Способ определения витамина а в биологическом материале
Изобретение относится к аналитической химии. Цель изобретения - ускорение и упрощение анализа, а также повышение точности достигается тем, что экстракцию витамина А ведут при температуре 65-75°С в течение 6-10 мин двухкомпонентным экстрагентом при следующем соотношении ингредиентов , об.%: изопропиловый спирт 95,0-98,0; вода 5,0-2,0, а полученный экстракт анализируют на жидкостном хроматографе с использованием сорбента силасорб SPH Сш и элюента следующего состава, об.%: ацетонитрил - н-пропанол - вода 42:50:8. 3 ил., 4 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАPСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 4 О 0 (Л К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4879072/15 (22) 02.11.90 (46) 30.01.93. Бюл. ¹- 4 (71) Грозненский филиал Всесоюзного научно-исследовательского и проектно-конструкторского института биологической техники (72) А.С.Редчук, Е.Н.Киприянова, Г.И.Кузнецова, Е.С.Аушева, В.Н,Бабий и И.Ф.Рындюк (56) Susan К, Hendersen, Lucia А. McLean. Screening Method for Vitamins А and D in Fortified Skim Milk Chocolate Milk, and Vitamin D Liquid Concentrates. J.Assoc. Off. Anal, Chem. Vol,6, ¹ 6, 1979, р,1358-1360, Изобретение относится к аналитической химии, в частности к способам определения содержания витамина А в микрогранулированном препарате и премиксах. Определение витамина А возможно экстракционно-спектрофотометрическим методом по его собственному светопоглощению в УФ-области спектра. Известен и широко распространен фотометрический метод анализа витамина А, основанный на образовании окрашенных комплексных соединений, Соединения группы витамина А способны к образованию окрашенных продуктов реакции при взаимодействии с хлоридом сурьмы в хлороформе. Особенностью этой реакции является то, что относительная скорость распада окрашенного карбониевого иона очень высока и максимум интенсивности окрашивания наблюдается между 5-й и 10-й секундами от начала введения реагента. При замере оптической плотности позже 10-й секунды получаемые „„5U„„1790895 А1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА А В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ (57) Изобретение относится к аналитической химии. Цель изобретения — ускорение и упрощение анализа, а также повышение точности достигается тем, что экстракцию витамина А ведут при температуре 65 — 75 С в течение 6 — 10 мин двухкомпонентным экстрагентом при следующем соотношении ингредиентов, об.%: изопропиловый спирт 95,0-98,0; вода 5,0-2,0, а полученный экстракт анализируют на жидкостном хроматографе с использованием сорбента силасорб SPH С в и элюента следующего состава, об.%; ацетонитрил — н-пропанол— вода 42:50:8. 3 ил., 4 табл. результаты занижены, т.е. резко снижается точность измерения. Неустойчивость окраски комплексного соединения — существенныйй недостаток дан ного метода, затрудняющий его практическое использование. Известны также хроматографические способы определения витамина А в различных биологических обьектах. Наиболее близким по технической сущности к изобретению является способ определения содержания витамина А в молоке, заключающийся в извлечении витамина А из молока и хроматографическом анализе полученного экстракта. Извлечение витамина А осуществляется в несколько стадий. 1. Омыление или щелочной гидролиз образца, содержащего витамин А, проводится 80%-ным водным раствором гидроокиси калия в течение 20 мин. при температуре 80 С, при этом разрушаются примеси, мешающие 1790895 количественному определению витамина А (жиры, липиды и пр.). 2. Витамин А переводят из водного раствора омыленной смеси в органическую фазу с помощью гексана, Для повышения 5 чувствительности анализа гексановый экстракт витамина А упаривают досуха и сухой остаток растворяют в 0,1мл метанола. Полученный таким образом концентрат витамина А, очищенный от мешающих при- 10 месей, подвергается хроматографическому анализу, В качестве сорбента используют Vydac TPC1s, состав элюента следующий, об.