Способ электрооптического анализа клеток в суспензии и устройство для его осуществления

 

Использование: в области биотехнологии, микробиологии и медицине и более конкретно касается способа электрооптического анализа суспензии клеток и устройства для его реализации, используемых для определения морфометрических и электрофизических параметров клеток и связанных с ними физиологических характеристик клеток. Сущность изобретения заключается в определении величины анизотропии поляризуемости для отдельных фракций клеток, составляющих гетерогенную популяцию, используемую для оценки морфометрических и физиологических характеристик этих фракций. Для этого, в процессе наложения каждого формируемого с помощью микропроцессора 30 в генераторе 12 радиоимпульса электрического поля (ЭП) на исследуемую суспензию клеток, помещенную в электрооптическую ячейку 1, при одновременном пропускании через нее попеременно ортогональных световых потоков с помощью импульсных источников 2 и 3 света, изменяют при помощи коммутатора 15 электродов направление вектора ЭП относительно направления светового потока дискретно на 90^o с частотой F, которую также изменяют в диапазоне от F_min до F_max таким образом, что F_i±1 = F_i/2^M, где i=(0,...,j-1), (j-1,...,0), M - положительное число, с одновременным изменением при помощи аттенюатора 13, соединенного с одновременным изменением при помощи аттенюатора 13, соединенного с парафазным усилителем 14 напряженности, Е в диапазоне от E_min до E_max так, что в случае изменения напряженности электрического поля в сторону ее уменьшения, или в случае изменения напряженности электрического поля в сторону ее увеличения, где i = (0,...,I), j = 1/M·log₂(F_max/F_min). Величины F_max, F_min, E_max и F_min определяют экспериментально в зависимости от вида исследуемой культуры клеток. Экспериментальный сигнал от исследуемой суспензии, определяемый как разность между интенсивностью световых потоков от источников 2 и 3 света, принимают фотоприемником 8, соединенным с преобразователем 9 напряжения в частоту, выходы которого соединены со входами счетчиков 10 и 11 частоты, регистрируют в микропроцессоре 30 и используют для расчета величины анизотропии поляризуемости клеток. 2 с.п. ф-лы, 9 з.а. ф-лы, 10 ил.

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии и медицины и более конкретно касается способа электрооптического анализа суспензии клеток и устройства для его реализации, используемых для определения морфометрических и электрофизических параметров клеток и связанных с ними физиологических характеристик клеток.

В микробиологической, пищевой, медицинской и ряде других отраслей промышленности, использующих биотехнологические процессы, стоит задача определения физиологических и морфометрических показателей состояния клеток, отражающих качество и эффективность биотехнологического процесса. Традиционные микробиологические методы определения морфометрических параметров клеток путем микроскопирования и определения физиологических характеристик: жизнеспособности путем высева клеток на питательные среды и удельной скорости роста путем периодического подсчета клеток в счетной камере не отвечают современным требованиям из-за недостаточной оперативности.

Известны способы оптического анализа параметров клеток, например на основе анализа изображений, полученных с помощью видеокамеры, (WO 89/03431). Анализ изображений позволяет определить морфологические признаки клеток, но не дает возможности определить физиологические характеристики клеток.

Известен способ определения объема и концентрации клеток (Cell analysis, 1982, v.1, p.195-331), основанный на измерении временной зависимости изменения тока, текущего через калиброванное отверстие при прохождении через него исследуемой клетки. Существенная погрешность метода связана с интерпретацией сигнала от тесно следующих друг за другом двух или трех клеток как сигнала от одной клетки большего размера.

Известен способ определения относительной концентрации жизнеспособных клеток, основанный на измерении величины флуоресценции клеток после их отработки флуоресцентной меткой (Микробиология, 1988, т.57, N 2, с.347-351), требующий обязательной калибровки и обладающий существенной погрешностью за счет неконтролируемого числа сайтов посадки флуоресцентной метки.

Задачу быстрого определения физиологического состояния клеток и одновременно их морфологических параметров позволяет решить способ электрооптического анализа клеток, основанный на исследовании изменения светорассеяния при их ориентации в электрическом поле.

