Сополимеры 2-метил-5-винилпиридина и n-винилпирролидона, обладающие иммуностимулирующим действием

 

Использование: в качестве иммуностимулирующих средств в медицине. Сущность изобретения: продукт: сополимеры 2-метил5-винилпиридина и N-винилпирролидона общей формулы . ШО-П где п 25-40, со средневяэкосной молекулярной массой М« 29000-45000; выход 20%; рН 10%-ного водного раствора 6,5- 7,5. Реагент 1; 2-метил-5-винилпиридин, Реагент 2: N-виниллирролидон. Условия реакции: нагревание при 65-70°С в присутствии динитрила азо-бис-изомэсляной кислоты , Н202 и ц-СбНе при поддержании мольного соотношения реагентов 1 и 2 - -1:32-65. 8 табл., 3 пр. 70 с

(51) 5

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ сн -сн

Ф сн -сн

N сн

0-И сн -сн

2 i

N сн;сн

4 сн

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5054762/05 (22) 16.07.92 (46) 15.02.93. Бюл, М 6 (71) Фармацевтическая фирма "Ковидон"(72) С.А,Кедик, Е.К.Федоров, В.И.Свергун, В.А. Гаврилов и М, М.Зубаиров (73) Фармацевтическая фирма "Ковидон" (56) 1. Авторское свидетельство СССР

N 1578143,кл. С 08 F 226/10, 1988.

2. Машковский М,Д, Лекарственные средства. М,: Медицина, ч. 2, 1987, с. 182-3

3. Машковский М.Д, Лекарственные средства. М.: Медицина, ч. 2, 1967, с. 62.

4. Международная заявка М 87/03587, кл. С 07 О 215/56, опублик. 1987, (54) СОПОЛИМЕРЫ 2-МЕТИЛ-5-ВИНИЛПИРИДИНА И N-ВИНИЛПИРРОЛИДОНА, ОБЛАДАЮЩИЕ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ (57) Использование; в качестве иммуностимулирующих средств в медицине. Сущность изобретения; продукт: сополимеры 2-метилИзобретение относится к области химии полимеров, а именно к новым биологически активным химическим соединениям— соп ол имерам 2-метил-5-винил пиридина и

N-винилпирролидона общей формулы 1 где n = 25-40 со средневязкостной молекулярной массой М =29000-45000 дальтон, обладающим иммуностимулирующим действием.

Указанное свойство позволяет предполагать возможность использования соедиRU 2000004 С

5-винилпиридина и N-винилпирролидона общей формулы где n = 25-40, со средневязкосной молекулярной массой М27 -29000-45000; выход

20%; рН 10%-ного водного раствора = 6,57,5. Реагент 1: 2-метил-5-винилпиридин, Реагент 2: N-винилпирролидон. Условия реакции: нагревание при 65-70 С в присутствии динитрила азо-бис-изомасляной кислоты, Н202 и ц-С6Н6 при поддержании мольного соотношения реагентов 1 и 2 =-1:32-65. 8 табл., 3 пр. нений общей формулы 1 в медицине и сельском хозяйстве.

Известен сополимер 5-изопропенилтетрахлорэ и N-винилпирролидона, обладающей свойствами иммуноадьюванта, поверхностного антигена вирусного гепатита В (1).

Сущностью изобретения являются новые сополимеры 2-метил-5-винилпиридина и N-винилпирролидона, обладающие иммуностимулирующим действием, Соединения общей формулы 1 получают радиальной сополимеризацией 2-метил-5винилпиридина(2-M-5-ВП)и N-винилпирролидона(М-ВПД) в присутствии с качестве инициатора сополимеризации азо бис-изо2000004 масляной кислоты и в качестве регулятора молекулярной массы пероксида водорода и циклогексанэ, причем процесс ведут при начальном мольном соотношении 2-метил-5винилпиридин: N-винилпирролидон, равном

1:32-65 соответственно, с последующим добавлением расходующихся мономеров в количестве, необходимом для поддержания мольного соотношения 2-метил >-винилпиридин: N-винилпирролидон, равном 1;32-65 соответственно, и целевой продукт выделяют путем осаждения в диэтиловый эфир, Ввиду большого различия в константах сополимеризации г 2-М-5-ВП/г N-ВПД

-300 2-метил-5-винилпиридин быстро расходуется в процессе сополимеризации.