%: ацетонитрил-метанол 90:10. Время, необходимое для выполнения анализа со- 15 ставляет 2-2,5 ч, Однако известный способ имеет следующие недостатки; сложность и длительность процесса экстракции витамина А за счет многостадий- 20 ности процесса и соответственно большие потери витамина; разрушение и изомеризация витамина А за счет его нестойкости в растворах и водных средах при нагревании в процессе 25 омыления; использование в составе элюента для хроматографирования метанола, являющегося сильным ядом, Целью изобретения является ускорение 30 и упрощение анализа, а также повышение точности определения витамина А. Это достигается тем, что в известном способе определения витамина А в микровите А кормовом и премиксах, заключаю- 35 щемся в извлечении витамина и анализе полученного экстракта методом жидкостной хроматографии, экстракцию ведут при температуре 65 — 75 С в течение 6 — 10 мин водным раствором изопропилового спирта 40 при следующем соотношении компонентов, об оу Изопропиловый спирт 95-98 Вода 5 — 2, а полученный экстрактанализируют на жид- 45 костном хроматографе с использованием сорбента силасорб SPHC>g и элюента — смеси ацетонитрила и спирта, причем в качестве спирта использован водный раствор н-пропанола при объемном соотношении: 50 ацетонитрил — н-пропанол — вода 42:50:8. На фиг.1 приведена хроматограмма раствора масляного препарата витамина А (ретинол-ацетат) в изопропиловом спирте; на фиг.2 и 3 — соответственно хроматограм- 55 мы экстрактов витамина А из микровита А и п реми кса. Способ определения витамина А в микровите А и в премиксах осуществляется следующим образом. Пример 1, Объект исследования— микровит А кормовой (далее микговит А), Навеску микровита А в количестве 0,02 г, взятую с точностью 0,0005 г, помещают в коническую колбу объемом 25 см, куда з наливают 10 см экстрагента, содержащего з изопропиловый спирт — 97,0 об. и воды 3,0 об,о, Колбу соединяют с обратным холодильником и помещают в водяную баню с температурой 75 С на 10 мин. Затем полученную смесь охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через фильтр Шотта. Фильтрат собирают в мерную колбу объемом 25 см . Коническую колбу и осадок з на фильтре тщательно промывают экстрагентом и раствор в колбе доводят до метки, Полученный раствор витамина А хроматографируют на жидкостном хроматографе "Милихром". Использована колонка 2 ммх80 мм, заполненная силасорбом ЯРНС18. В качестве элюента выбрана смесь ацетонитрил — н-пропанол — вода = = 42:50:8 (об.,) Измерения проводились с применением УФ-детектора на длине волны 328 нм, Объем пробы составлял 6 мкм, скорость подачи элюента через колонку— 200 мкл/мин, Время, затрачиваемое на анализ, включая экстракцию, составляет 4045 мин. Хроматограмма экстракта из микровита А приведена на фиг,2, Содержание витамина А в анализируемом экстракте определяют по калибровочному графику, который строится в координатах "высота хроматографического пика — содержание витамина А". Для построения калибровочного графика хроматографируют 5 — 6 растворов масляного раствора витамина А известных концентраций в изопропиловом спирте (фиг.1). Удерживаемый объем пика витамина А соответствует 345 мкл. На хроматограмме экстракта витамина А из микровита А (фиг.2) измеряют высоту пика, а затем по калибровочному графику определяют содержание витамина А в анализируемом экстракте. Для расчета содержания витамина А в микровите А используется формула Х= — у Сд (1) m где Х вЂ” содержание витамина А в анализируемом образце, МЕ/г; Сд — содержание витамина А в экстракте, определенное по калибровочному графику, МЕ; m — навеска анализируемого образца, г, Пример 2, Объект исследования— п ремикс, 1790895 Навеску премикса в количестве 5 r, взятую с точностью 0,0005 r, помещают в коническую колбу объемом 25 см, куда з наливают 15 см экстрагента, содержащего з изопропиловый спирт — 97,0 об. и воду— 3,0 об. /, Колбу соединяют с обратным холодильником и помещают в водяную баню с температурой 75 С на 10 мин. Затем полученную смесь охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через фильтр Шотта. Фильтрат собирают в мерную колбу объемом 25 см . Коническую колбу и осадок на фильтре промывают экстрагентом и раствор в колбе доводят до метки. Полученный экстракт хроматографируют на жидкостном хроматографе "Милихром" при следующих условиях, В качестве сорбента используют обращенную фазу силасорб SPH Сд. Элюент имеет состав, об. /: ацетонитрил— н-пропиловый спирт — вода 42:50:8. Измерения проводились с использованием УФ-детектора на длине волны 328 нм. Обьем пробы составлял 6 мкл, скорость подачи элюента 200 мкл/мин. Время анализа, включая экстракцию, не превышает 40— 45 мин, Хроматограмма экстракта из премикса П 5 — 1 приведена на фиг.3. Обработка полученных результатов и расчет содержания витамина А в премиксе выполняются так, как описано в примере 1, В табл,1 приведены данные, позволяющие оценить точность определения витамина А в премиксах, Для этого в лабораторных условиях готовились премиксы с точно известным содержанием витамина