Способ получения ферментных препаратов

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советскит

Ссциалистическиз

Республик

Зависимый от ¹

Кл. 6а, 11/04

Заявлено 29Л 1.1965 (№ 101?366)28-13) ( с присоединением заявки ¹

МГ! К С 12k

Приоритет

Опубликовано 15.Ъ 111.1967. Бюллетень ¹ 17

Дата опубликования описания 24.Х.1967

Комитет по делам изобретений и отнрытик при Совете Министров

СССР

УДК 663.11:576.8.093.1 (088.8) Автор изобретения

Иностранец

Эунике Джин Напиер (Англия) Иностранная фирма

«Глаксо Лабораториз Лимитед» (Англия) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНЬ!Х ПРЕПАРАТОВ

Известны способы получения ферментных препаратов путем культивирования продуцирующих их микроорганизмов на питательной среде, содержащей источники азота, с добавлением других питательных веществ, например углеводов и минеральных солей, необходимых для роста, при температуре 20 — 35 С в аэробных условиях с последующим выделением ферментных препаратов из биомассы одним из известных способов, например высаливанием сульфатом аммония, адсорбцией, высушиванием культуральной жидкости.

Согласно предлагаемому способу получают препараты с высокой активностью, содержащие протеолитические ферменты, способные к расщеплению кератина, в сочетании с ламинариназой, хитиназой, эластазой и липазой. Для этого в качестве продуцирующих микроорганизмов используют бактерии рода Цитофага (Cytofaga) «NCIB 9497».

Предлагаемый способ заключается в следующем.

Культуру бактерии рода Цитофага (Cytnfaga) «NCIB 9497» выращивают на питательной среде поверхностным способом или глубинным в аэробных условиях.

Применяемая культура бактерий имеет cJIE.дующую характеристику.

Морфология. Неподвижные, короткие, прямые палочки, довольно тонкие, стороны параллельны. концы закруглены, разделены, а иногда спарены между собой. Окрашивают по

Граму после выдерживанпя на питательном агаре в течение трех дней при 20 С. Грам— отрицательные, короткие. прямые палочки с параллельными сторонами, концы закруглены, внешний вид окраски — неровные полоски.

Аналогичный внешний вид имеют при выращивании на агаре, содержащем пептон и глю10 козу. Окрашивапие однородно после культивирования на кровяном агаре.

Рост на различных средах. На агаре (четырехдневное культивирование при 20 С) —— светло-желтые, просвечивают, округлой фор15 мы, выпуклые, полностью гладкие, лоснящиеся, 1 — 1,5 мм в диаметре, с острым запахом.

На агаре, пептоне и глюкозе (четырехдневное культивирование при 20 С) — светло-желтые, просвечивают, округлой формы, выпук20 лые, полностью гладкие, лоснящиеся, слизеподобны, 1 — 2,5 мм в диаметре. с острым запахом.

На кровяном arape (четырехдневное культивирование при 20 С) — серовато-желтые, 25 просвечивают, округлой формы, выпуклые, полностью гладкие, лоснящиеся, 1 — 1,5 мм в диаметре, с острым запахом.

На жидкой среде (двухдневное культивирование при 20 С) — рост незначительный, 30 очень слабая неоднородная замутненность, 201249 пазначительное липкое, тягучее «1 вязкое отложение. Слабый рост отмечался также при

30 С. -%, „,Ф- .

На в««де, содержащей пептон (двухдневное культивирование при 20 и 30 С) — рост незначительный, очень слабая неоднородная замутненность.

На воде, содержащей пептон и глюкозу (двухдневное культивирование при 20 и

30 С) — умеренный рост, слабая, неоднородная замутненность.

Зависимость между ростом и температурой.

При температуре 5 или 10 С роста не наблюдается. Недостаточный рост при 37 С. Отсутствует чувствительность к пенициллину и 15 стрептомицину. Чувствительность к хлорамфениколу и гидротетрациклину. Не вызывает образования кислоты или газообразных продуктов в результате воздействия на глюкозу, мальтозу, маннитол или крахмал при 20 или

30 С. Отсутствует реакция в среде по Хь«огу и Лейфсону, содержащей глюкозу.

Лакмусовое молоко пептонизируется, а и.:дикатор восстанавливается при 20 С и пептонизируется при 30 С. 5Келати««у разжижает при

20 С. Оксидаза,по Коваку положительна при

20 и 30 С. Образования индола не происходит, метил-кр асный отрицателен, ацетометилкарбинол не вырабатывается, аммиак выделяется ЗО из пептона при температурах 20 и 30 С. Цитрат утилизируется как источник углерода в виде золя при 20 и 30 С. Образования липазы или лецитиназы на агаре, содержащем желток куриного яйца, не наблюдается при 20 или З5

30 С.