В основе способа электрооптического анализа лежит эффект Керра. Суть эффекта состоит в изменении оптических свойств суспензии, в частности суспензии клеток, при воздействии на нее электрического поля.

Воздействие электрического поля на суспензию вызывает появление на суспендированных клетках индуцированных зарядов. Их распределение и величина определяются действующим механизмом поляризуемости (Духин, Электрооптика коллоидов, Наукова думка, Киев, 1975). При объемном механизме поляризуемости индуцированные заряды появляются на границах раздела двух сред с различными комплексными диэлектрическими проницаемостями. Границами раздела структур клеток являются поверхности соприкосновения двойного электрического слоя и клеточной стенки, клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, цитоплазматической мембраны и цитоплазмы. Величина индуцированных на границах разделов зарядов пропорциональна напряженности электрического поля зависит от соотношения диэлектрических проницаемостей структур. Интегральным параметром, описывающим процесс поляризуемости, является тензор а поляризуемости клетки. Тензор поляризуемости несферической клетки имеет по крайней мере две отличающиеся компоненты. Продольная компонента совпадает с длиной осью клетки, а поперечная ортогональная ей. Распределенные по объему клетки индуцированные заряды разных знаков образуют диполь. Диполь взаимодействует с электрическим полем и вызывает появление вращающего момента. Возникает преобладающее направление ориентации клеток, которое изменяет равновероятный характер распределения клеток по углам ориентации, описываемого функцией Больцмана. Угол ориентации клетки отсчитывается от направления падающего светового потока к направлению длинной оси клетки.

При этом происходит изменение всех оптических характеристик суспензии: величины двулучепреломления, характер светорассеяния и величины оптической плотности суспензии вследствие изменения сечения G(t) рассеяния клеток. При напряженности Е электрического поля, соответствующего слабой ориентации клеток, зависимость изменения оптической плотности от квадрата напряженности имеет линейный характер.

В зависимости от частоты электрического поля и электрических свойств клеток направление преобладающей ориентации клеток может совпадать с направлением вектора электрического поля или быть ортогональным ему. Ориентация клеток длинной осью вдоль светового потока будут приводить к увеличению сечения рассеяния и уменьшения интенсивности светового потока, а ориентация поперек светового потока к его уменьшению и соответственно к увеличению светового потока.

Известен способ электрооптического анализа клеток в суспензии (SU, A, 469748), заключающийся в том, что через исследуемый образец суспензии пропускают световой поток с одновременным наложением на суспензию радиоимпульса электрического поля фиксированной частоты и напряженности, силовые линии которого направлены вдоль светового потока. Частоту электрического поля изменяют от импульса к импульсу. На каждой частоте измеряют оптическую плотность суспензии в отсутствии и присутствии электрического поля. По изменению оптической плотности определяют степень электроориентации клеток, по которой судят об их электрофизических характеристиках, например, о величине их анизотропии поляризуемости, связанной с комплексными диэлектрическими проницаемостями отдельных клеточных структур, а через них с физиологическими характеристиками клетки.

Известно устройство для реализации этого способа (SU, A, 469748), содержащее электрооптическую ячейку с образцом исследуемой суспензии клеток, источник света, создающий световой поток, пропускаемый через ячейку, фотоприемное устройство, генератор гармонического напряжения и устройство управления работой этих элементов. Устройство содержит систему подачи и слива исследуемой суспензии.

Использование этого способа для анализа суспензии неоднородных по размерам клеток позволяет определить только усредненную по размерам величину анизотропии поляризуемости клеток для всей популяции и не позволяет определить этот параметр для отдельных фракций клеток с разными размерами, составляющих данную популяцию.

Кроме того, возникающее в исследуемой суспензии седиментация и флокуляция клеток, а также флуктуации плотности суспензии существенно снижают чувствительность и точность определения приращения оптической плотности, исходя из которой определяют величину анизотропии поляризуемости Эти возмущающие факторы особенно сильно проявляются при малом уровне сигнала, что характерно при ориентации клеток в высокочастотном диапазоне электрического поля. Появление данных факторов связано с тем, что измерения проводят в одном световом потоке и возникающие флуктуации плотности, седиментация и флокуляция не компенсируется. Также велики погрешности измерения, связанные с нестабильностью источника света и фотоприемника (фликкер шум).