Синтез сополимера заданного состава обеспечивают поддержанием постоянного соотношения 2-М-5-8П и N-ВПД путем компенсации расходующихся в процессе синтеза мономеров подпиточной смесью, содержащей 25-40 2-М-5-ВП и 60-757(, NВПД. Объем пропиточной смеси, подаваемой в реактор, вычисляют каждые 20 мин по результатам анализа отношения концентраций мономеров в реакционной смеси. По достижении около 20 конверсии по мономерам реакционную смесь охлаждают до

20 С и осаждают в диэтиловый эфир.

Строение полученных образцов сополимеров общей формулы 1 доказано определением состава (количество пиридиновых звеньев, определенное метоздом неводного титрования) и спектрами ЯМР С. Для определения молеку1 лярно-массового распределения MMP сополимера использован метод эксклюзионной хроматографии в сочетании с малоугловым лазерным рассеиванием света и дифференциальной капиллярной вискозиметрией, Примеры, приведенные ниже, иллюстрирую-, изобретение, В примерах используют 2-М-5-8П с содержанием основного вещества 95-96 (d =

=0.956) и N-ВПД с содержанием основного вещества 98,5-99,5 (d = 1,040).

Пример 1. Получение сополимера

2-метил-5-винилпиридина и N-винилпирролидона (и = 35) (Соединение 1).

В реактор загружают исходную реакционную смесь, содержащую 2,4 л (2500 r) Nвинилпирролидона, 80 мл (76,5 r)

2-метил-5-винилпирилидина, 14 мл 30ф,-ного водного раствора пероксида водорода

250 мл циклогексана и 10 r динитрила азобис-изомаслянной кислоты (АДН). Содержание мономеров в реакционной смеси анализируют хроматографически, Реакционную массу нагревают до 65-700С и при поддержании этой температуры в реактор

20 подают подпиточную смесь, содержащую

384 г (65 мол ) N-ВПД. 238 г (35 мол 6)

2-M-5-8П, 2,5 r АДН и 5 ил 30 -ного водного раствора Нг02. Затем реакционную смесь охлаждают и осаждают в диэтиловый эфир, После осажденного продукта В СНС!з переосаживают в диэтиловый эфир. Целевой продукт промывают на фильтре 2 л диэтилового эфира, сушат при атмосферном давлении при 40-60 С с последующей суш кой при

80-90 С в вакуумном сушильном шкафу.

Получают 560 г соединения 1.

П р и и е р 2. Получение сополимера

2-метил-5-винилпиридинэ и N-винилпирролидона (и - 25) (Соед 1нение 2).

В реактор загружают исходную реакционную смесь, содержащую 2,4 л (2,500 г)

N-винилпирролидона, 44 мл (42 г) 2-метил-5винилпиридина, 15 мл 30 (,-ного водного раствора Н202. 250 мл циклогексана и 10 г динитрила аэо-бис-изомасляной кислоты (АДН). После нагревания реакционной смеси до 65-70 С в нее в течение 5,5 ч подают подпиточную смесь, содержащую 450 г (75

25 мол. ) N-ВПД, 172 г (25 мол.$) 2-М-5-8П, 2,5 r АДН и 5 мл 30 -ного водного раствора

НгОг. Затем реакционную смесь охлаждают и далее перерабатывают как в примере 1.

Получают 565 г соединения 2, Пример 3. Получение сополимера

2-метил-5-винилпиридина и N-винилпирролидона (и = 31) (Соединение 3).

В реактор загружают исходную реакционную смесь, содержащую 2,4 л (2500 л) N35 винилпирролидона, 62 мл (59,6 r)

2-метил-5-винилпиридина, 14 мл 307;-ного водного раствора Н202 250 мл циклогексана и 10 г аэо-бис-изомасляной кислоты (АДН). После нагревания реакционной сме40 си до 65-70 С в нее в течение 5,5 ч подают пропиточную смесь, содержащую 410 г (69 мол.$) N-ВПД, 212 г (31 мол, ) 2-M-5-ВП, 2,5 г АДН и 5 мл 30 -ного водного раствора

Н О . Затем реакционную смесь охлаждают

45 и далее перерабатывают как в примере 1, Получают 562 r соединения 3.

Пример 4. Получение сополимера

2-метил-5-винилпиридина и N-винилпирролидона (и = 40) (Соединение 4).