А, которое затем определялось так, как описано в примере 2, Из данных табл,1 следует, что относительное отклонение отдельного определения не превышает 7,8/. Причем, расхождения между параллельными определениями не превышает 4 — 5 отн./,. Согласно действующему в настоящее время ГОСТУ 26573.1-85. (Премиксы. Метод определения витамина А) эта величина может достигать 15 отн, /, С целью оптимизации условий экстракции витамина А из Микровита А и премиксов проводились специальные исследования состава экстрагента, времени и температуры экстракции, В табл.2 представлены результаты исследования влияния состава экстрагента на эффективность экстракции витамина А из Микровита А. Как видно из полученных результатов, при содержании воды в изопропиловом спирте менее 2,0 об. / наблюдается неполная экстракция, и количество неэкстрагированного витамина А составляет 9,7-22,9/. Это связано с тем, что оболочка Микровита А растворима в воде, но не растворима в органических растворителях, При малых концентрациях воды в экстрагенте гранулы Микровита А разрушаются недостаточно, и значительная часть витамина А остается внутри гранул. То есть в данном случае экстракция малоэффективна. Если концентрация воды в экстрагенте превышает 5,0 об., наблюдается существенное растворение полимерной оболочки гранул, и примеси переходят в раствор вместе с витамином А, появляются признаки образования коллоидной системы в виде слабой мути и осадка при хранении экстракта в течение нескольких часов. При этом наблюдается значитель-. ное снижение точности определения витамина на 10 — 11,5 . Начиная с концентрации воды в экстрагенте 9,0-10,0 об. /,, экстракт становится интенсивно мутным и далее не анализируется. В табл.3 и 4 приведены данные по влиянию температуры и времени экстракции витамина А из Микровита А. Использование температур ниже 65 С при условии, что состав экстрагента следующий, об. /: изопропиловый спирт — вода 97:3, а время экстракции 10 мин, не позволяет полностью экстрагировать витамин А. Доля неэкстрагированного витамина значительна — от 6,9/ и выше, При температуре экстракции выше 75 С активность витамина А резко снижается вследствие его разрушения. Так, при нагревании раствора втечение 10 мин при температуре 80 С количество определяемого витамина А на 11,6 / меньше его содержания в Микровите А, определенного по ТУ 64 — 05 — 130 — 76. Время экстракции 5 мин и ниже даже при максимальной температуре экстракции — 75 С при условии, что состав экстрагента следующий, об. /,: изопропиловый спирт — вода 97:3, не обеспечивает достаточно полного извлечения витамина А из микрогранул, Доля неэкстрагированного витамина А составляет 11,7 /. При увеличении времени экстракции до 15 мин и выше происходит разрушение витамина А, кроме того, в экстракт переходят компоненты оболочки гранул, раствор становится коллоидным и далее не анализируется. Поскольку витамин А в премиксы вводится в виде Микровита А, условия экстракции и получаемые результаты в процессе определения содержания витамина А в премиксах и Микровите А кормовом одинаковы. Использование предлагаемого способа по сравнению с прототипом позволяет зна1790895 Таблица 1 Таблица 2 Таблица 3 чительно упростить анализ, более чем вдвое уменьшить продолжительность анализа и повысить точность анализа в 2 раза за счет сокращения количества операций (с 3 до 1), что способствует уменьшению потерь исследуемого образца и параллельно с этим сокращению числа (от 7 до 4) и расхода (с 200 см до 25 см ) применяемых реактиз вов. Формула изобретения Способ определения витамина А в биологическом материале путем экстракции витамина из исследуемого материала с последующим жидкостным хроматографированием на сорбенте с использованием элюента — смеси ацетонитрила и спирта, о тл ича ющийсятем,что, сцельюповыше5 ния точности, а также ускорения и упрощения способа, экстракцию проводят 95-98О -ным водным раствором изопропилового спирта при температуре 65 — 75 С в течение 6-10 мин, а в качестве сорбента 10 используют силасорб SPHC>a, причем элюент в качестве спирта содержит водный раствор н-пропанола при объемном соотношении ацетонитрил;н-пропанол:вода, равном 42:50:8. 1790895 Таблица 4 0 I 2 3 4 Время, мин. Фиг.I 0 I 2 3 4 5 Время, мин. Фиг.2 0Т,2 3 4 Время, мин. Фиг.3 Редактор Заказ 106 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, )К-35, Раушская наб., 4/5 cd е Рг сб I о х Х (D о Составитель А.Седчук Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор И.Шулла Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ) 