Эти погрешности частично устраняются при использовании двухлучевой схемы регистрации изменений оптической плотности суспензии с механическим переключением светового потока с опорного канала на измерительный (Биотехнология, 1989, N 2, с.214-215).

Более высокой точности и чувствительности в определении электроориентации клеток позволяет достичь способ электрического анализа клеток в суспензии (SU, A, 913169), заключающийся в том, что световой поток пропускают через два исследуемых образца суспензии клеток с одновременным наложением радиоимпульса электрического поля фиксированной частоты и напряженности вектор которого для одного образца параллелен световому потоку, а для другого перпендикулярен (ортогонален) световому потоку. Частоту электрического поля, как и в предыдущем случае, также изменяют от импульса к импульсу. Измеряют интенсивность световых потоков, прошедших через исследуемую суспензию и характеризующих оптическую плотность суспензии одновременно в обоих образцах. По разности этих величин определяют величину анизотропии поляризуемости клеток, по которой судят об их электрофизических характеристиках.

Для близких по размерам клеток величина изменения оптической плотности пропорциональна квадрату напряженности электрического поля до определенного порогового уровня. Этот уровень соответствует переходу от слабой степени ориентации клеток к сильной степени ориентации и является предпочтительным для достижения достаточной точности измерения. Поэтому, в начале проведения исследований экспериментальным путем определяют величину напряженности, при которой клетки переходят от слабой к сильной степени ориентации, и в дальнейшем все измерения проводят не изменяя напряженности электрического поля.

Способ реализуется в устройстве (SU, A, 913169), содержащем две электрооптические ячейки с двумя плоскими электродами в каждой ячейке, которые заполняют исследуемой суспензией, источник света, создающий два световых потока, один из которых пропускают через одну ячейку, другой через вторую, и соответственно два фотоприемника с разностным усилителем для определения разности между интенсивностью световых потоков, а также генератор напряжения. Направление вектора электрического поля в одной ячейке параллельно световому потоку в этой ячейке, а направление вектора электрического поля в другой ячейке перпендикулярно световому потоку в этой ячейке.

Этот способ также может быть использован только для анализа однородной суспензии клеток, поскольку он позволяет оценить лишь изменение суммарной оптической плотности суспензии и соответственно усредненную по размерам клеток величину анизотропии поляризуемости. Использование в устройстве двух ячеек и двух фотоприемников частично компенсирует погрешности, связанные с седиментацией и флокуляцией клеток, однако вносит дополнительные погрешности, связанные с неидентичностью исполнения ячеек и наличием нескомпенсированных низкочастотных шумов фотоприемников.

Таким образом, ни один из известных способов электрооптического анализа клеток в суспензии не обеспечивает возможности достоверного определения анизотропии поляризуемости каждой из однородных по размерам фракций клеток, составляющих гетерогенную популяцию, т. е. не позволяет оценивать степень гетерогенности популяции по данному параметру.

В основу изобретения положена задача разработать способ электрооптического анализа клеток в суспензии, позволяющей определять в гетерогенных смесях фракции с отличающимися морфометрическими и электрофизическими параметрами (т.е. оценивать степень гетерогенности популяции) путем использования разной степени инерционности клеток разных размеров при их ориентации в электрическом поле с изменяющимися параметрами и подбора этих параметров. Другая задача состоит в уменьшении низкочастотных (фликкер) шумов и компенсации возникающих флуктуаций плотности суспензии, флуктуации и седиментации клеток.

В основу изобретения положена задача разработать устройство для осуществления способа электрооптического анализа клеток, позволяющее анализировать гетерогенную смесь клеток.

