Способ концентрирования бактериальных спор
Область использования: микробиология , концентрирбвание сп6р,споровые вакцины , вакцина против сибирской язвы, Сущность изобретения: в суспензию спор вносят полиэтилёнимин до конечной концентрации 0,05.-6,1%. Проводят отстаива- Ние при температуре 1-15°С и рН 6,0-8,0. Время осаждения спор составляет 4-5 суток . Способ обеспечивает оптимальные услоёия дли сохранения жизнеспособности микроорганизмов. 1 табл.
(2 (4 (71 ин ро (7 ло 5
) 20,12.88
) 07.02.93. Бюл, N 5
) Всесоюзный научно-исследовательский титут ветеринарной вирусологии и микиологии
) И.А. Бэкулов, В.А. Гаврилов, l0 В. Чис, М.È. Калэбеков и А.В, Никитин
) J, Biol. Chemistry, 1981, v. 25б, р, Т557;
Авторское свидетельство СССР
835170, кл. С 12 N 1/02, 1983, () Ц
ТЕРИАЛЬНЫХ СПОР (57) Область использования; микробиология, концентрирование спор,споровые вакцины, вакцина против сибирской язвы.
Сущность изобретения: в суспензию спор вносят йолиэтиленимин до конечной кон. центрации 0,05.— 0,1 . Проводят отстаива- йие при температуре 1-15 С и рН 6,0-8,0.
Время осаждения спор составляет 4-5 суток. Способ обеспечивает оптимальные условия для сохранения жизнеспособности микроорганизмов, 1 табл.. Изобретение относится к биологическ и промышленности и может быть использо ано при изготовлении живых споровых ли филизированных вакцин и концентратов живых споровых жидких вакцин против бэкте иэльных болезней животных. !
В настоящее время при изготовлении живых споровых лиофилизированных вакцин для концентрирования спор применяют способ их осаждения путем отстаивания.
Осаждение бактериальных спор, полученных на плотных питательных средах и рэ успендированных в физиологическом растворе, проходит за 10 и более суток.
Осаждение спор, полученных суспензион ым способом в реакторе, проходит зйачи ельно дольше (более, чем зэ 35 суток), что об ясняется повышенной вязкостью жидко фазы, связанной с наличием в жидкости белкового субстрата — продукта лизиса бактериальных клеток и не утилизированных ко понентов питательной среды.
Поскольку биологическая пpoMbløëåнность переходит на более прогрессивный суспензионный способ изготовления вакцин; то такое длйтельное (более месяца) концейтрирование спорового материала использовать не технологично.
Нецелесообразно также применять из- 0 вестный способ концентрирования споро- 3 вого материала путем центрифугирования. К )
При центрифугировании, особенно больших 0 объемов споросодержащей жидкости, очень О трудно создать условия; при которы!х полностью исключались бы загрязнение отделяемых спор (полуфабриката вакцины) Ф микрофлорой. воздуха и выброс спорового материала во внешнюю среду.
Наиболее близким является способ концентрирования микроорганизмов малых размеров путем отстаивания с использованием белкового щелочного экстракта в качестве вспомогательного вещества.
К недостаткам этого способа относится то, что осаждение осуществляют в условиях
1792969 (температура 90 С и рН 3,0), которые являются губительными для живых микроорганизмов и поэтому данный способ невозможно йспользовать при изготовлении живых бактериальных вакцин.
Целью настоящего изобретения является повышение жизнеспособности микроорганизмов.
Поставленная цель достигается тем, что при отделении микроорганизмов от жидкой фазы, включающем осаждение с использованием вспомогательного вещества, в качестве вспомогательного вещества используют полиэтиленимин (-СН2 СН2ИН )> в оптималь-, ной концентрации 0,05 — 0,1%. Другое отличие состоит в том, что осаждение проводят при температуре 1 — 15 С, Кроме того, осаждение осуществляют при рН 6,0 — 8,0.
Пример 1. Суспензию, содержащую в 1 мл 215 млн жизнеспособных спор вакционнога сибиреязвенного штамма 55-ВНИИВВиМ, полученную в реакторе, имеющую рН 7,0 "= 0,2, разливают, соблюдая стерйль ность, в 2 двухлитровых.роллерных флакона по 2 литра в каждый. В один (опытный) флакон добавляют 10 мл 10%-ного водйого раствора полиэтиленимина (ПЗИ), простерилизованного при температуре 120 + 2 С в течение 30 минут, при этом концентрация
ПЭИ в споросодержащей жидкости составляет 0,05%. Второй флакон используют в качестве контрольного, Из контрольного флакона отбирают исходную пробу в количестве 1 мл и методом 10-кратных разведений в физиологическом растворе с последующим посевом разведенйй на чашки Петри с 2%-ным мясо -йептонным агаром, их инкубированием при 37 + 1 С е течение
20 — 24 часов и подсчетом выросших колоний определяют число жизнеспособных спор в
1 мл пробы, Оба флакона йомещают B холодильник при температуре 4 2 C, В течение 5 дней через каждые 24 часа из верхней, средней и нижней части опытного флакона отбирают пробы споровой суспензии в количестве 1 мл, обьединяют их в усредненную пробу, в которой определяют число жизнеспособных спор по методу, описанному выше. Таким же путем определяют число спор в пробах из контрольного флакона.