Питательные среды, используемые для культивирования, содержат главным образом источник азота с добавлением в случае необходимости углевода H (или) питательных со- 40 лей. К числу источников азота относятся солодовый экстракт, мясной экстракт, пептон, замочная жидкость кукурузы или зерна, одна. ко, наиболее пригодным источником азота является мицелий, полученный как отход в про- 45 изводстве антибиотиков. При этом необходимо отметить, что источник азота может полностью удовлетворить потребность выращивасмого организма Цитофага «NCIB 9497» в углероде или в других питательных солях без 50 их добавления. Так, например, данный микроорганизм сможет развиваться «a среде, состоящей только из мясного экстракта и пептона. B некоторых случаях добавление углеводов, например глюкозы, мальтозы, оказывает- 55 ся необходимым.

К числу элементов, которые также могут оказаться необходимыми, относятся магний, железо и цинк.

Культивируют Ц итоф агу «NC I B 9497» и р и 60 температуре 20 — 35 С (оптимальной является температура 26 С), рН среды находится в пределах 5 — 8, предпочтительно 5,5 — 6.

Длительность процесса культивирования

20 — 50 час. б5

Ооразующу «осН K)льтуральную л«ож«:о или использовать непосредственно, или извлечь из нее ферментный комплекс одним из известных способов. Так, например, культуральную жидкость высушивают или осветляют (центрифугированием), после чего высушивают (можно методом вымораживания ), получая при этом неочищенный препарат.

Для получения очищенного препарата производят осаждение последнего ацетоном или высаливанием сульфатом аммония, или адсорбцией на каолине.

Полученный препарат содержит комплекс следующих ферментоь: протеазу, ламинариназу, хнтиназу, кератиназу, эластазу и липазу.

Зтот комплекс ферментов способен вызывать распад мицелия у различных грибковых организмов, например плесени рода Пенициллиум и Цефалоспориум.

Способность вызывать распад грибкового мицелия позволяет использовать вышеуказанный комплекс ферментов для уничтожения отходов мицелия после производства антибиотиков, особенно продуктов цефалоспорина.

Полученный при этом растворимый материал может быть использован как питательная среда для проведения последующих процессов ферментации. Степень, до которой ферментный комплекс воздействует на грибковый мицелий, зависит от видов мицелия в каждом конкретном случае.

Отм:ечалось кератиназное действие комплекса ферментов, который действует, по-видимому, на. волосы.

Способен разлагать желатину, казеин, воздействовать на кератин, причем действие его протекает быстро.

Данный комплекс можно использовать: в п зоизводстве хлебобулочных изделий; при изготовлении блюд из хлебных злаков (например, овсянка, кукурузные хлопья); для ускоренного созревания мяса с целью его размягчения; для защиты от охлаждения во время пивоварения; в производстве кормов для животных; в производстве протеиновых гидролизатов; для мягчения крупного кожевенного сырья и обезволашивания шкур; для удаления пятен по методу сухой чистки; для удаления шлихты с текстильных изделий; в медицине.

Пример 1. Конические колбы (250 ил), содержащие по 40 ял следующей среды, (%): мальтоза 4 солодовый экстракт 2,4 пелтон 1 дистиллированная вода — до 100.

Водороднь«й показатель рН 7 установлен гидратом окиси натрия. Среду инокулируют с помошью петли культурой микроорганизма.

Цитофага «NCIB 9497» и инкубируют при температуре 26 С. Содержимое колб перемешива201249

65 ют на аппарате путем возвратно-поступательного движения с амплитудой 5 см, деиствующей при 200 об/мин при температуре окружающей среды 26 С. Через два дня после начала инкубации культура характеризуется сильным литическим действием по отношению к Цефалоспориум акремониум (Бротцу)

« I M I — 49137».

Пример 2. Конические колбы (250 мл), содержащие 100 мл следующей среды, О : мясной экстракт 1 пептон 1 хлористый натрий 0,5.

Водородный показатель среды устанавливают до значения рН 8 добавлением гидрата скиси натрия, кипятят 1 час, фильтруют, доводят среду до рН 7,2 путем добавления соляной кислоты, инокулируют с помощью петли культурой микроорганизма Цитофага «NCIB

9497» и инкубируют при температуре 26 С.

Содержимое колб перемешивают на аппарате с возвратно-поступательным движением, с амплитудой 5 см, при 200 об/мин. Спустя один день после начала инкубации культура характеризуется сильным литическим действием по отношению к «К. акремониум».

