Способ определения веществ, имеющих по меньшей мере одну область антигенной детерминанты

 

Использование: в медицине и иммунохимии. Сущность изобретения заключается в введении пробы, содержащей аналит, в реакцию с известным количеством антитела и с прокалиброванным количеством самого аналита, конъюгированного с твердым носителем. При добавлении в систему аналита меченного антитела, поддающийся детектированию иммунореакционный продукт связывается с твердым носителем, показывая тем самым, что количество аналита в пробе превышает пороговый уровень. С другой стороны, если уровень аналита в пробе ниже порогового значения, свободного антитела будет достаточно для блокирования всего соответствующего количества аналита на твердом носителе, в результате чего меченное антитело не будет образовывать детектируемый иммунореакционный продукт на носителе и сигнал будет отсутствовать. 9 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к методике определения и/или обнаружения иммунологически реактивных аналитов, таких, как лиганды и лигандные рецепторы. В частности, методология, рассматриваемая в изобретении, особенно полезна при определении и/или обнаружении пороговых уровней аналитов, таких, как лекарственные средства, токсические вещества, наркотики, гормоны и им подобные аналиты, являющиеся показателями физиологического состояния организма. Из вышеприведенных применений этой методики, изобретение относится к методике обнаружения присутствия пороговых уровней гормонов, таких, как производные прогестина и эстрогена и лютеинизирующего гормона (LH) в пробах человеческой мочи. Изобретение также относится к набору материалов, используемых в процессе проведения такого анализа.

За последнее время давно назрела необходимость в определении веществ с высокой степенью чувствительности и специфичности. В частности, в таких областях, как клиническая медицина, судебная медицина, качественные исследования окружающей среды, проверка качества пищевых продуктов, пробы на лекарственные средства и в других смежных областях присутствие и/или количество микроэлементов в исследуемых пробах часто является исключительно важным фактором. В перечисленных областях науки часто бывает крайне необходимым определение очень низких концентраций, порядка миллионных долей или даже меньших. Более того, исследования и измерения этого рода требуют, в основном, идентификации конкретных молекул при одновременной нечувствительности к другим молекулам со схожей, но все же отличной структурой.

Ранее необходимость в получении высокочувствительных и специфичных тестов связывалась с развитием процессов иммуноанализа, основанного на высокоспецифичном и чувствительном взаимодействии гена и антитела против этого гена. Антигены и антитела сразу распознаются как компоненты иммунного процесса, протекающего в организме животного и являющегося защитной реакцией животного на попадание в него чужеродного вещества-антигена. Эта реакция проявляется путем продуцирования организмом антител, являющихся молекулами белков, которые распознают данный антиген и образуют с ним тесную связь, что способствует удалению внедрившегося антигена или его деструкции. Иммунный ответ является высокоспецифичным процессом, и поэтому для идентификации специфических веществ с особым успехом применяется иммуноанализ. Иммуноанализ был значительно облегчен благодаря важнейшему открытию Милстейна и Колера (Nature 256:495-497, 1975), относящегося к получению так называемых моноклональных антител.

Известные методы иммуноанализа включают: радиоиммуноанализ (РИА), иммуноферментный метод (ИФМ), ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA), флуоресцентный анализ, хемилюминесцентный анализ и анализ, при котором в качестве маркеров млм меток используются частицы металлов, например взвесь золотых частиц.

Некоторые известные методы анализа основаны на конкурентной иммунореакции. При осуществлении конкурентного иммуноанализа обычно смешивают 1) первый иммунореактивный компонент, содержащийся в анализируемой пробе, 2) второй иммунореактивный компонент, который специфически взаимодействует с первым компонентом, 3) некоторое количество третьего иммунореактивного компонента, имеющего иммунологические реактивные характеристики, аналогичные иммунологическим реактивным характеристикам первого компонента. Третий реагент является меченым. В процессе иммунореакции первый и третий реагенты конкурируют друг с другом за сайты связывания на втором реагенте. По прошествии заранее определенного времени иммунореакции второй реагент отделяется и определяется количество третьего связанного компонента. Если первый компонент присутствует в низких концентрациях, то количество третьего компонента и, следовательно, количество меченого компонента, связанного с вторым компонентом, будет повышенным. С другой стороны, если количество первого повышено, то количество меченого компонента, связанного с вторым компонентом, будет понижено. Итак, при всех уровнях, количество меченых компонентов, связанных с вторым компонентом, будет обратно пропорциональным по количеству первому иммунореактивному компоненту.

В промежуточных концентрациях количество маркеров, связанных с вторым реагентом, постоянно и обратно пропорционально количеству первого реагента в пробе.

Конкурентный иммуноанализ широко применяется в клинических лабораторных анализах для точных замеров большого числа клинически соответствующих аналитов. Однако конкурентные методы анализа, отличаясь простотой постановки реакции, имеют две нежелательные особенности. Во-первых, как было указано выше, полученный сигнал обратно пропорционален количеству определяемого компонента. В идеальном случае, было бы предпочтительней, если бы повышение концентрации аналита вызывало бы повышение уровня сигнала. Таким образом, в визуальном анализе количество полученного сигнала должно быть прямо пропорционально количеству определяемого аналита. Во-вторых, в описанном выше конкурентном иммуноанализе количество обнаруживаемого сигнала является монотонно убывающей функцией от количества аналита в пробе. Таким образом, для близких друг к другу концентраций аналита наблюдается лишь незначительное изменение в интенсивности сигнала. И хотя современная техника позволяет легко обнаруживать такие незначительные изменения, однако слишком тонкое различие для визуальных исследований может повлечь за собой не слишком надежные результаты.

