Способ получения антигенного препарата вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней

 

Применение: ветеринарная вирусология, в частности технология получения антигенных препаратов, и может быть использовано в научно-исследовательских институтах, на предприятиях биологической промышленности при производстве средств специфической диагностики /ТГС/. Сущность: способ получения иммобилизированного антигенного препарата вируса ТГС включает выращивание вируса ТГС в клеточных культурах для получения вируссодержащей культуральной жидкости, извлчение антигена путем замораживания - оттаивания и последующую адсорбцию антигена на частицах твердофазного носителя. В качестве носителя используют частицы высокодисперсного глинистого минерала - бентонита в форме 5%-ного геля из расчета 0,150 - 0,350 мг сухого вещества на 1 мл вируссодержащей культуральной среды /рН = 5,0 - 6,0/. Адсорбция в течение 40 мин. Комплекс вирус - сорбент в дальнейшем используют для приготовления биопрепаратов, предназначенных для перорального применения.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к технологии получения антигенных препаратов, и может быть использовано в научно-исследовательских институтах, на предприятих биологической промышленности при производстве средств специфической диагностики и профилактики против коронавируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС).

Известен способ производства вакцины против вируса ТГС, предусматривающий получение вируссодержащей жидкости, выделение антигена-протеина РА и добавление в полученную вакцину адъюванта Фрейнда или гидроксида алюминия.

Предлагаемый способ получения иммобилизированных антигенных препаратов на основе природного алюмосиликата-бентонита для производства диагностических и лечебно-профилактических средств против возбудителя ТГС устраняет вышеизложенные недостатки и имеет ряд преимуществ. Установлено, что по величине удельной сорбции вирусов бентонит превосходит все известные сорбенты. Поэтому в последнее время этот высокодисперсный минерал находит более широкое применение в биотехнологии и вирусологии. Известно использование бентонита в качестве компонента питательной среды для клеточных культур с целью выявления бляшкообразующих вирусов, для изучения генетических свойств популяций вирусов, а также для очистки природных и сточных вод от возбудителей вирусных инфекций. Данные о структуре поверхности и химическом составе природного алюмосиликата, его нетоксичности для животных, культур клеток и микроорганизмов, опыт широкого и длительного применения бентонита в различных отраслях сельского хозяйства, пищевой промышленности и медицине, его высокая устойчивость к воздействию физико-химических факторов среды, лиофилизации и высушиванию все это позволяет использовать бентонит для получения высококонцентрированного антигенного препарата коронавируса ТГС в его иммобилизированной на носителе форме (10¹⁰-10¹¹ БОЕ вируса на 1 г. сорбента).

Технический результат предлагаемого способа по сравнению с известными аналогами заключается в достижении более высокого уровня специфической активности диагностических и лечебно-профилактических препаратов против вируса ТГС при отсутствии неблагоприятного воздействия на организм животных. Способ отличается простотой и доступностью осуществления в производственных условиях, не требует применения дорогостоящей аппаратуры и высокоэнергоемких технологий.

Сущностью данного способа является концентрирование вирусного антигена путем адсорбции на частицах 5%-ного геля бентонита с последующим использованием комплекса вирус-сорбент для приготовления целевого продукта.

П р и м е р 1. Приготовление иммобилизированного антигенного препарата вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней штамма Пурдью-115.

Взвесь клеток СПЭВ (перевиваемая культура почек эмбрионов свиней) в количестве 150-200 тыс. кл/мл в питательной среде, содержащей 45% среды 199,45% 5% -ного гемогидролизата и 10% сыворотки крупного рогатого скота, с добавлением антибиотиков вносят во вращающиеся бутыля и выращивают в устройстве для роллерного культивирования. На сформировавшийся через 48-72 ч монослой клеток, предварительно отмытый от сыворотки раствором Хенкса, наносят инфекционный вирус ТГС штамма Пурдью-115 в дозе 5-10 БОЕ/клетку и оставляют для адсорбции в течение 1 ч при 37^оС. Затем инокулят удаляют, монослой клеток промывают раствором Хенкса и вносят поддерживающую среду (среда 199 без сыворотки с добавлением антибиотиков). После достижения цитопатического эффекта через 18-24 ч инфицированный монослой клеток вместе с культуральной средой трижды замораживают и оттаивают и центрифугируют при 10 тыс.g в течение 40 мин. Надосадочную жидкость отбирают, титруют, устанавливают рН 6,0 с помощью 1 М НСl и вносят 5%-ный гель бентонита в расчете 0,35 мг сухого вещества на 1 мл вируссодержащей среды с титром вируса 10⁶-10⁷ БОЕ/мл. При использовании указанной дозы сорбента адсорбируется 84,25± 8,74% вирусных частиц от их исходного количества. Дальнейшее увеличение дозы бентонита неэффективно, так как при этом концентрационная кривая зависимости величины удельной адсорбции от массы сорбента достигает стационарного уровня.

Затем смесь встряхивают на шуттель-аппарате в течение 40 мин до установления сорбционного равновесия и центрифугируют при 3,5 тыс. об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок отмывают раствором Хенкса (рН 5,0-6,0) для удаления неадсорбированных вирусных частиц и повторно центрифугируют при таком же режиме. Надосадочную жидкость снова удаляют, а осадок, представляющий собой комплекс вирус-сорбент, используют для приготовления целевого продукта. Так как коронавирус ТГС в иммобилизированной форме сохраняет свою инфекционную (бляшкообразующую) активность при инокуляции на чувствительную клеточную систему и при десорбции с поверхности носителя, то комплекс вирус-сорбент можно использовать для производства диагностических и лечебно-профилактических препаратов, предназначенных для перорального введения животным.

П р и м е р 2. Приготовление иммобилизированного антигенного препарата вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней штамма Римс.

Вируссодержащую культуральную жидкость получают так же, как и в предыдущем примере. Затем устанавливают рН 5,0-5,5 с помощью 1 М НСl и вносят 5% -ный гель бентонита в количестве 0,15 мг/мл среды. Смесь встряхивают в течение 40 мин и центрифугируют при 3,5 тыс.об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в растворе Хенкса (рН 5,0-5,5) и повторно центрифугируют при 3,5 тыс.об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок в виде комплекса вирус-бентонит используют для приготовления биопрепаратов.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННОГО ПРЕПАРАТА ВИРУСА ТРАНСМИССИВНОГО ГАСТРОЭНТЕРИТА СВИНЕЙ, включающий получение вируссодержащей культуральной жидкости и выделение вирусного антигена, отличающийся тем, что полученный вирусный антиген адсорбируют на частицах 5 %-ного геля бентонита, взятого из расчета 0,15 - 0,35 мг сухого вещества на 1 мл вируссодержащей жидкости с титром 10⁶ - 10⁷ БОЕ/мл, при pH 5,0 - 6,0 и времени экспозиции на носителе не менее 40 мин.