, когда фильтры находятся на ка юэк и спрессии тяжелои цепи необходимо щейся платформе. Фильтры вначале блокитрансформироватьклетки АЧ12любым век- руют инкубированием при комнатной тором экспрессии, который кодирует тяже- температуре в 5 -ном молоке в pBS. Затем лую цепь. Однако тяжелая цепь не будет фильтры промывают(5 мин промывка) четысекретировать в надосадочный слой, если 20 ре раза в PBS, 10 мкг/мл биотинилированклетки AV12 не будут совместно трансфор- ного козлиного античеловеческого мироваться вектором, кодирующим легкую тяже*лоцепйого (Вектор Лабораториез, цепь. Легкие цепи будут секретировать из Инк.,30 Ингоулд Rd., Берлингэйм, Калифорклеток хозяина после трансформации век- ния 94010) в 2,5 -ном бычьем сывороточтором,кодирующимлегкиецепи.Такимобра- 25 ном альбумине прибавляют к фильтру (в зом, путем совместной трансформации и достаточном количестве с тем, чтобы поселекции клеток AV12 экспрессированы раз- крыть фильтр), который затем инкубируют личные комбинации легких и тяжелых цепей. при 37 С в течение 1 ч.

Для исследования получения полностью со- Поликлональное антитело можно полбранного секретируемого иммуноглобулина 30 учить методом, описанным в структурных необходимо таким образом исследовать при- концепциях в иммунологии и иммунохимии сутствие секретируемой тяжелой цепи. Е,А.Кабатом; опубликованы в 1968 году ХолПример 21. Исследование получения том, Ринехартом и Уинстоном. Моноклональное антитело, которое также пригодно для

Метотрексатустойчивые трансформан- 35 использования в анализе, можно получить, ты, полученные в примере 17, выращивают как раскрыто в работе Кеглера и Милстейна, на 100 м чашках для культивирования тка- 1975, Нэйчур, 256, 495 или, как раскрыто в невой культуры при плотности несколько патенте США М 4696895, Европатенте М сотен клеточных клонов на чашку для куль- 205046; Лауреллом и др., 1985, FEBS 191/1): тивирования тканевой культуры, Среды де- 40 75, Сузуки и др, 1985, J. Blocheò 97:127 — 138 кантируют и клетки промывают дважды 5 и Европатенте N 138222. Авидин Д и биотимл-аликвотами раствора сбалансированных нилированную пероксидазу ложечницы присолей Хэнка (Гибко). Раствор стерильного морской (НЯ Р) используемые в а

045 - ог ! в анализе, -ного агара (агароза типа 4 Сигма, ка- получают в оборудовании Вектастаин ТМ таложный номерА3643, Сигма Кемикал Ком- 45 (вектор Лабораториез, Инк.), Биотин также пани, P,О, Бокс 14508, Сент-Луис, Мисмури получают из Вектор Лабораториез И

63178) и о нк.

63 78) получают смешиванием 1 мл 1,8" - . Фильтры промывают четыре раза PBS ного агара (47оС) с 3 мл Дульбекко модифи- при 4 С. Затем получают авидин D и биотицированной соли Игл (Д МЕ)(Гибко) (37 С).и нилированную пероксидазу ложечницы

2 мл этого 0,45 -ного arapoeoro раствора 50 приморской и прибавляют, как описано в наслаивания вокруг клеток, руководстве изготовителей в оборудовании

Нитроцеллюлозные фильтры (Шлейшер Вектастаин TM(Вектор Лабораториез, Инк). энд Шуелл, Инк., Киин, Нью-Гемпшир Фильтры инкубируют HRP-сопряженным

03431) кипятят и затем автоклавируют 2 ч авидином 0 в течение 1 ч при 4ОC (более для удаления смачивающего вещества, ко- 55 длительные периоды инкубирования, т.е, в торое является токсичным для клеток. Филь- течение ночи, могут быть использованы в тры затем помещают поверх агарового слоя том случае, когда секретирует небольшое и после удаления пузырьков воздуха чашки количество протеина); затем фильтры проинкубируют при 37 С втечение 1 — 3 ч. Филь- мывают 4 раза в PBS при 4ОC. тры, ранее меченые для того, чтобы указать