Пример 3. 3 л среды следующего состава (стерилизована 30 мин при температуре

120 С), У: мицелий «К. акремониум», отжатый в сыром виде б кислый фосфорно-кислый калий вторичный 0,07 первичный 0,03 сернокислый магний 7Н О 0,05 сернокислое железо 7НО 0,001 сернокислый цинк 7Н О 0,001 глюкоза (стерилизована отдельно) 0,25.

Инокулируют 60 мл хорошо разросшейся культуры микроорганизма Цитофага «NCIB

9497». Культуру выдерживают при температуре 26 С, перемешивают при 550 об/мин и аэрируют путем пропускания воздуха со скоростью

3 л/мин в течение 20 час, затем следующие

4 час — со скоростью 1 л/мин и в заключение 2 час — со скоростью 0,5 л/мин.

Культуру осветляют центрифугированием и всплывшую жидкость лиофизуют. Получают

6,6 г твердого вещества кремовой окраски, о6ладающего литической активностью по отношению к «К. акремониум» и протеолитической активностью по отношению к казеину.

Пример 4. 1,5 л жидкой культуры, выращенной, как указано в примере 3, центрифугируют, доводят среду до рН 6,1 добавлением уксусной кислоты и затем концентрируют в вакууме при температуре ниже 40 С до объема 250 мл. Концентрат медленно добавляют к 2 л ацетона, охлажденного до +5 С, при энергичном перемешивании. Продукт светлокоричневой окраски в количестве 7,4 г промывают ацегоном и высушивают над пятиокисью фосфора. Полученный продукт характеризуется высокой активностью.

Пример 5. 2 л жидкой культуры, выращенной, как указано в примере 3, освобождают от твердых примесей центрифугированием и затем медленно выливают при перемешивании в 20 л ацетона, охлаждаемого льдом. Продукт отфильтровывают, промывают водой и высушивают над пятиокисью фосфора; вес продукта — 10 г. Продукт обладает полной активностью, присущей первоначальной жидкой среде.

Пример 6. Кусочки свежей телячьей шкуры погружают в I ОД -ный раствор ферментного препарата (полученного, как описано в примере 5) в буферной среде «Трис»

М/50 при рН 7. Выдерживают 18 час при температуре 37 С, после чего волосяной покров легко удаляют, осторожно соскребывая. Аналогичная обработка в буферной среде «Трис» без добавления приготовленного препарата оставляет волосяной покров таким же, каким он был до обработки.

Пример 7. Мицелий «Трихофитон рубрум» (один из грибков, вызывающих грибковое заболевание ног) приготовляют путем культивирования в сосуде, приспособленном для встряхивания в течение 24 час при температуре 26 С в среде, содержащей пептон и солодовый экстракт. Полученный мицелий отфильтровывают и суспендируют на уровне

0,2 /в в 0,2 /о-ном растворе заранее приготовленного ферментного препарата (полученного, как указано в примере 5) в буферной среде

«Трис» М/50 при значении рН 7. Мицелий полностью растворяется после трехчасовой выдержки при температуре 27 С.

Пример 8. Адсорбция ферментного препарата на каолине.

К 600 ял ферментационной жидкой среды, полученной, как указано в примере 4, добавляют 1,65 г каолина, затем отдельными порциями вносят 180 г сульфата аммония при механическом перемешивании до полного растворения. Смесь каолина с протеином отделяют фильтрованием, промывают водой и затем высушивают при комнатной температуре в вакуум-сушильном шкафу. Продукт весом

11,7 г обладает полной активностью. присущей первоначальной жидкой среде.

Предмет изобретения

Способ получения ферментных препаратов путем выращивания продуцирующих их микроорганизмов на питательной среде, содержащей источники азота, с добавлением других питательных веществ, необходимых для роста, например углеводов и минеральных солей, в аэробных условиях, с последующим выделением ферментных препаратов из полученной биомассы одним из известных способов, отличающийся тем, что, с целью получения препаратов с высокой активностью, содержащих протеолитические ферменты, способные к расщеплению кератина. а также лз201249

Составитель М. Андреева

Техред Т. П. Курилко

Редактор 3. Ыибаева

Корректоры: Л. В. Наделяева и В. В. Крылова

Заказ 3193/8 Тираж 535 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва. Центр, пр. Серова, д. 4

Типография, пр. Сапунова, 2 минариназу, хитиназу, эластазу и липазу, в качестве продуцируюших микроорганизмов ис8 пользуют бактерии рода Цитофага (Cytofaga)

t À «.ХГ1В 9497».