Там, где имеют дело с токсическими и/или нежелательными для окружающей среды веществами, в качестве критерия выбирают неопасный пороговый уровень, предпочтительно использовать пробы, которые дают полностью негативный результат при уровнях даже несколько ниже порогового уровня, но при этом дают явный положительный результат, когда эти уровни превышают пороговый уровень.

В более конкретных случаях необходима более надежная методика, например, определение фертильного периода женщины, когда способные к оплодотворению сперматозоиды и яйцеклетка могут находиться в половых путях женщины. По тем или иным причинам, когда обычные противозачаточные средства не могут быть использованы, определение фертильного периода особенно желательно. Очевидно, что методы определения фертильного периода менструального цикла являются особенно ценными как средство для предохранения от беременности, если она нежелательна, и для облегчения оплодотворения, если беременность желательна. Менструальный цикл регулируется высвобождением гормонов женскими половыми органами и железами. Это высвобождение является прогнозируемым и специфически связано с овуляцией, при которой яйцо освобождается из яичника и, попадая в слизистую оболочку матки, становится способным к оплодотворению, а гормоны или их метаболиты находят свой путь в мочу. В течение нормального менструального цикла уровень эстрон-3-глюкуронида (E₁3G) в женской моче начинает подниматься примерно за 6 дней до начала овуляции и достигает своего максимального значения примерно за 1 день до овуляции, а затем быстро падает в течение и после овуляции. Уровень прегнандиол-3-глюкуронида (P₃G) в женской моче начинает подниматься в день овуляции и остается повышенным в течение лютеиновой фазы. Отношение уровней P₃G и E₁3G хорошо известно, определение этого соотношения весьма полезно для контроля над течением менструального цикла. В гормональном контроле над менструальным циклом особенно важным является тот факт, что приблизительно в течение овуляции уровень P₃G в моче колеблется до значений свыше 4 мкг/мл. Таким образом, простой и надежный способ определения и/или обнаружения присутствия, по меньшей мере, порогового количества P₃G в моче мог бы быть исключительно ценным в определении течения овуляции.

Ступенчатый метод иммуноанализа, рассматриваемый в изобретении, направлен на устранение недостатков, присущих современному методу конкурентного иммуноанализа. Поскольку эта реакция является положительной, то повышение уровней аналита вызывает повышение сигналов. Кроме того, в соответствии с положительной ступенчатой функцией иммуноанализа, рассматриваемого в данном изобретении, сигнал как функция концентрации аналита не возрастает (или убывает) монотонно, а скорее уровень сигнала резко возрастает при достижении заранее выбранного порогового значения. Другими словами, уровни аналита, лишь немного меньшие выбранного порогового значения, вызывают низкие или едва различимые уровни сигнала, в то время как уровни аналита, немного превышающие пороговое значение, вызывают полный уровень сигнала, обнаруживаемого при помощи метки.

Данное изобретение предлагает методику и набор реагентов, используемых в иммуноанализе. В частности, изобретение предлагает положительно ступенчатый анализ, который вызывает сигнал лишь при наличии порогового уровня иммунореактивного вещества. Стандартный иммуноанализ основан на конкуренции между меченым и немеченым реагентами в зависимости от вида анализа, а ступенчатый иммуноанализ в изобретении изменяет сигнал таким образом, что пользователь способа легко удостоверяется в наличии иммунореактивного вещества в пробе. Таким образом, изобретение позволяет облегчить обнаружение отклонений в уровнях гормонов, например таких, как P₃G, E₁3G и LH в моче.

Положительный ступенчатый иммуноанализ, рассматриваемый в данном изобретении, имеет важное применение не только в тестах на фертильность. Иногда имеют место такие ситуации, когда определение фактического количества какого-либо вещества бывает менее важно, чем определения просто наличия того или иного вещества в количестве ниже или выше какого-либо определенного порогового уровня. Такие ситуации могут возникнуть, к примеру, в судебной медицине в тестировании на наличие наркотиков. Например, пороговый уровень 0,1% является важным в определении уровня алкоголя в крови, так как значение выше 0,1% может уже рассматриваться как свидетельство интоксикации организма. Аналогично, для марихуаны или ТНС уровень в моче 10 или в некоторых случаях 100 нг/мл служит указанием на злоупотребление наркотиками. Очевидно, в ступенчатом анализе не происходит окрашивания при уровне аналита меньше порогового значения, окрашивание происходит, если уровень аналита превосходит пороговое значение.

Положительный ступенчатый иммуноанализ, предлагаемый в изобретении, применим также в оценке побочных действий лекарственных средств. Существует ряд высоко эффективных лекарственных средств, таких как теофиллин (антиастматическое средство), дигоксин (регулятор сердечной деятельности) и антибиотики аминогликозида и др. которые обладают терапевтическими "окнами". Терапевтическое окно это диапазон концентраций конкретного лекарственного средства от минимального уровня, при котором это средство имеет терапевтический эффект, до уровня нежелательной дозы, при котором это средство может оказывать токсическое действие. Таким образом, особенно ценным является двухступенчатый позитивный иммуноанализ, одна стадия которого стандартизирована на обнаружение минимального терапевтического порогового значения, а другая стадия на обнаружение токсического порогового значения.