В реактор загружают исходную реакционную смесь, содержащую 2,4 (2500 г) N-винилпирролидона, 100 мл (95,8 г)

2-метил-5-винилпиридина, 14 мл 30 -ного раствора НгОг, 250 мл циклогексана и 10 г

55 динитрила эзо-бис-изомасляной кислоты (АДН). После нагревания реакционной смеси до 65-700С в нее в течение 5,5 ч подают подпиточную смесь, содержащую 352 r (60 мол.ф N-ВПД, 270 г (40 мол. ) 2-М-5-ВП, .2,5 r АДН и 5 мл 30 (,-ного водного раствора

2000004

2,5 г АДН и 5 мл 30)6-ного водного раствора

НрО, затем реакционную смесь охлаждают и далее перерабатывают как в примере 1.

Получают 558 г соединения 4, Все полученные по примерам 1-4 продук1ы представляют собой аморфный порошок белого цвета, Они растворимы в воде, рН 10 -ного водного раствора соединений

1-4 равен 6,5-7,5.

Характеристики полученных соединений представлены в таблице 1.

Биологические испытания, Определение острой токсичности соединений 1-4.

Испытание проводили на здоровых мышах гибридах Fl (CBA х С57В 1) весовых 18-20 г. Испытуемые соединения растворяли в стерильном растворе. Тест-доза 0,4 мл 107ьного раствора в изотоническом NaCI. Время наблюдения 7 суток. Препарат считают выдержавшем испытание, если в течение предусмотренного наблюдения не погибнет ни одна из 5 подопытных мышей. LDM для мышей установить не удалось, так как даже при дозе 5000 мг/кг не наблюдалось гибели мышей. Таким образом, соединения 1-4 можно отнести к нетоксичным веществам. Кроме того, установлено, что соединения 1-4 в дозе 500 мг/кг не вызывают раздражающего действия и выпадения волосяного покрова у белых мышей при подкожном введении.

Изучение иммуностимулирующего действия соединений

1-4 in vitro.

Иммуностимулирующее действие In

vitro изучали методом "Миграционной активности колонии образующихся клеток селезенки-эндогенное колонийобразование".

Для этого мышей облучали в кассетах по 30 мышей улучами цезия -137 экспозиционной дозой 600 рентген при мощности дозы 22,79 рА. Растворы в дозе 50 мг на мышь вводили подкожно в облас ь холки за 24 ч до облучения, Мышей убивали на 10 сутки. Извлекали селезенки и помещали в фиксатор Боэна.

Колонии подсчитывали визуально под лупой. Иммуностимулирующее действие полимеров учитывали по разнице в количестве колоний по сравнению с.контролем (физиологический раствор в дозе 0,5 мл). В качестве эталона сравнения использовали известный в медицинской практике иммуностимулятор — продигиозан (2), Результаты испытаний представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что все испытанные соединения 1-4 как и известный препарат продигиозан обладают выраженным иммуномодулирующим действием. Наиболее активным являетгя соединение 1, которпе как и продигиозан вызывает обраэовл ние более 35 колоний, т.е, сливной рост колоний, когда практически на всей поверхности селезенки наблюдаетсл

5 сплошное колонийобразование.

Изучение иммуностимулирующего действия In vitro.

Соединения 1 и 2 были подвергHvTht изучению на иммуностимулирующее действие

10 в опытах на животных. В опытах использовали следующие возбудители инфекционных болезней сельскохозяйственных животных: вирулентный вирус классической чумы..свиней (КЧС) в виде культуральной

15 жидкости с инфекционным титром 6,5-7,0

ККИД5о(культурально-клеточных инфицирующих доз) и возбудитель сибирской язвы в споровой и вегетативной формах.

Иммуностимулирующеее действие сое20 динений изучали на телятах и овцах при сибирской язве и подсвинках при классической чуме свиней.

Телятам (порода "черно-пестрая-, масса

140-150 кг) соединения вводили подкожно в

25 дозе 0,34 мг/кг в объеме 1 мл, содержащего

100 тыс. спор, овцам (порода "Прекос", масса 25-30 кг) в той же дозе в объеме 0,5 мл, содержащего 40 тыс. спор противосибиреязвенной вакцины из штамма "55". Под30 свинкам (порода "Белая крупная", масса

25-30, кг) вводили соединения внутримышечно в дозе 1 мг/кг в объеме 2 мл в смеси с инактивированной вакциной против классической чумы свиней. Контрольное зараже35 ние проводили на 1214 сутки, телята в дозе

200 млн. спор перорально в виде болюса, овец подкожно в дозе 1 млн, спор в объеме

0,5 мл вирулентным штаммом "76" возбудителя сибирской язвы. Подсвинков заражали

40 внутримышечно (в/м) вирулентным штаммом вируса классической чумы свиней в дозе 100 тыс. культурально-клеточных инфицирующих доэ в объеме 1 мл, Контро лем служили группы животных, которым

45 вводили те же дозы вакцины на физрастворе, и группы контроля вирулентности материалов, используемых для заражения, Результаты по изучению иммуностимулирующегодействия соединений в комплек50 се с противоязвенной вакциной из штамма

"55" в эксперименте на телятах представлены в таблице 3.

