Способ получения церулоплазмина
Использование: изобретение относится к медицине, а именно к технологии получения фермента крови человека - церулоплазмина, и может быть использовано при производстве медицинских препаратов. Цель изобретения сокращение числа стадий. Сущность изобретения заключается в гомогенизации III фракции по Кону отходов производства гамма-глобулина в растворе хлористого натрия, сорбции полученного гомогената на ДЭАЭ-целлюлозе, активизированной ионизирующим излучением, элюции 0,25 М раствором хлористого натрия, осаждении примесей смесью этилового спирта с хлороформом, центрифугировании, осаждении из надосадочной жидкости целевого продукта этиловым спиртом, растворении осадка, его стерилизующей фильтрации и лиофилизации. Положительный эффект заключается в сокращении одного этапа осаждения спиртом и растворения осадка.
Изобретение относится к технологии получения феpмента крови человека церулоплазмина и может быть использовано при производстве медицинских препаратов. Целью изобретения является сокращение числа стадий. Поставленная цель достигается путем использования в качестве сорбента активированной целлюлозы отечественного производства, которая позволяет осуществлять сорбцию и элюцию препарата без применения хроматографических колонок, что, с одной стороны, значительно упрощает процесс и сокращает время элюирования, а с другой исключает потери сорбента при элюировании и регенерации. Кроме того, применение указанного сорбента позволяет исключить из технологии стадию промежуточного осаждения церулоплазмина спиртом из элюата и окончательную очистку препарата осуществлять непосредственно после элюции 0,25 М раствором хлористого натрия. Сущность изобретения заключается в следующем. Отходы производства гамма-глобулина (фракции бета-глобулинов сыворотки крови) гомогенизируют в 0,05М раствора хлористого натрия), сорбируют церулоплазмин из полученного гомогената на активированной ДЕАЕ-целлюлозе при рН 6,3, освобождаются от балластных белков, промывая сорбент 0,12 М раствором хлористого натрия, элюируют церулоплазмин, помещая сорбент в сосуд с 0,25 М раствором хлористого натрия (при соотношении сорбента и элюата 2:1), доводят рН элюата до 5,2, температуру до 25оС, добавляют этиловый спирт и хлороформ до конечной концентрации соответственно 25 об. образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, доводят концентрацию спирта в центрифугате до 55 об. выдерживают на холоду 10 ч при минус 10оС, центрифугируют, осадок препарата подвергают растворению, стерилизующей фильтрации и лиофилизации. П р и м е р 1. 3 кг осадка III фракции по Кону плацентарной сыворотки гомогенизируют в 14 л охлажденного до 4оС 0,05 М раствора хлористого натрия, доводят рН гомогената до 6,3, в полученную суспензию добавляют 300 г активированной ДЭАЭ-целлюлозы. Смесь оставляют при слабом перемешивании на 18 ч при 4оС. Целлюлозу с сорбированным церулоплазмином отмывают от неспецифических белков в мешке из х/б ткани, помещая ее в сосуд с 5 л охлажденного до 4оС 0,12 М раствора хлористого натрия (последнюю процедуру проводят трижды до оптической плотности отмывшейся от сорбента суспензии балластных белков при длине волны 280 нм (Е 280) равной 0,100). Отмытую ДЭАЭ-целлюлозу с сорбированным на ней церулоплазмином в х/б мешке помещают на 1 ч в 0,5 л охлажденного до 4оС 0,25 М раствора хлористого натрия для десорбции церулоплазмина. Полученные 0,5 л элюата доводят раствором 1 н. соляной кислоты до рН 5,2 и производят доочистку препарата от липопротеидных примесей добавлением этилового спирта и хлороформа до конечной концентрации 25 и 4 об. соответственно. Смесь перемешивают 30 мин при 25оС и образовавшийся осадок липопротеидов отделяют центрифугированием в течение 1 ч при 3 тыс.