Задача решается тем, что предлагается способ электрооптического анализа клеток в суспензии, при котором накладывают на исследуемую суспензию электрическое поле в виде импульсов, пропускают через нее световые потоки, измеряют интенсивность прошедших через суспензию световых потоков и определяют их разность как электрооптический сигнал для последующего определения частотной зависимости анизотропии поляризуемости клеток, в котором, согласно изобретению, при наложении каждого указанного импульса изменяют направление вектора электрического поля относительно направления светового потока дискретно на 90^o с частотой F, при этом частоту F изменяют в диапазоне от F_min до F_max таким образом, что F_i+1 F₁/2^M, где i (0,j-1), или F_i-1 F_i/2^M, где i (j-1,0), M положительное число.

Для более эффективного определения фракций мелких клеток одновременно с изменением частоты F изменений направления вектора электрического поля дискретно на 90^o изменяют напряженности Е электрического поля в диапазоне от E_min до E_max таким образом, что в случае изменения напряженности электрического поля в сторону ее увеличения, или по формуле в случае изменения напряженности электрического поля в сторону ее уменьшения, где i (0,j), j 1/M·log₂(F_max/F_min).

Величины F_min, F_max, E_min, E_max определяют экспериментально, в зависимости от вида исследуемой культуры клеток.

Способ может быть осуществлен при программировании параметров радиоимпульсов на изменение частоты изменений направления вектора электрического поля и напряженности электрического поля либо в сторону уменьшения этих величин, либо в сторону их увеличения.

В случае изменения частоты изменения направления вектора электрического поля в сторону уменьшения начальное максимальное значение частоты F_max определяют для каждой культуры экспериментально по появлению электрооптического сигнала, а величину F_min определяют по исчезновению изменений стационарной величины электрооптического сигнала; величину E_max определяют соответствующей пороговому уровню слабой степени ориентации мелких клеток, а величину E_min определяют по достижению порогового уровня слабой степени ориентации крупных клеток.

В случае изменения частоты F в сторону увеличения минимальную величину F_min выбирают соответствующей отсутствию изменений стационарной величины электрооптического сигнала, максимальное значение частоты F_max определяют по исчезновению электрооптического сигнала, величину E_min выбирают соответствующей слабой степени ориентации крупных клеток, а величину E_max определяют по достижению порогового уровня слабой степени ориентации мелких клеток.

Экспериментальным путем было определено, что при осуществлении способа с программированием импульсов подачи электрического поля изменения направления вектора электрического поля на 90^o должны выполняться в количестве не менее трех раз.

Задача уменьшения низкочастотных (фликкер) шумов и компенсации возникающих флуктуаций плотности суспензии, флуктуации и седиментации клеток решается тем, что исследуемую суспензию берут в виде элементарного объема (одного исследуемого образца), через который поочередно пропускают два световых потока, ортогональных друг дpугу.

Поставленные задачи решаются тем, что предложенное устройство для осуществления предлагаемого способа электрооптического анализа клеток, содержащее электрооптическую ячейку, снабженную светопрозрачными окнами, расположенными напротив друг друга и размещенными внутри нее электродами, источник света, оптически связанный с фотоприемником, соединенным с блоком определения разности между интенсивностью прошедших через суспензию световых потоков как электрооптического сигнала и генератор импульсов электрооптического напряжения, в котором, согласно изобретению, электрооптическая ячейка выполнена с четырьмя светопрозрачными окнами и, по меньшей мере четырьмя электродами в виде стержней, установленных вертикально между указанными окнами, при этом устройство снабжено дополнительным источником света, также оптически связанным с упомянутым фотоприемником, причем оба источника выполнены импульсными, а также последовательно соединенными между собой аттенюатором электрического напряжения с возможностью управления величиной электрического напряжения, парафазным усилителем и коммутатором электродов, подключенным к генератору электрического напряжения, при этом вход парафазного усилителя соединен с выходом аттенюатора, а его выходы соединены с двумя диагонально расположенными электродами и входами коммутатора электродов, выходы которого соединены с двумя другими диагонально расположенными электродами.