В соответствии с изобретением, технология иммуноанализа позволяет определить начальное присутствие заранее рассчитанного (порогового) количества первого иммунореактивного вещества в жидкой пробе. Процесс состоит из стадий начального установления иммунохимической реактивной фазы путем смешивания жидкой пробы, содержащей первоначально неизвестное количество первого иммунореактивного вещества (1) с известным количеством второго иммунореактивного вещества, которое является специфически иммунореактивным, с вышеуказанным первым веществом и (2) некоторое количество третьего иммунореактивного вещества, имеющего иммунологические реакционные характеристики, сходные с иммунологическими реакционными характеристиками первого иммунореактивного вещества. В соответствии с изобретением известное количество второго вещества является иммунохимически эквивалентным (достаточным для иммунохимического связывания) полному заранее рассчитанному количеству (пороговому) первого вещества и определенному количеству третьего иммунореактивного вещества. Таким образом, если количество первого реагента в жидком растворе пробы превышает его заранее рассчитанный пороговый уровень, то непрореагировавшее третье вещество может оставаться свободным для последующего иммуноспецифического взаимодействия в реакционной фазе.

Установленная таким образом реакционная фаза затем взаимодействует с определенным количеством четвертого иммунореактивного вещества, имеющего иммунологические реакционные характеристики, аналогичные иммунологическим реакционным характеристикам второго вещества. Четвертое вещество тоже является меченым. Таким образом, начальное количество первого реагента, превышающее пороговый уровень в пробе, может быть определено путем обнаружения специфического иммунореакционного продукта, который содержит метки.

Желательно, если третий иммунореактивный компонент будет связан с твердым носителем, при помощи которого третий иммунореактивный компонент иммобилизуется (например, когда твердый носитель содержит проницаемую мембрану), или осаждается (например, когда твердый носитель содержит диспергирующий агент, макрочастицы, собирающий твердый материал).

В более предпочтительном варианте изобретения жидкая проба, содержащая первое иммунореактивное вещество, предварительно смешивается с известным количеством второго иммунореактивного вещества, являющегося иммуноспецифически реактивным с указанным первым реагентом, для получения первой реакционной фазы. Затем эта первая реакционная фаза соединяется с определенным количеством третьего иммунореактивного вещества для получения второй реакционной фазы. В таком исполнении данное изобретение особенно полезно для осуществления анализа для малых молекул, включая лекарственные средства и гаптены, например P₃G и E₁3G.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, направленного на определение количества первого иммунореактивного вещества в жидкой пробе, процесс иммуноанализа включает стадии приготовления жидкой пробы, содержащей еще неизвестное количество первого иммунореактивного вещества, и разделения этой пробы на множество аликвот. Соответствующие различные количества второго иммунореактивного вещества, являющегося специфически иммунореактивным с первым веществом, вводятся в аликвоты для получения множества первых реакционных фаз, содержащих соответствующее различное известное количество второго вещества. Затем первые реакционные фазы связываются с определенным количеством третьего иммунореактивного вещества, имеющего иммунологические реакционные характеристики, аналогичные иммунологическим реакционным характеристикам первого иммунологического вещества. Таким образом, получается множество вторых реакционных фаз, каждая из которых содержит одинаковое количество третьего вещества и соответствующее разное количество второго вещества. Согласно данному изобретению, соответствующие известные количества второго вещества во вторых реакционных фазах являются заранее определенными таким образом, чтобы они были специфически эквивалентными (достаточными для иммуноспецифического взаимодействия и блокирования) полному определенному количеству третьего вещества и соответствующему заранее выбранному количеству первого вещества, в результате чего, если неизвестное количество первого вещества в пробе меньше или равно соответствующему заранее выбранному его количеству, то во второй реакционной фазе не останется неотреагировавшего третьего вещества для дальнейшей иммуноспецифической реакции. А если неизвестное количество первого вещества в пробе больше соответствующего ранее выбранного его количества, то неотреагировавшее третье вещество может быть свободно для дальнейшей иммуноспецифической реакции в соответствующей второй реакционной фазе. Затем вторая реакционная фаза вводится в контакт с определенным количеством меченого четвертого иммунореактивного вещества, имеющего иммунологические реакционные характеристики, аналогичные иммунологическим реакционным характеристикам второго вещества. Таким образом, получается множество фаз детекции, соответствующих вторым реакционным фазам, в силу чего меченый иммунореактивный продукт будет образовываться путем специфической иммунной реакции между неотреагировавшим третьим веществом и меченым четвертым веществом в каждой реакционной фазе, которая соответствует второй фазе, и в которой количество первого вещества в пробе превышает указанное заранее выбранное (пороговое) его значение. Наличие или отсутствие меченого иммунореактивного продукта может быть затем обнаружено в каждой детекторной фазе в качестве указания на исходное присутствие, по меньшей мере, заранее выбранного количества первого вещества в пробе.

