Амид -глицирризиновой кислоты с 6-амино-2-тио-урацилом, проявляющий анти-спид-активность

 

Использование: в качестве анти-СПИД - средства. Сущность: продукт: 3 - 0 - [ 2 - 0- ( b -D-глюкопиранозилуранол) - b - D - глюкопиранозилураноил] - ( 3 - b , 20 b) - 11,30 - диоксо - 30 - (N - 6 - амино - 2 - тио - урацил) - 30 - норолеан - 12 - ен, выход 65,2% т.пл. 198 - 200°С БФ C₄₆H₆₅N₃O₁₆S . Реагент 1: β -глицирризиновая кислота. Реагент 2: 6-амино-2-тиоурацил. Условия реакции: в среде сухого пиридина, в присутствии N,Nʹ-дициклогексилкарбодиимида. LD₅₀ 7 г/кг. 1 табл.

Изобретение относится к новому биологически активному соединению, конкретно к амиду β -глицирризиновой кислоты с 6-амино-2-тио-урацилом: 3-0-[2-0-(β -D-глюкопиранозилураноил)- β -D-глюкопиранозилураноил] -(3 β, 20 β)-11,30-диоксо-30-(N-6-амино-2-тио-урацил)-30-норолеан-12-ен фор- мулы I проявляющему анти-СПИД активность.

Указанное соединение и его свойства в литературе не описаны.

В настоящее время во всем мире интенсивно проводятся исследования по поиску средств лечения СПИДа. Известно уже более 50 препаратов, подавляющих репродукцию вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) in vitro [1]. Часть из этих соединений уже проходит клинические испытания на больных. Одним из таких препаратов является глицирризиновая кислота (ГК).

В 1987-88 гг. работами группы японских исследователей установлено, что ГК-соединение, присутствующее в водном экстракте корня солодки (Glycyrrhiza glabra) эффективно ингибирует репродукцию ВИЧ в культуре клеток [2, 3]. Показано также, что введение ГК в высоких дозах (800-1600 мг/день) больным СПИДом вызывает у них увеличение содержания Т4 лимфоцитов и снижение количества вирусного антигена [4].

Механизм антивирусного действия ГК до настоящего времени остается неустановленным. Предполагается, что одним из факторов может служить блокирование ГК протеинкиназы [5], фосфорилирование которой молекулы Т4 рецептора необходимо для связывания вируса с Т4 рецептором [6]. Установлено также, что ГК непосредственно препятствует связыванию ВИЧ с клеткой [5].

Однако, ГК малоэффективна как ингибитор репликации ВИЧ на хронически инфицированных клетках.

Целью изобретения является поиск новых соединений в ряду производных β -глицирризиновой кислоты (β -ГК), обладающих анти-СПИД активностью.

Цель достигается амидом β -ГК формулы (I), проявляющим анти-СПИД активность.

Фармакологические свойства соединения Противовирусная активность соединения (I) была изучена на модели первично инфицированных ВИЧ-1 лимфоидных клеток МТ-4. Раствор препарата в диметилсульфоксиде (ДМСО) (20 - 50 мг/кг) вносили в суспензию инфицированных ВИЧ-1 клеток до конечной концентрации препарата 500-1000 мкг/мл, ДМСО до конечной концентрации 0,5-2,0% . В предварительных опытах было установлено, что ДМСО в концентрациях 0,5-2,0% не блокирует репродукцию ВИЧ-1.

Об ингибировании репродукции ВИЧ-1 в клетках судили по снижению активности обратной транскриптазы и снижению накопления вирусного антигена (методом иммуноферментного анализа) в культуральной жидкости на 4 сутки культивирования по сравнению с контролем (без добавления препарата). Для сравнения использовали один из наиболее эффективных для лечения СПИДа препаратов - азидотимидин (АЗТ) [7], механизм действия которого связан с блокированием вирусной обратной транскриптазы и терминированием синтеза вирусной ДНК, и β -глицирризиновую кислоту (β -ГК), эффективно ингибирующую репродукцию ВИЧ-1 в клетках.

Основным недостатком АЗТ является его высокая токсичность [8].

Установлено, что исследованное соединение (I) эффективно ингибирует репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4 в концентрациях от 0,5 до 1,0 мг/мл. По уровню противовирусной активности амид (I) не уступает АЗТ и β -ГК в концентрации 1,0 мг/мл.

В отличие от АЗТ амид (I) оказывает менее выраженное токсичное действие на культуру клеток, причем снижение концентрации препарата приводит к исчезновению токсического воздействия на культуру клеток. Количество живых клеток в случае производного β-ГК ≈ в 8 раз выше (при концентрации 500 мкг/мл), чем в случае АЗТ и ≈ в 2,7 раз выше, чем в случае β -ГК в том же разведении.