об/мин. К полученному центрифугату добавляют при перемешивании этиловый спирт до конечной концентрации его в растворе 55 об. и оставляют для формирования осадка церулоплазмина при минус 10оС на 18 ч. Образовавшийся осадок получают центрифугированием при 3 тыс.об/мин в течение 1 ч. Получено 1,35 г осадка, который был растворен и подвергнут стерилизующей фильтрации и лиофилизации. Окончательный выход препарата в данном примера составляет 0,45 г церулоплазмина на 1 кг исходного сырья. Его оптический коэффициент 0,04. Биологическая активность 17 усл.ед. Препарат апирогенный. П р и м е р 2. 30 кг осадка III фракции по Кону плацентарной сыворотки гомогенизируют в 150 л охлажденного 0,05 М раствора хлористого натрия, рН 6,3, к гомогенату добавляют 3 кг активированной ДЭАЭ-целлюлозы, сорбцию осуществляют при слабом перемешивании на холоду (4оС) 18 ч. Целлюлозу помещают в х/б мешок и отмывают от сорбированных на ней неспецифицеских балластных белков, помещая его в сосуд с 50 л охлажденного 0,12 М хлористого натрия (эту процедуру повторяют трижды до оптической плотности отмывающейся от сорбента суспензии при длине волны 280 нм, равной 0,100). Отмытую ДЭАЭ-целлюлозу с сорбированным на ней церулоплазмином в х/б мешке на 1 ч помещают в сосуд с 1,5 л охлажденного 0,25 М хлористого натрия для десорбции церулоплазмина. Полученные 1,5 л элюата доводят раствором 1 н.HCl до рН 5,2, добавляют этиловый спирт и хлороформ до конечной концентрации в растворе до 25 и 4 об. соответственно. Смесь перемешивают 30 мин при 25оС, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием в течение 1 ч при 3 тыс. об/мин. К полученному центрифугату добавляют при перемешивании этиловый спирт до конечной концентрации его в раствора 55 об. и оставляют для формирования осадка церулоплазмина при минус 10оС на 18 ч. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при 3 тыс.об/мин в течение 1 ч. Получили 15 г осадка церуплазмина, который был растворен и подвергнут стерилизации и лиофилизации. Выход препарата церулоплазмина в данном примере 0,5 г на 1 кг исходного сырья. Оптический коэффициент Е 610/280 равен 0,042. Биологическая активность препарата составляла 17 усл.ед. Препарат апирогенен. Преимущества заявляемого способа следующие: использование активированной целлюлозы, что значительно упрощает стадию освобождения сорбированного на ней церулоплазмина от сопутствующих балластных белков, имеющих близкую сорбционную способность; осуществление элюции препарата церулоплазмина без применения хроматогрфических колонок, с одной стороны, значительно упрощает процесс и время элюирования, а с другой исключает потерю сорбента при элюировании и регенерации; проведение элюции церуплоплазмина 0,25 М раствором хлористого натрия позволяет исключить из технологии промежуточную стадию осаждения препарата этанолом, что значительно упрощает и удешевляет технологию получения препарата церулоплазмина.
Формула изобретения
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА путем гомогенизации Ш фракции по Кону отходов производства гамма-глобулина в растворе хлористого натрия, сорбции полученного гомогената на ДЭАЭ-целлюлозе, элюции, осаждении примесей смесью этилового спирта и хлороформа, отделении их центрифугированием, осаждении из надосадочной жидкости целевого продукта этиловым спиртом, растворении осадка, стерилизующей фильтрации и лиофилизации, отличающаяся тем, что, с целью сокращения числа стадий, сорбцию проводят на ДЭАЭ-целлюлозе, активированной ионизирующим излучением высоких энергий непосредственно после гомогенизации в растворе хлористого натрия, а элюцию 0,25 мл раствором хлористого натрия.MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Номер и год публикации бюллетеня: 29-2000
Извещение опубликовано: 20.10.2000
