Способ изготовления бивалентной вакцины против миксоматоза и вирусной геморрагической болезни кроликов

 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности, к способу изготовления бивалентной лиофилизированной вакцины против миксоматоза и ручной геморрагической болезни кроликов (ВГБГ) и может быть использовано в научных и производственных лабораториях, занимающихся конструированием биопрепаратов, а также на предприятиях биологической промышленности. Задача - изготовление ареактогенной бивалентной лиофилизированной вакцины против миксоматоза и ВГБК, обладающей стабильными свойствами при хранении. Сущность предлагаемого способа заключается в том, что используют два основных компонента: живой вакцинный вирус миксоматоза кроликов, выращенный в первично-трипсинизированной культуре клеток куриных фибробластов с активностью не ниже 10^4,0 ИД 50/см³ и инактивированную суспензию печени, полученную после заражения вирулентным вирусом геморрагической болезни кроликов. Компоненты смешивают в равных частях; стабилизируют защитной средой в соотношении 10:1 и лиофилизируют. Предложенный способ иллюстрирован 4 таблицами, прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым. 4 табл.

Изобретение относится к области технологии, в частности, к способу изготовления бивалентной лиофилизированной вакцины против миксоматоза и вирусной геморрагической болезни кроликов и может быть использовано в научных и производственных лабораториях, занимающихся конструированием биопрепаратов, а также на предприятиях биологической промышленности.

Известны поливалентные инактивированные вакцины, комбинированные с вирусом геморрагической болезни кроликов, которые с успехом опробованы в Китае. Сюда входят бивалентные вакцины против геморрагической болезни кроликов (ГБК) и пастереллеза; ГБК и бордетеллеза. Lin X.C. Chin.J.Anim.Peltry infec. Dis, 1987, 2,2-10, Huah J.C.E. Chin. J.Vet.Med. 1988, 12(7), 14-15; Tony C. J. Schuam J. Anim, Sci. Vet. Med. 1987, 4,9-10. Имеющиеся отрывочные данные китайских исследователей реферативного характера не позволяют судить о технологии приготовления бивалентной вакцины. В нашей стране подобных исследований не обнаружено.

Задача изготовление ареактогенной бивалентной лиофилизированной вакцины против миксоматоза и ВГБК, обладающей стабильными свойствами при хранении.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что для изготовления бивалентной лиофилизированной вакцины используют два основных компонента: в качестве первого используют живой вакцинный вирус миксоматоза кроликов, выращенный в первично-трипсинизированной культуре клеток куриных фибробластов с активностью не ниже 10^4,0ИД 50/см³. В качестве второго компонента 30% инактивированная при 60^oC в течение 5 часов суспензия печени кроликов, полученная после заражения вирулентным ВГБК. Оба компонента смешивают в равных частях 1:1. Стабилизируют защитной средой в соотношении 10:1. Лиофилизацию проводят после замораживания при температуре минус 50^oC, выдерживают материал при температуре от минус 50 до 0^oC в течение 31 32 ч, затем от 0^oC до +20^oC в течение 6 8 ч при вакууме 75 85 микрон, досушивают в течение 3 4 ч.

Осуществление способа.