Благодаря использованию только что описанного процесса, количество первого иммунореактивного вещества в жидкой пробе может быть определено в его специфически близких диапазонах путем соответствующей калибровки количества второго иммунореактивного вещества, которое вводится в различные реакционные фазы. Другими словами, первая реакционная система может быть прокалибрована таким образом, что соответствующая реакционная фаза будет содержать меченый иммунореактивный продукт, если количество первого иммунореактивного вещества в пробе превышает 1 мкг/мл, вторая реактивная система может быть прокалибрована таким образом, что соответствующая реакционная фаза будет содержать меченый иммунореактивный продукт, если уровень первого иммунореактивного вещества в пробе более 2 мкг/мл, а третья реакционная система может быть прокалибрована таким образом, что соответствующая реакционная фаза будет содержать меченый иммунореактивный продукт, если количество первого иммунореактивного вещества в жидкой пробе превышает 3 мкг/мл и т.д. Таким образом, если данная процедура устроена таким образом, что присутствие иммунореактивного продукта в фазе детекции вызывает окрашивание, то детекторные фазы систем, прокалиброванных на обнаружение концентраций первого вещества меньших, чем его определенное значение, будут окрашиваться, в то время как детекторные фазы систем, прокалиброванных на обнаружение концентраций первого вещества больших, чем его определенное значение, не будут окрашиваться.

Другой важной целью изобретения является получение набора материалов для проведения процедуры иммуноанализа на обнаружение присутствия, по крайней мере, заранее определенного количества первого иммунореактивного вещества в жидкой пробе. Этот набор содержит известное количество второго иммунореактивного вещества, специфически реагирующего с первым веществом, известное количество третьего иммунореактивного вещества, имеющего иммунологические реакционные характеристики, аналогичные иммунологическим реакционным характеристикам первого иммунореактивного вещества, и некоторое количество меченого четвертого иммунореактивного вещества, имеющего иммунологические реакционные характеристики, аналогичные иммунологическим реакционным характеристикам второго вещества. Третье иммунореактивное вещество можно по желанию связать с твердым носителем и предпочтительно, чтобы твердый носитель содержал диспергирующий агент (микрочастицы), осаждающий твердый материал. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения, четвертое иммунореактивное вещество может быть помечено меткой из раствора золотых частиц, которые могут давать красную окраску на фильтрующем элементе при осаждении на нем меченого вещества.

Хотя изобретение применимо ко всем иммунореактивным веществам, являющимся специфически связывающими белками и соответственно связываемыми веществами, оно особенно успешно может быть применено к соединениям с малыми моноэпитопическими молекулами, таким, как лекарственные средства и гаптены, которыми являются гормоны и гормональные метаболиты, включающие P₃G и E₁3G, и родственными веществами, образующимися в женском организме во время менструального цикла.

Во всех вариантах изобретения, предлагаемых выше, третье иммунореактивное вещество, имеющее иммунологические реакционные характеристики, аналогичные иммунологическим реакционным характеристикам первого вещества, состоит, в основном, из тех же компонентов, что и первое вещество. Другими словами, если методика и/или набор используются для определения исходного количества P₃G в жидкой пробе, третье иммунореактивное вещество также должно содержать P₃G. Аналогично, четвертое иммунореактивное вещество, в основном, должно быть сходным с вторым иммунореактивным веществом, каждое из которых является антителом к гормону. С этой точки зрения необходимо отметить, что если первое иммунореактивное вещество имеет множество иммунореактивных сайтов, свободных для иммунных реакций, второе и четвертое иммунореактивные вещества должны быть специфически иммунореактивны по отношению к одному и тому же сайту или сайтам.

Согласно изобретению, при ступенчатом анализе обратный конкурентный сигнал при возрастании уровня гаптена или других иммунореактивных веществ в жидкой пробе обращается в положительный скачок.

Кроме того, анализ может быть поставлен таким образом, чтобы при заранее определенном уровне иммунореактивного вещества в жидкой пробе имел место положительный сигнал (например, пороговый уровень P₃G, указывающий на то, что происходит овуляция), а при более низком уровне этот сигнал отсутствовал. Так как физиологическое обнаружение P₃G имеет значение в пределах 2,5-5 мкг/мл в пробе мочи, можно поставить анализ, например, таким образом, чтобы при значении 2,5 мкг/мл сигнал отсутствовал, а при значении P₃G, равном 5 мкг/мл, сигнал имел бы максимальную величину.

Предметом изобретения является методика проведения анализа и набор реагентов для определения и/или обнаружения различных иммунологических реактивных аналитов, таких, как лиганды и рецепторы лигандов в жидких пробах. Аналиты являются иммунореактивными веществами, такими, как моно- или полиэтопные лиганды, включающие антигены и гаптены; однако изобретение особенно успешно может применяться к моноэпитопным гаптенам, таким, как гормоны, и особенно к метаболитам соединений эстрогена и прогестина, таких, как E₁3G и P₃G. Типичными иммунореактивными веществами, с которыми имеет дело изобретение, являются вещества, способные к иммуноспецифическому связыванию с другими иммунореактивными веществами. Если одно иммунореактивное вещество является специфически иммунореактивным с другим иммунореактивным веществом, одно из веществ или молекул, называется лигандом, а другое рецептором или антилигандом. Эти молекулы различны и одна имеет некоторые участки на поверхности или в полости, которые связываются с конкретными пространственными и/или полярными упаковками другой.