Полученные результаты отражены в таблице, Из данных табл. 1 видно, что в опытном флаконе после 4-дневного отстаивания в надосадке из 215 млн спор/мл осталось лишь 10 млн спор/мл, следовательно, остальные споры находились в осадке и их количество составило 95% от общего числа спор в суспензии. В последующие сутки процент спор в надосадке не увеличился, В контрольном флаконе в течение 5-дневного срока практически не было зарегистрировано осаждения спор, Его выдержали еще 30 дней в холодильнике, но и в этом случае в осадке оказалось не более 50% спор. причем осадок был неплотный и легко разбивался.
При сравнении внешнего вида суспензии после 4-дневного отстаивания в опытном и контрольном флаконах было зарегистрировано, что в опытном флаконе прошло хорошее осаждение бактериальных
15 спор — надосадок был почти прозрачный, а осадок плотный. В контрольном флаконе признаки осаждения не были выражены, По окончании осаждения (4 суток) из опытного флакона, соблюдая стерильность, 20 декантируют надосадок. Осадок в количестве 80-100 мл, содержащий 4-5 млрд жизнеспособных спор/мл, используют для изготовления кбнцентрата вакцины или для приготовления лиофилизированной вакцины против сибирской язвы животных.
В практике биопредприятий при осаждении бактериальных спор целесообразно использовать 18-литровые стерильные баллоны с сифонами для перекачивания жидко30 стей.
При добавлении в сйоровую суспензию
ПЗИ в количестве 0,1% осаждение бактериальных спор проходит так же хорошо, как и при добавлении 0,05%. После 4-дневного
35 осаждения при температуре 4 + 2 С в осадке находятся 95% спор.
При добавлении в споровую суспензию
ПЭИ в количестве 0,0125% и меньше или
0,4% и больше осаждение спор проходит
40 медленно. 3а 5 суток отстаивания при температуре 4 "= 2 С в осадке находятся меньше 30% бактериальных спор.
При использовании температуры 16 С и выше осаждение бактериальных спор не за45 медляется. Однако в этих условиях часть микроорганизмов может перейти из споровой в вегетативную форму, что является недопустимым при изготовлении вакцины.
При использовании температуры ниже
50 ООС происходит кристаллизация споровой суспензии, которая может привести к гибели части микроорганизмов.
При рН 5,0 или 9,0 осаждение бактериальных спор не замедляется. Однако кислая
55 или щелочная среда является неблагоприятным фактором и может привести к гибели части микроорганизмов.
Использование предлагаемого способа концентрирования бактериальных спор, по
1792969
Формула йзобретения
Способ концентрирования бактериаль1 х спор, включающий внесение в суспеню спор вспомогательного вещества с следующим отстаиванием полученной еси и отделением осадка, о т л и ч а юн з и с
Йзменение числа бактериальных спор в надосадке при отстаивании суспензии
1 !
1 !
1,.
Составитель В,Романова
Техред M.Mîðãåíòàë Корректор С.Пекарь
Pe актор
За, аз 482 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР.
113035, Москва, Ж-35, Раушскэя наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород. ул.Гагарина, 101
5 с авнению с существующими способами, о еспечивает следующие преимущества: а) в качестве вспомогательного вещества, применяемого для отделения спор от жидкой фазы, используют полиэтилени- 5 мин в оптимальной концентрации 0,05—
01оь, 1 15ОС; б) позволяет проводить концентрирован е бактериальных спор при температуре !
У в) дает возможность осуществлять отделение спор от жидкой фазы при рН 6,0-8,0; г) позволяет получать в стерильных условиях из споросодержащей жидкости концентрированный споровой материал— полуфабрикат для изготовления лиофилизированных вакцин или концентрата жидких вакцин; д) время осаждения бактериальных спор составляет 4-5 суток. шийся тем, что, с целью повйшения жизйеспособности микроорганизмов, в качестве вспомогательного вещества используют полизтиленимин, вйосят в суспензию до конечной концентрации 0,05 — 0,1, а отстаивание проводят при температуре 115 СирН6 — 8.