Для изготовления бивалентной вакцины против миксоматоза и ВГБК готовят отдельно вирусное сырье, для чего 2 3-х суточную первично-трипсинизированную культуру клеток куриных фибробластов (КФ) заражают вакцинным вирусом микроматоза кроликов штамм "В-82" с активностью не ниже 10^4,0ИД 50/см³ в дозе 0,5ИД 50 вируса на клетку. Затем проводят адсорбцию вируса при температуре 34^oC в течение 3 ч. После контакта добавляют поддерживающую среду и инкубируют зараженную культуру при температуре 34^oC в течение 60 ч. После замораживания при температуре минус 20^oC в течение 10 ч вирусное сырье размораживают. Результаты представлены в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что при заражении культуры клеток КФ в дозе 0,5 lg ИД 50 на клетку с последующей адсорбцией вируса при температуре 34^oC в течение 3 ч и инкубирование зараженной культуры в течение 60 часов способствует максимальному накоплению вируса (4,5 lg ИД 50/см³). Второй компонент бивалентной вакцины получают от кроликов массой 3,0 кг, зараженных ВГБК. Спустя 24 48 ч, от павших животных отбирают печень, замораживают, измельчают и готовят 30%-ную суспензию на физиологическом растворе (pH 7,2), экстрагируют вирус в течение 20 ч при 6^oC, декантируют надосадок, а к осадку добавляют физиологический раствор 1:2 и повторно экстрагируют в течение 20 ч при периодическом перемешивании (заявка N 5052003 от 17.08.92). Оба компонента бивалентной вакцины смешивают в равных частях (1:1), и к смеси компонентов добавляют стабилизатор в соотношении 10:1, разливают по 2,0 см³ в ампулы, замораживают при минус 60^oC в течение 10 ч. Результаты представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что объемное соотношение компонентов вакцины (1:1) и добавление стабилизатора к смеси компонентов в соотношении (10:1) позволяет сохранить активность компонентов бивалентной вакцины на исходном уровне в течение 6 месяцев (срок наблюдения).

При лиофилизации материал выдерживают при температуре от минус 50^oC до 0^oC в течение 32 ч, затем от 0^oC до 21^oC в течение 8 ч при вакууме 85 микрон, досушивают в течение 4 ч. Результаты эффективности режимов лиофилизации представлены в таблице 3.

Бивалентная вакцина против миксоматоза в ВГБК, полученная по предлагаемому способу, активна, безвредна, ареактогенна для кроликов с 30-дневного возраста.

Бивалентную вакцину применяют как внутримышечно и подкожно в объеме 0,2 см³. Иммунитет формируется на 7 8 сутки после вакцинации против двух инфекций продолжительностью не менее 6 месяцев (срок наблюдения).

Бивакцина стабильно сохраняет свои иммунобиологические свойства в процессе хранения в течение 6 месяцев (срок наблюдения) при температуре 6^oC. Результаты представлены в таблице 4.

Из таблицы 4 видно, что бивалентная вакцина против миксоматоза и ВГБК через 6 месяцев хранения (срок наблюдения) после однократной иммунизации кроликов в объеме 0,2 0,5 см³ при разных способах введения (внутримышечное, подкожное, внутрикожное), не вызывает поствакцинальных осложнений и обеспечивает 100% защиту вакцинированных кроликов при полной гибели животных в контроле.

Таким образом, изготовленная по предложенному способу бивалентная вакцина позволяет обеспечить защиту, после однократной привязки, от двух болезней (миксоматоза и ВГБК). Лиофилизация бивалентной вакцины с предложенной защитной средой позволяет обеспечить стабильность препарата при хранении. Результаты исследований подтверждены актом комиссионных испытаний (акт прилагается). Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым.

Формула изобретения

Способ изготовления бивалентной вакцины против миксоматоза и вирусной геморрагической болезни кроликов, заключающийся в том, что выращивают вакцинный вирус миксоматоза кроликов в культуре клеток куриных фибробластов с активностью не ниже 10^4,0 ИД 50/см³, замораживают-оттаивают, смешивают с инактивированной суспензией печени кроликов, зараженной вирулентным вирусом геморрагической болезни кроликов, в соотношении 1:1, стабилизируют полученную смесь защитной средой при соотношении 10:1, фасуют и лиофилизируют после замораживания при минус 55 ± 5^oС в течение 10 ± 2 ч путем выдерживания материала при температуре от минус 50 ± 5^oС до 0^oC в течение 31 ± 1 ч и затем от 0^oС до плюс 20 ± 1^oС в течение 6 ± 1 ч при вакууме 10 ± 0,5 Па и досушивают в течение 3 ± 1 ч.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4