Когда одно иммунореактивное вещество смешивается с другим иммунореактивным веществом, являющимся к тому же специфически иммунореактивным, возникает иммунохимическая реакционная фаза, которая, если имеется достаточно времени для инкубации, вызывает специфическую иммунную реакцию между двумя веществами, образуя при этом иммунореакционный продукт.

Антигенные иммунореактивные вещества могут иметь один или более эпитопов, способных вступать в иммуноспецифическую реакцию. Эти эпитопы могут быть одинаковыми или различными. Однако только те эпитопы, которые являются одинаковыми, способны вступать в специфическую иммунореакцию с данным связывающим партнером. Если фаза иммунохимической реакции допускает инкубацию в течение достаточного количества времени, реакция будет продолжаться до стадии равновесия, т. е. до того момента, когда количества иммуноспецифически реактивных веществ будут иммунохимически равными, и не останется свободных сайтов для иммуноспецифической реакции. Когда это состояние будет достигнуто, то можно сказать, что непрореагировавшее иммунореактивное вещество, пригодное для иммуноспецифической реакции в реакционной фазе, отсутствует. И если одно или другое из специфически иммунореактивных веществ присутствует в количестве, большем, чем иммунохимическое эквивалентное количество, то никакое другое иммунореактивное вещество не будет свободным в реакционной фазе для дальнейшей иммуноспецифической реакции. Таким образом, это другое иммунореактивное вещество является блокированным.

Очевидно, что специфическая иммунохимическая эквивалентность какого-либо данного иммунореактивного вещества не является точным математически рассчитанным числом. Скорее эта специфическая иммунохимическая эквивалентность данного иммунореактивного вещества по отношению к другому иммунореактивному веществу, являющемуся к тому же специфически иммунореактивным, определяется, в основном, эмпирически. В данном случае, это может быть сделано просто путем установления ряда стандартов, содержащих различные значения количеств неизвестного вещества и определения экспериментальным путем количества другого вещества, которое требуется для блокирования первого вещества. Например, такое определение может быть выполнено путем хорошо известного метода титрования.

Согласно изобретению, иммунореактивное вещество имеет иммунологические реакционные характеристики, аналогичные иммунологическим реакционным характеристикам другого вещества, тогда оба этих вещества могут вступать в идентичную специфическую иммунохимическую реакцию. Это явление имеет место, например, когда одно из веществ является частью другого вещества и носителем такого же специфичного эпитопа. Это явление имеет место также, когда эти вещества являются, в основном, аналогичными, но одно из них является свободно подвижным в реакционной фазе, а другое иммобилизованным и/или конъюгированным с твердой фазой, которая облегчает сбор. Это явление может также иметь место, когда одно вещество присутствует в своей основной непрореагированной форме, а другое является меченным детекторной меткой, которая облегчает идентификацию и/или определение количества, являющееся частью процедуры рассматриваемого анализа. Таким образом, в случае, рассматриваемом в изобретении, гаптен, являющийся свободным в реакционной фазе, и такой же гаптен, конъюгированный с твердым носителем, имеют иммуноспецифически аналогичные иммунореактивные характеристики. Итак, антитело к гаптену, меченное детекторной меткой, имеет иммунологические реакционные характеристики, аналогичные иммунологическим реакционным характеристикам такого же, но немеченого антитела к гаптену. Можно сказать, что эти вещества имеют одинаковые иммунологические характеристики.

В соответствии с изобретением, когда неизвестное количество иммунореактивного вещества в жидкой пробе превышает заранее определенное или пороговое количество, образуется меченый иммунореактивный продукт. Этот меченый иммунореакционный продукт может быть в виде продукта (или композита), либо иммобилизованного путем связывания с твердым носителем, таким, как мембрана, либо связанного с дисперсным зернистым собирающим материалом, например фильтром. В любом случае, иммунореакционный продукт содержит метку, которая окрашивает его в надлежащий цвет, такую, как, например, взвесь золотых частиц, или которая облегчает окрашивание, как, например, в случае ферментных меток. В ферментных окрашивающих системах окрашивающие материалы вводятся вместе с образованием иммунореактивного продукта при окрашивающем режиме. Эти материалы и методы хорошо известны специалистам и нет необходимости обсуждать их подробно. Образование окраски в результате метки из взвеси золотых частиц известно. В этой связи, достаточно лишь отметить, что золотые частицы собираются и концентрируются при образовании иммунореакционного продукта таким образом, что образуют визуально видимую окраску.

П р и м е р 1. ELISA-тест на планшете с использованием положительно-ступенчатой методики.

Изготовление желатина P₃G.

Прегнадиол-3-глукуронид (P₃G) (sigma) в виде свободной кислоты ковалентно связывается с желатином (sigma) путем смешивания с ангидридом кислоты (см. Erlanger и др. J. Biol. Chem. 228, 713-727, 1957). Согласно этому методу, стероид присоединяется в качестве пептидной связи посредством глукуронидкарбоновой кислоты к Е-амино-группам остатков лизина в полипептидной цепи белка.

Привязка желатина P₃G к твердому носителю.