Из данных таблицы 3 видно, что соединения 1 и 2 в дозе 0,34 мг/кг массы при

55 единовременном введении с вакциной создают на 14 сутки после вакцинации напр»женный иммунитет у телят, тогда как введение вакцины на физрастворе в эти же сроки соэдает иммунитет только у 75,0 ь животных. Стандартная прививпч эя доза

2000004 вакцинй иэ штамма "55" для создания напряженного иммунитета должна содержать

2,5 х 10 спор, тогда как при применении

? соединения 1 и 2 1003>-ный иммунитет создается дозой 1 х 10 спор, т.е, в 250 раэ меньшей.

Результаты по изучению иммуностимулирующего действия соединений 1 и 2 в комплексе с антисибиреяэвенной вакциной в эксперименте на овцах предствлены в таблице 4.

Из данных таблицы 4 видно, что с помощью соединений 1 и 2 создать 100 -ный напряженный иммунитет удается дозой 4 х

10 спор, тогда как согласно инструкции по применению вакцины из штамма "55" одна прививочная доза должна содержать 1 х 10 спор, т.е. в 250 раз более высокой, Овцы 3 группы, которым вводили вакцину на физрастворе, все переболели с высокой температурой, наблюдался отказ от корма, воды и сильное угнетение. Из 12 голов пало 7.

Результаты изучения иммуностимулирующего действия соединения 1 на подсвинках при классической чуме свиней (КЧС) представлены в таблице 5.

Из данных таблицы 5 видно, что комбинированное применение соединения 1 и инактивированной вакцины против классической чумы свиней в дозе 2 мл создает напряженный иммунитет у всех привитых животных на 14 сутки после вакцины, тогда как двукратное введение данной вакцины.с интервалом 7 суток в дозе по 2 мл (общий объем 4 мл1 не создавало напряженного иммунитета, животные переболевали с температурной реакцией, наблюдали отказ от корма, что существенно влияет на получение привеса.

Следовательно, введение соединения 1 позволяет создать напряженный иммунитет при однократном введении с инактивированной вакциной в дозе 2 мл уже на 14 сутки после вакцинации, Соединение 1 обладает иммуностимулирующим действием при комбинированном применении как с живой вакциной (при сибирской язве). так и инактивированной вакциной (при классической чуме свиней).

Кроме того, было исследовано лечебнопрофилактическое и пролонгирую цее действие соединений 1, 2 и 3 в комплексе с химиопрепаратами и антибиотиками (при сибирской язве), так и инактивированной вакцины (при классической чуме свиней).

Кроме того, было исследовано лечебнои рофил а ктичес кое и и ролан гируе мое действие соединений 1, 2, и 3 в комплексе с химиопрепаратами и антибиотиками при сибирской язве на белых мышах и соедине5

55 ния 1 на овцах и кроликах. Овец заражали вирулентным штаммом "76" подкожно в дозе 1 млн. спор в объеме 0,2 мл. кроликов (масса 2,5-3,0 кг) — в той же дозе в объеме 1 мл, белых мышей в дозе 100 спор в объеме

0,2 мл. Комплекс препаратов вводили через

24 ч после заражения единовременно в суточной дозе в течение 7 суток. Комплекс соединения 1 с химиопрепаратами задавали с кормом за 1 сутки до заражения и в течение 10 суток после заражения единовременно в суточной дозе.

В качестве эталона сравнения испольэовали известный пролонгатор — экмолин (3).

Контролем служили группы животных, которым вводили антибиотики на физиологическом растворе.

Эффективность лечебно-профилактического и пролонгированного действия соединений в комплексе с антибиотиками и химиопрепаратами оценивали по проценту выживания и переболевания по сравнению с контролем. Специфичность гибели животных подтверждали патологоанатомическим обследованием и идентификацией возбудителя, Наличие постинфекционного иммунитета определяли по уровню нейтрализующих антител и реакцией на контрольное заражение.

Результаты по изучению лечебно-профилактического и пролонгирующего действия соединений 1 и 2 в комплексе с антибиотиками при сибирской язве на белых мышах при единовременном введении суточной дозы в течение 7 суток представлены в таблице 6.

