Штамм acinetobacter species, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов

 

Использование: в микробиологической промышленности, а также для очистки почвы и воды от углеводородов нефти и нефтепродуктов в различных климатических зонах. Сущность применения: предложен новый штамм Acinetobacter species, обладающий высокой биодеградирующей активностью по отношению к углеводородам нефти и нефтепродуктов и термоустойчивостью, достаточной для сохранения высокого титра активных клеток при распылительной сушке. 2 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий, который может быть использован для биологической очистки почвы и воды от углеводородов нефти и нефтепродуктов в различных климатических зонах.

Известно несколько штаммов бактерий, которые могут разлагать углеводороды нефти. Например, Flavobacterium tirrennicum (1), Micrococcus species 1M (2), Pseudomonas species (3).

Недостатком для вышеперечисленных штаммов является узкий спектр избирательного действия: деструкция углеводородов только в виде пленки на поверхности воды и неспособность осуществлять утилизацию остаточной замазученности почвы.

Наиболее близким по достигаемому результату к предлагаемому штамму является штамм Pseudomonas putida 36, используемый для очистки воды и почвы от нефтепродуктов (4). На его основе производится бактериальный препарат "Путидойл" по ТУ 64-16-75-91.

Однако степень окисления углеводородов нефти клетками штамма Pseudomonas putida 36 является недостаточно высокой (68,4 74,5%) (4).

Кроме того, при промышленном производстве препарата на основе штамма Pseudomonas putida 36 использование наиболее доступного и дешевого метода высушивания метода распылительной сушки не позволяет получить препарат с титром клеток более 10¹⁰ вследствие инактивации клеток под действием высоких температур (+60^oC).

Поэтому целью настоящего изобретения является создание нового штамма, обладающего высокой степенью биодеградирующей активности по отношению к углеводородам нефти и нефтепродуктов и термоустойчивостью, достаточной для сохранения высокого титра активных клеток при распылительной сушке.

Поставленная цель достигается использованием штамма Acinetobacter species JN-2, полученного в результате естественного отбора активных и термоустойчивых вариантов исходного штамма, выделенного из почвы участка, загрязненного нефтепродуктами.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов "ВНИИгенетика" под номером ВКПМ В-5971.

Полученный штамм имеет следующие культурально-морфологические и биохимические признаки.

Культурно-морфологические признаки: короткие, толстые, неподвижные, грамотрицательные палочки, расположенные попарно или в коротких цепочках, величина клеток (20 часов, среда Хотингера) 1,0 1,5 мкм, при переходе в стационарную фазу форма приближается к коккам. Спор не образуют.

На мясопептонном агаре суточные колонии 3 5 мм, круглые, слабовыпуклые, сходящиеся к вершине, с ровным краем, консистенция маслянистая, пигмент не образует.

На мясопептонном бульоне равномерное помутнение, при стоянии образуется неустойчивая поверхностная пленка, серовато-белый осадок.

Биохимические признаки: Оксидазная проба отрицательная, каталазная положительная.

Отношение к источникам углерода: окислительно-ферментативный тест на использование глюкозы (Тест Хью-Лейфсона). Аэробное окисление глюкозы. Образование кислоты из Д-рибозы, Д-ксилозы, 10% лактозы, L-арабинозы.

Отношение к источникам азота: рост на минеральной среде с ионами аммония. Утилизирует ацетат, цитрат на среде Симонса.

Реакция на протеиназы слабо положительная.

Сероводород, индол не образует.

Кровяной агар не гомолизирует.

Аэроб. Широкий диапазон роста: от 4^oC до 44^oC. При кратковременном воздействии высокой температуры (до 60^o) клетки сохраняет жизнеспособность, что позволяет при промышленном производстве штамма использовать распылительную сушку.

Рост при pH 7,0±0,2 (оптимальное значение).

Отношение к углеводородам: способен утилизировать нефть различного состава, (остаточную замазученность), парафин, дизельное топливо, бензин, вазелиновое масло, смазочное масло, гексан, ундекан, тетрадекан, ксилол, бензол, толуол, фенол.

Способен биодеградировать углеводороды нефти и нефтепродуктов в виде водорастворимой, эмульгированной, пленочной формы и осуществлять утилизацию остаточной замазученности почвы.

Отношение к антибиотикам: не чувствителен к пенициллину.

Хранение: Хранить штамм рекомендуется в виде лиофильно-высушенной культуры в стеклянных запаянных ампулах.