Желатин P₃G, приготовленный описанным выше методом, пассивно адсорбируют на дне лунок 96-луночного планшета для микротитрования. 50 мкл раствора желатина P₃G, содержащего 0,250 мкг/мл стероида, добавляется в раствор, содержащий 10 мкмоль KPO₄ и 0,145 моль NaCl (рН 7,4) (PBS), в каждую лунку и этот раствор оставляют в лунках при комнатной температуре (22^оС) на 1 ч. Затем раствор выливают из лунок, а поверхность лунок блокируют для воспрепятствия неспецифическому связыванию при помощи раствора PBS /0,02% азида натрия, содержащего 1% желатина, который оставляют при комнатной температуре на 1 ч. Из обработанных лунок раствор снова выливают и отмывают два раза раствором PBS, содержащим 0,1% Твин-20 (v/v) (рН 7,4).

ELISA-тест на планшете.

Стандартные растворы, содержащие антитело к P₃G в PBS, получают в восьми разных концентрациях, т. е. 1,0; 2,0; 4,0; 8,0; 16,0; 32,0; 64,0 и 128,0 мкг/мл, а растворы проб, содержащие P₃G в PBS, получают в шести различных концентрациях, т.е. 2,5; 1,25; 0,625; 0,3125; 0,156 и 0 мкг/мл. 150 мкл каждого стандартного раствора антител к P₃G подмешивается к 30 мкл каждого пробного раствора для получения 48 отдельных реакционных фаз. Половина каждой отдельной реакционной фазы (60 мкл) помещается в лунки. Растворы инкубируют в лунках в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем растворы выливаются из лунок и лунки отмываются два раза раствором, содержащим 0,1% Твин-20 в PBS. После этого в каждую лунку добавляется 50 мкл раствора, содержащего 62,5 нг/мл конъюгата антитело к P₃G /пероксидаза хрена (HRP) (изготовленного известным методом Nakane et al) в 0,1 М триацетата, и инкубируется при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем лунки отмывают пять раз промывочным раствором PBS /Твин для полного удаления неспецифически связанной HRP. Затем в каждую лунку добавляют раствор маркирующего субстрата, содержащего свежую смесь 3 мл 125%-ного тетраметилбензидина в метаноле и 7 мл 0,03%-ного пероксида водорода в 0,1 М фосфата и 50 мМ водного раствора лимонной кислоты (рН 5,0) и оставляют на 5 мин при комнатной температуре.

Интенсивность окраски регистрируют при помощи прибора Dynatech (Dynatech Virginia) при 630 нм с контрольной длиной волны 490 нм. Результаты представлены ниже в таблице.

Тест, описанный в примере 1, был приведен для иллюстрации обнаружения и определения P₃G в пробных растворах и определения, превышает ли количество P₃G в данной жидкой пробе заранее определенное известное конкретное количество. P₃G в жидкой пробе может называться первым иммунореактивным веществом, а антитело к P₃G в стандартных растворах может называться вторым иммунореактивным веществом. Первое и второе иммунореактивные вещества являются специфически иммунореактивными друг с другом. P₃G, связанный с лунками (твердый носитель) путем желатиновой связи, является третьим иммунореактивным веществом, которое аналогично первому иммунореактивному веществу, и поэтому имеет иммунологические реакционные свойства, аналогичные иммунологическим реакционным свойствам P₃G, т.е. первого иммунореактивного вещества. Антитело к P₃G, конъюгированное с HRP, является четвертым иммунореактивным веществом, которое аналогично второму иммунореактивному веществу, и поэтому имеет иммунологические реакционные свойства, аналогичные иммунологическим реакционным свойствам второго вещества. HRP, конъюгированное с антителом к P₃G, является ферментной меткой или маркером и может быть детектировано при помощи известных методов и процедур. Таким образом, конъюгат антитело к P₃G/HRP является меченым четвертым иммунореактивным веществом.

В описанном примере 1 известное количество антитела к P₃G (второй реагент) соединяется с заранее выбранными количествами P₃G (первый реагент). Обычно P₃G выступает в качестве аналита для детекции, но в примере 1 для иллюстрации изобретения, оно присутствует в известных количествах. Таким образом, получается серия первых реакционных фаз, каждая из которых содержит соответствующее различное известное количество антитела к P₃G. Затем эти первые реакционные фазы вводятся в реакцию с P₃G (третье иммунореактивное вещество), которое связывается с поверхностью лунок планшета для микротитрования и образует вторую реакционную фазу в каждой лунке планшета. Поверхность лунок находится в реакции при том же P₃G желатиновом растворе при идентичном режиме, и поэтому вторые реакционные фазы содержат то же количество связанного с лункой P₃G и соответствующие различные известные количества антитела к P₃G.

В каждой второй реакционной фазе, если общее известное количество антитела к P₃G является достаточным для иммуноспецифической реакции со всем P₃G в пробе и со всем связанным P₃G, связанный P₃G является таким образом блокированным и дальнейшей реакции не происходит. Однако, если общего количества антитела к P₃G недостаточно для реакции со всем P₃G во второй реакционной фазе, то связанный P₃G остается неблокированным и способен для дальнейшей иммуноспецифической реакции. Таким образом, когда вторые реакционные фазы отмываются и подвергаются контакту с раствором конъюгата антитело к P₃G/HRP, иммуноспецифическая реакция будет протекать в тех лунках, где присутствует неблокированный связанный P₃G (где P₃G в пробе превышает калибровочное значение), и HRP ферментный цветообразующий компонент будет связываться с поверхностью лунок посредством иммунореакции между неблокированным P₃G и конъюгатом антитело/HRP. Очевидно, что, если количество P₃G в пробе увеличивается, способность данного количества антитела блокировать связанный P₃G уменьшается. В определенной эмпирически определяемой точке дальнейшее увеличение P₃G в пробе приводит к присутствию на поверхности лунки неблокированного P₃G и последующему связыванию HRP с поверхностью лунки после введения меченного антитела. Таким образом, когда HRP будет связанным с поверхностью лунок, при помощи раствора триметоксибороксина (ТМВ) будет происходить окрашивание.