Соединение (I) менее токсично, чем АЗТ. ЛД₅₀ амида (I) ≥ 7 г/кг.

Соединение относится к III классу малоопасных веществ.

Синтез амида (I) проводили путем обработки смеси β -глицирризиновой кислоты и 6-амино-2-тио-урацила в ДМФА - пиридине (5 : 1, v/v) N,N'-дициклогексилкарбодиимидом при 50-60^оС в течение 6 час. Продукт кристаллизовали из смеси ДМФА - Н₂О. Выход 65,2%.

Таким образом, предложено новое малоопасное производное β -глицирризиновой кислоты - амид с 6-амино-2-S-урацилом (I), эффективно ингибирующий репродукцию ВИЧ-1 in vitro (в культуре клеток МТ-4), менее токсичный, чем азидотимидин.

П р и м е р 1. Изучение анти-СПИД активности.

Противовирусная активность соединения I была изучена на модели первично инфицированных ВИЧ-1 лимфоидных клеток МТ-4. Раствор препарата в ДМСО (20 - 50 мг/мл) вносили в суспензию инфицированных ВИЧ-1 клеток до конечной концентрации препарата 500-1000 мкг/мл, ДМСО до конечной концентрации 0,5-2,0%. В предварительных опытах было установлено, что ДМСО в указанных концентрациях не блокирует репродукцию ВИЧ-1. Об ингибировании репродукции ВИЧ-1 в клетках судили по снижению активности обратной транскриптазы и снижению накопления вирусного антигена (методом иммуноферментного анализа) в культуральной жидкости на 4-е сутки культивирования по сравнению с контролем (без добавления препарата). В качестве препарата сравнения использовали один из наиболее эффективных для лечения СПИДа препаратов - азидотимидин (АЗТ), механизм действия которого связан с блокированием вирусной обратной транскриптазы и терминированием синтеза вирусной ДНК, и β -глицирризиновую кислоту (β -ГК), эффективно ингибирующую репродукцию ВИЧ-1 в клетках.

В таблице приведены результаты проведенных экспериментов. Установлено, что исследованное соединение (I) эффективно ингибирует репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток в концентрациях от 0,5 до 1,0 мг/кг. По уровню противовирусной активности соединение не уступает АЗТ и β -ГК в концентрации 1,0 мг/мл.

В отличие от АЗТ амид (I) оказывает менее выраженное токсическое действие на культуру клеток, причем снижение концентрации препарата приводит к исчезновению токсического воздействия на культуру клеток. Количество живых клеток в случае амида (I) ≈ в 8 раз больше (в разведении 500 мкг/мл), чем в случае АЗТ и ≈ в 2,7 раз выше, чем в случае β -ГК в том же разведении.

Таким образом, впервые установлена способность производного β -ГК - амида с 6-амино-2-S-урацилом (I) эффективно ингибировать репродукцию ВИЧ в культуре клеток.

П р и м е р 2. Получение амида (I).

К раствору 0,82 г (1 ммоль) глицирризиновой кислоты в 25 мл сухого ДМФА прибавляют 0,57 г (4 ммоль) 6-амино-2-S-урацила и 5 мл сухого пиридина, затем 0,7 г (3,4 ммоль) N,N'-дициклогексилкарбодиимида и перемешивают смесь при 50-60^оС в течение 6 час. Оставляют смесь на ночь при комнатной температуре, отфильтровывают осадок дициклогексилмочевины, фильтрат выливают в 200 мл холодной воды, подкисляют лимонной кислотой до рН ≈ 3 и отфильтровывают осадок амида (I), промывают его водой несколько раз, сушат на воздухе, затем при 110-120^оС. Получают 0,95 г (100%) целевого продукта, который кристаллизуют из ДМФА - воды. Выход 0,62 г (65,2%) амида (I), гомогенного по ТСХ (белый порошок). Т. пл. 198-200^оС, [ α]_D²⁰ = +20 - +25^oC (с = 0,02; диоксан). R_f = 0,52 - 0,55 (хлороформ-метанол-вода = 45 : 10 : 1).

ИК, ν, см^-1 (вазелиновое масло): 3600-3200 (ОН); 3328 (NH); 1720, 1700 (СООН); 1660, 1650 (С = 0); 1630, 1580 (пиримидин); 1540 (СОNH, амид II).

УФ, λ_max ^{диоксан} (lg ε): 247 нм (3,99).

Найдено, %: С 57,47; Н 6,87; N 3,58; S 3,88.

С₄₆Н₆₅N₃O₁₆S. Мол. м. 948,06.

Вычислено, %: C 58,27; H 6,91; N 4,43; S 3,38.

Формула изобретения

Амид β - глицирризиновой кислоты с 6-амино-2-тио-урацилом общей формулы где R₁= проявляющий анти-СПИД-активность.

РИСУНКИ

Рисунок 1