Из данных таблицы 6 видно, что соединения 1-3 при введении в комплексе с антибиотиками в течение 7 суток защищают от гибели 80 мышей, зараженных возбудителем сибирской язвы, при 100 -ной гибели в контроле.

Результаты по изучению лечебного действия антибиотиков в комплексе с соединечием 1 по сравнению с антибиотиками, растворенными на физиологическом растворе, на овцах, зараженных возбудителем сибирской язвы, представлены в таблице 7.

Иэ данных таблицы 7 видно, что при лечении овец комплексом соединения 1 с антибиотиками тетрациклином и стрептомицином полностью отсутствовали клинические признаки болезни, тогда как при введении антибиотиков на физиологическом растворе у всех 3 голов овец 2-й группы наблюдали выраженную температурную реакцию, угнетение, отказ от корма. что существенно влияет на выход продукции животноводства.

2000004

СН -CH

2 1

СН

0-tl

Таблица 1

Характеристики полученных соединений

Результаты лечения бактериальных инфекций пушных зверей комплексом соединения 1 и антибиотиками ряда фторхинолона. а именно, 1 — этил-6-фтор-7(4-метил-1-пиперазинил)-1,4-дигидро-4-ок- 5 са-3- хинолинкарбоновой кислоты (соединение 4) (4) и ее фосфонуксуснокислой соли (соединение 5). на примере лечения сибирг.êoé язвы у кроликов представлены в таблице 8. 10

Иэ данных таблицы 8 видно. что в группах 1 и 2, где применяли в качестве пролонгатора соединение 1, так и в группах 3 и 4, где применяли экмолин. выжили по 17 кроликов из 20 при 100 (,-ной гибели в контра- 15 ле, что указывает на воэможность применения соединения 1 как пролонгатора в комплексе с антибиотиками нового поколения на основе фторхинолонов для лечения инфекционных болезней 20 бактериальной природы пушных зверей на примере лечения сибирской язвы у кроликов.

Все представленные данные по изучению иммуностимулирующего действия сое- 25 динений показывают:

Формула изобретения

Сополимеры 2-метил-5-винилпиридина и N-винилпирролидона общей формулы — соединения в дозе 0,34 мгlкг в комплексе с вакциной иэ штамма "55" обладают выраженным иммуностимулирующим действием при сибирской язве у животных (телята, овцы), что позволяет снизить дозу вакцины для создания напряженного иммунитета при сибирской язве в 250 раз; — комбинированное применение соединения 1 в дозе 1 мгlкг и инактивированной вакцины против классической чумы свиней создает напряженный иммунитет на 14 сутки после вакцинации и позволяет в 2 рээа уменьшить дозу и кратность введения вакцины„ — соединение 1 в дозе 4 мгlкг массы (овцы) и 10 мг/кг массы (кролики) в комплексе с антибиотиками обладают выраженным лечебным действием при сибирской язве.

Оно может быть использовано в качестве и р слон гатора.

Таким образом, сополимеры 2-метил-5винилпиридина и стимуляторов для использования в медицине и сельском хозяйстве. где и = 25-40, со средневязкостной мол.м М

=29000-45000 Д, обладающие иммуностимулирующим действием.

2000004

Продолжение табл.!

М „— средневесовая молекулярная масса;

М „— среднечисленная молекулярная масса.

Таблица 2

Результаты изучения иммуностимулирующего действия соединений 1-4 In vlrto

Продолжение табл.2

Таблица 3

Иммуностимулирующее действие соединений 1 и 2 при сибирской язве на телятах

Иммуностимулирующее действие соединений 3 и 2 FlpH сибирской язве на овцах

2000004

Продолжение табл.3

Таблица 4

Продолжение табл.4

2000004

Таблица 5

Иммуностимулирующее действие соединения 1 на подсвинках при К4С

Продолжение табл,5

Примечание:

ИНВАК вЂ” инактивированная вакцина; — температурная реакция, угнетение, отказ от корма

Таблица 6

Лечебное и пролонгирующее действие соединений 1-3 в комплексе с антибиотиками при сибирской язве на мышах

2000004

Продолжение табл.6

Таблица 7

Продолжение табл.7

Лечебное и пролонгирующее действие соединения 1 в комплексе с антибиотиками при сибирской язве нв овцах

2000004

Табл ица8

Лечебное действие соединения 1 и фторхинолонов при сибирской язве кроликов

Продолжение табл.8

Составитель П.Рождествин

Тех ред M. Moðãåíòàë Корректор С.Лисина

Редактор В,Трубченко

Тираж Подписное

НПО" Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, 4/5

Заказ 3039

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101