Сущность заявляемого изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1: Штамм Acinetobacter species JN-2 выращивают при температуре 30±1^oC в течение 18 20 часов в пробирках, на скошенной среде МПА pH среды 7,0±0,2 Выросшую культуру смывают 5 мл физраствора в колбу и определяют титр исходного посевного материала.

В качалочные колбы объемом 750 мл наливают по 200 мл отстойной стерильной водопроводной воды, по 3 мл строительного 5%-ного раствора аммофоса (по ГОСТ 18918-85) в качестве источника азота и фосфора и по 1 г нефти парафинового основания, и вносит посевной материал в количестве 1,5·10⁷ кл/мл. Колбы помещают в термостат при температуре 30±1^oC. Через определенное время выдержки в термостате (10, 20, 30 суток) из проб хлороформом экстрагируют остатки углеводородов нефти. После испарения хлороформа гравиметрически определяют их количество.

По разности в массах количества нефти в экстракте контрольной пробы (выдержка пробы в термостате то же количество времени, но без внесения посевного материала) и в экстракте рабочей пробы, рассчитывают процент утилизированной нефти в зависимости от времени. Полученные результаты представлены в табл. 1 Пример 2: Аналогичен примеру 1, но вместо нефти парафинистого основания используют нефть нафтено-ароматического основания. Результаты приведены в табл. 1 Пример 3: Аналогичен примеру 1, но вместо штамма Acinetobacter species JN-2 используют штамм Pseudomonas putida 36. Результаты биодеградации нефти штаммом Ps. putida 36 представлены в табл. 1 Пример 4:
Аналогичен примеру 3, но вместо нефти парафинового основания используют нефть нафтено-ароматического основания. Результаты приведены в табл.1
Пример 5:
Штамм Acinetobacter species JN-2 выращивают в аэробных условиях при температуре 30±2^oC на жидкой питательной среде следующего состава (вес):
Гидролизат крахмала 2,0
Кукурузный экстракт 1,0
Цинк сернокислый 0,002
Калий сернокислый 0,1
Магний сернокислый 0,06
Диаммоний фосфат 0,2
Пропинол 0,1
Мел 0,1
Нефть 0,06
Вода Остальное
pH 7,0±0,2
Полученную культурную жидкость с титром 5,1·10⁹ высушивают на распылительной сушилке при температуре на выходе 60^oC. Титр клеток в 1 г сухой биомассы составил 6,2·10¹¹ кл/г (см. табл.2).

Пример 6:
Штамм Pseudomonas putida 36 выращивают в аэробных условиях на жидкой питательной среде состава по примеру 5.

Полученную культуральную жидкость с исходным титром 4,7·10⁹ кл/мл высушивают на распылительной сушилке при температуре на выходе 60^oC. Титр клеток в 1 г сухой биомассы составил 2,0·10¹⁰ кл/г (см. табл.2).

Как видно из табл.1, количество нефти парафинистого основания, утилизированной штаммом Acinetobacter sp. SN-2 за 10, 20, 30 суток, достигает соответственно 46, 74, 92% Тогда как количество той же нефти, утилизированной штаммом Pseudomonas putida 36 за 10, 20, 30 суток, составило соответственно 39, 58, 76%
Количество нефти нафтено-ароматического основания, утилизированного предлагаемым штаммом за 10, 20, 30 суток, составило 72, 68, 4, 88% соответственно. Тогда как количество той же нефти, утилизированной шт. pseudomonas putida 36 за 10, 20, 30 суток, составило 32, 50, 70,2% Данные табл.2 подтверждают, что клетки предлагаемого штамма более термоустойчивы (титр 9,2·10¹¹) по сравнению с известным (титр 2,0·10¹⁰).

Таким образом, предлагаемый штамм так же как и штамм Pseudomonas putida 36, обладает широким спектром избирательного действия, что позволяет использовать его при биологической очистке воды и почвы от углеводородов нефти и нефтепродуктов, способен утилизировать нефти различного состава и другие углеводороды органических соединений.

Преимуществом предлагаемого штамма по сравнению с прототипом является более высокая деградирующая активность (см. табл.1).

Высокая термоустойчивость клеток по сравнению с известным позволяет использовать при промышленном производство более дешевый и производительный способ распылительной сушки.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:
1. А.с. СССР N 1409594, кл. 3/34, 1988, Бюл. N 26.

2. А.с. СССР N 1304401, кл. 1/20, 1985.

3. А.с. СССР N 1395667, кл. 1/20, 1988, Бюл. N 18.

4. А.с. СССР N 1076446, кл. 15/00, 1988, Бюл. N 8 (прототип).

Формула изобретения

Штамм бактерий Acinetobacter species ВКПМ В-5971, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2