1780541

79

Gln Ile Gln Leu

Val Gln Ser Gly Pro Clu

Ile Ser Суе Ьуе Als Яег

Asn Trp Val Lys Cln Thr

Trp Ile Asn Thr Tyr ТЬг

Ьув Gly Аге РЬе Al ° Phe

Phe Leu Cln Ile Cln С1е

Tyr РЬе Суе Val ArS Phe

Cly Thr Ser Val Thr Val

Сее Lys

Gly Tyr

Pro G1y

С1у Glu

Lys Рге Cly Glu

Thr РЬе Thr Aso

ТЬг Val Lys

Тег Gly 21st

Тгр tlat Gly

Агр Asp Phe

Lys Gly

Pro Thr

Ьеи Lys

Tyr Аlа

Ser Leu

Pro Gln

Ile Ser

Ser Ser

Clu ТЬг $ег Ala

Ser Thr Ala

Net Al ° ТЬг

Аее Bet Аге ТЬг

Lys Gly Asp Туг Trp Gly Cln

-7СОСЬр

Ест HI

СН2А81(33

Ec0 RI

iб III

-6000 Ьр

8am HI

СИ2А5! 04- ф и г

Для проявления индикаторного цвета на фильтрах около 30 мг HRP — цветопроявляющего реагента (4-хлор-1-нафтол, Сигма), растворенного в охлажденном на льду

100 -ном метаноле прибавляют к 50 мл 5

РВ$ и 30 мкл 30 -ного раствора Нг02. Эту смесь прибавляют к нитроцеллюлозным фильтрам, которые инкубируют при комнатной температуре до проявления цвета. Колонии, секретирующие наибольшую часть 10 антитела изобретения, отмечаются на фильтрах не только посредством наиболее раннего появления цвета, но также посредством более темных пятен на фильтре.

После появления цвета фильтры вновь 15 перегруппируют с первоначальными чашками для определения того, какие колонии ассоциируются с какими пятнами на фильтре.

Колонии, секретирующие большую часть антитела, затем отбирают и используют для 20 получения антитела.

Специалист поймет., что приведенный анализ является только иллюстративным атрибутом способа идентификации высокосекретирующих линий клеток. B способе 25 можно также использовать целый ряд методик анализа, например реакцию двойного

Есо RI антитела можно испольэовать таким образом, что биотинилированное козлиное античеловеческое тяжелоцепочечное антитело замещают козлиной античеловеческой тяжелой цепью (IgG) и биотинилированным антикозлиным IgG антителом.

Формула изобретения

Способ экспрессии цепей химерного антитела, заключающийся в том, что конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК

pPI-HD, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела RS1/4-антигена с аминокислотной последовательностью: полученной плазмидой трансформируют штамм культивируемых эмбриональных клеток почки человека, зараженных вирусом типа 5, и культивируют.

1780541

Plug Цт

BI

Нра П

Р о П

PvU П

BBAl HE

Pv

Sal I Рог. 2 р„„п Bam

) BamHI

Hind Ш

HI

Sal I

Pvu П

Pvu II

em HI

8а! l

Stu1 в

Hind 1

Асс I

uI

Асс

AccI

uI, Sst I

am HI

BtU

Sal I

Barn HI

Hind III

Рч

Hin

1780541

Hind?H BglII

EcoRI « «

Hind IП раХпее1

Уог. « п

Brna I .

Pvu П

Pat I

Hpa I

Bam НI о R1

1780541

Eco RI

Pst

Acc I

Есо RI

Pst

Nde I

Асс

Hind

Stu 1

1780541

Рог У

1780541

Pvu II

Jfde I/

NcI6 I

СИКС2 9.

Есо PË ц

Pvu

PstI

Hind III

Я1!Ват Hp

=.; Hind III

Hind Ш

ВПБат НХ

Bam HIlRI

Barn Н1/R I

Bcl I

Hind Ш

Bcl I

u IlPvu П

m HI

Кба Е

СИКС2 18

GAA A7A AAA CGT

Glu IIe Lys Arg — — ——

GAA АТА AAA GGT

Glu lie Lys Gly с;&с р. 1Г

1780541

Есо RI

Pst

Хва Ш

Есо RI

Sam Hi авБ

СЦ >А5

ХП1 П

Есо RI

84bp

o RI

pQKC231g

-5700 bp

-,133 bp со RI рС2А52

Составитель

Техред М.Моргентал Корректор Н КоРол

Редактор

Заказ 4445 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, yn,Гагарина, 101

Ш

nd! II

Sca I

Ш

Рчц I

Есо RI -435 bp