Из таблицы видно (крайний правый столбец), что цвет отсутствует в тех лунках, где нет P₃G в пробе. Цифровые значения в таблице возрастают в соответствии с возрастанием интенсивности окрашивания, очень малые значения соответствуют незначительному окрашиванию, а соответственно большие значения показывают на яркое окрашивание. Кроме того, в нижнем ряду таблицы, где известная концентрация антитела к P₃G равна 128 мкг/мл, цвет также отсутствует во всех лунках, так как это количество антител достаточно для блокирования всего P₃G, даже если концентрация P₃G в пробе равна 2,5 мкг/мл. Однако, в том случае, когда концентрация антитела равна 64 мкг/мл, происходит полное окрашивание лунки, если концентрация P₃G в пробе достигает 2,5 мкм/мл; когда концентрация антитела равна 32 мкм/мл, полное окрашивание происходит при концентрации P₃G 1,25; когда концентрация антитела равна 16 мкг/мл, полное окрашивание происходит при концентрации P₃G 0,625 мкг/мл; при концентрации антитела 8 мкг/мл скачок происходит при 0,3125 P₃G; и при концентрации антитела 1 или 2 мкг/мл скачок происходит при концентрации P₃G, равной 0,156 мкг/мл. Очевидно, что точка, при которой происходит скачок от отсутствия окраски до полного окрашивания, является высокочувствительной величиной и может быть установлена и проградуирована чисто эмпирически путем варьирования количества антитела к P₃G в стандартном растворе и/или количества P₃G, связанного на носителе.

П р и м е р 2. Потоковый ELISA-тест с использованием положительного ступенчатого процесса.

Изготовление мембраны.

Микропористая мембрана для пропускания потока используется в качестве твердофазного носителя иммобилизованного реагента. В данном примере используется мембрана Pall для иммуноаффинной хроматографии. Эта мембрана изготавливается путем нанесения на нее в виде пятен 3 мкг раствора, содержащего P₃G-желатин, приготовленный описанным в примере 1 методом, и 100 мкг/мл глюкозооксидазы в PBS. Вообще, устанавливается пять пятенных мембран, которые приготавливаются при использовании различных концентраций P₃G-желатина: 10; 1; 0,1; 0,01 и 0,001 мкг/мл. Пятенная мембрана блокируется для предохранения неспецифического связывания при помощи 2 мл раствора, содержащего 0,5% гвоздичного молока и 0,02% Твин-20 в PBS (рН 7,4).Затем мембраны устанавливаются в приборы для пропускания потока.

Потоковый анализ.

Приготавливается стандартный раствор антитела к P₃G, содержащий 32 мкг/мл антитела в PBS, и растворы проб, содержащих, соответственно, 2,5; 1,25 и 0 мкг/мл P₃G в PBS. 40 мкл каждого пробного раствора заранее смешивается с 400 мкл стандар- тного раствора антитела, смесь разливается по мембранам, которые установлены в приборах для пропускания потоков, описанных выше. Затем, как было описано в примере 1, приготавливается раствор конъюгата антитело к P₃G/HRP, который затем разливается через каждую мембрану, после чего мембраны отмываются 1 мл промывочным раствором, содержащим 3% Игепал и 1% додецилсульфата натрия в PBS. Затем мембраны подвергают взаимодействию с 0,4 мл раствора субстрата, состоящего из смеси 7 ч. раствора, содержащего 7,0% декстрозы и 0,01% ТМВ в 0,034 М цитрата и 0,071 М фосфата натрия, и 3 ч. метанола. Затем после 3-5 мин визуально учитывается результат появления окраски, который не зависит от концентрации пятенного раствора, и является следующим: P₃G, мкг/мл Результат 2,5 + (Синяя окраска) 1,25 0 П р и м е р 3. Тест с адсорбцией на золе с использованием положительной ступенчатой методики.

Приготовление твердых частиц дисперсной фазы в золе.

Латекс-гель-P₃G дисперсия приготавливается путем ковалентного связывания P₃G (как это описано в примере 1) и связывания компонента P₃G-желатина с монодисперсными микросферами Polyloead карбоксилата с использованием точно такой же методики как и та, что описана в примере 1 (g). Затем приготавливается серия растворов проб, содержащих соответственно 0,625; 1,25; 2,5; 5,0; 10 и 20 мкг/мл P₃G в PBS. Затем 20 мкл каждого раствора проб смешивается с 300 мкл стандартного раствора антител (как это описано в примере 2) и в эту каждую заранее смешанную фазу добавляется 20 мкл латекс-гель-P₃G дисперсии. Затем эта реакционная смесь наливается через фильтр, изготовленный из регенерированной целлюлозы (1 мк) для захвата и сбора частиц латекса. Известным методом приготавливается антитело к P₃G, меченное золем золотых частиц, и это меченое антитело суспендируется в растворе, содержащем 40 ммоль MgSO₄, 1% альбумина бычьей сыворотки (BSA) и 0,02% азида натрия. Смесь наливается через фильтр, на котором собираются частицы латекса, после чего фильтр отмывается раствором, содержащим 1,234 ммоль Thimerosal, 3% Igepal СА720 и 1% додецилсульфата натрия в PBS (рН 7,2). Визуальная оценка результатов следующая: P₃G, мкг/мл Результат 0,625 1,25 2,5 5,0 + (Розовый цвет) 10,0 + -"- 20,0 + -"- Таким образом, если P₃G в пробе превышает 2,5 мкг/мл, то блокирующие антитела являются израсходованными и, по меньшей мере, часть P₃G, связанных с латексом, остается неблокированной. После чего шарики латекса собираются на фильтре, неблокированный P₃G-латекс на фильтре способен взаимодействовать с меченным золотыми частицами антителом к P₃G, в результате чего образуется иммунокомплекс: латекс-P₃G-анти-P₃G-золотые частицы. Присутствие этого собранного на фильтре комплекса обнаруживается визуально посредством розовой окраски. С другой стороны, если P₃G в пробе равно 2,5 мкг/мл или меньше, блокирующие антитела способны блокировать весь P₃G-латекс и меченное золотыми частицами антитело просто останется в дисперсии и не войдет в иммунокомплекс и в этом виде оно легко пройдет с потоком через фильтр. Процедура, описанная в примере 3, была повторена с использованием в качестве твердой фазы частиц стекла вместо частиц латекса, в результате чего были получены данные, идентичные предыдущим.

П р и м е р 4. Методика проведения тестирования на эстрон-3-глукуронид (E₁3G) в основном та же, что и методика, описанная в примерах 1-3. В данном тесте для связывания гаптена на твердом носителе вместо желатина используется альбумин бычьей сыворотки (фракция 5). Процедура BSA-связывания описана Erlanger et al (см.выше). Результаты, полученные в этом тесте, в основном идентичны результатам, полученным в примерах 1-3.

На практике P₃G и E₁3G-тесты, описанные в данном изобретении, могут быть использованы для раннего прогнозирования овуляции, подтверждения наступившей овуляции, оценки лютеиновой функции, определения начала и конца фертильного периода, оценки фолликулярной фазы и диагностики беременности. Тест обычно проводится с использованием первой утренней мочи (ПУМ).

P₃G-тест может быть использован для измерения увеличения P₃G в ПУМ в течение овуляции и в течение лютеиновой фазы и может быть прокалиброван для получения определенного цветового показателя, когда P₃G поднимается выше порогового уровня около 4 мкг/мл. Окраска, показывающая уровень P₃G, превышающий 4 мкг/мл, остается на протяжении всей лютеиновой фазы, свидетельствуя тем самым о продолжительности и адекватности процесса овуляции.

E₁3G-тест может быть использован для определения увеличения E₁3G-уровня в ПУМ за 3-6 дней до овуляции. Этот тест подобен P₃G-тесту и может быть использован для прогнозирования наступления овуляции, о чем свидетельствует повышение E₁3G-уровня выше значения 30-50 нг/мл.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ, ИМЕЮЩИХ ПО МЕНЬШЕЙ МЕРЕ ОДНУ ОБЛАСТЬ АНТИГЕННОЙ ДЕТЕРМИНАНТЫ, включающий взаимодействие исследуемого материала со специфическими антителами и мечеными антителами, отличающийся тем, что после взаимодействия указанного вещества и специфического антитела добавляют другое указанное вещество на твердом носителе, имеющее сходные иммунологические свойства, при этом количество специфических антител должно быть эквивалентно количеству исследуемого вещества и другого вещества на твердом носителе, после чего смесь, содержащую меченое антитело и указанное вещество на твердом носителе, улавливают на фильтрующем элементе.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что третье вещество связано с твердым носителем, представляющим собой дисперсный поддающийся сбору материал в виде твердых частиц.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сбор заключается в захвате твердого поддающегося сбору материала на фильтрующем элементе.

4. Способ по любому из п. 1, отличающийся тем, что метка представлена твердыми частицами золота.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанным твердым носителем является проницаемая мембрана, через которую создают ток раствора, содержащего четвертое вещество.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная метка является первым ферментативным цветообразующим компонентом, при этом имеется соответствующий второй ферментативный цветообразующий компонент, связанный с указанной мембраной с третьим веществом, и взаимодействие этих двух ферментативных компонентов приводит к образованию поддающейся обнаружению окраски на мембране в случае иммуноспецифичного связывания четвертого вещества с третьим веществом на мембране.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что этап обнаружения включает сбор продукта иммунореакции, меченного золем золота, на фильтрующем элементе и наблюдение возникшей окраски элемента.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что первое и третье вещества представлены каждый гаптеном, а второе и четвертое вещества каждое антителами к гаптену, вступающими в специфичную иммунную реакцию с указанными гаптенами.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что каждый из указанных гаптенов представлен прегнандиол-3-глюкоуронидом.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что каждый из указанных гаптенов представлен эстрон-3-глюкоуронидом.

РИСУНКИ

Рисунок 1