Для увеличения оптической толщины исследуемого образца суспензии, что приводит к повышению точности измерения изменений интенсивности световых потоков, электрооптическая ячейка выполнена с девятью электродами, установленными внутри указанной ячейки на равном расстоянии друг от друга тремя рядами по три электрода в каждом ряду и расстояние между соседними электродами в ряду равно расстоянию между соседними рядами, а средний электрод среднего ряда является центральным, при этом крайние электроды первого и третьего рядов соединены с одним выходом парафазного усилителя, центральный электрод соединен с другим выходом парафазного усилителя, а остальные попарно противолежащие электроды соединены с выходом коммутатора электродов.

Блок определения разности между интенсивностью световых потоков может быть выполнен в виде преобразователя напряжения в частоту, выход которого соединен со входами двух стробирующих счетчиков частоты.

Электрооптическая ячейка может быть выполнена в виде параллелепипеда с квадратным основанием.

Оптическая связь источников света с фотоприемником может быть выполнена в виде четырех зеркал, одно из которых установлено на оси светового потока, создаваемого одним источником света, другое на оси светового потока, создаваемого другим источником света, а два других расположены между предыдущими зеркалами и установлены относительно друг друга под углом, обеспечивающим падение указанных световых потоков на фотоприемник под углом 90^o.

На фиг.1 показано изменение величины электрооптического сигнала как функции времени при воздействии на исследуемую суспензию одного радиоимпульса электрического напряжения с программированным изменением параметров электрического поля, где а) пространственное изменение направления вектора поля на 90^o относительно нулевого момента времени при количестве изменений равном пяти для каждой частоты F, показанное стрелками и временной диаграммой; б) изменение напряженности Е поля на протяжении одного радиоимпульса электрического напряжения одновременно с изменением частоты F изменений направления вектора поля на 90^o при количестве изменений направления вектора равном пяти; в) изменение величины электрооптического сигнала при воздействии радиоимпульса электрического поля с изменением его параметров в соответствии с графиками а) и б).

На фиг. 2 показана зависимость электрооптического сигнала от количества изменений направления вектора электрического поля на 90^o; на фиг.3 - структурная схема устройства; на фиг.4 электрооптическая ячейка с четырьмя электродами в изометрии; на фиг.5 схема присоединения электродов к коммутатору электродов и к парафазному усилителю: а) для ячейки с четырьмя электродами; б) для ячейки с девятью электродами.

На фиг.6 показан электрооптический сигнал от суспензии клеток E.coli при пяти изменениях направления вектора электрического поля на 90^o для каждой из четырех частот F изменений направления вектора и напряженности Е (для последующих расчетов используют сигнал, полученный после трех изменений направления вектора) а) н частоте заполнения радиоимпульса f₁ 1 кГц; б) на частоте заполнения радиоимпульса f₂ 8,4 МГц.

На фиг.7 изображено распределение размеров клеток E.coli а) полученное в результате обработки оптического сигнала на частоте f₁ 1 кГц; б) полученное в результате обработки микрофотографий клеток в количестве 2500 шт.

На фиг. 8 зависимость величины анизотропии поляризуемости от размера клеток E. coli на частоте f₂ заполнения радиоимпульса нормированной на величину анизотропии поляризуемости, полученную на частоте f₁.

На фиг.9 электрический сигнал от суспензии клеток Bac.subtilis при пяти изменениях направления вектора электрического поля на 90^o для каждой из четырех частот F изменений направления вектора и напряженности Е (для последующих расчетов используют сигнал, полученный после трех изменений направления вектора)
а) на частоте заполнения радиоимпульса f₁ 1 кГц;
б) на частоте заполнения радиоимпульса f₂ 4,2 МГц.

На фиг. 10 зависимость величины анизотропии поляризуемости от размера клеток Bac.subtilis на частоте f₂ заполнения радиоимпульса нормированной на величину анизотропии поляризуемости, полученную на частоте f₁.

Известно, что процесс изменения сечения рассеяния G(t) клеток в течение воздействия электрического поля и связанного с ним изменения оптической плотности суспензии начинается с релаксационной и переходит в стационарную фазу. Для фракции клеток с размером b₁ и весовым коэффициентом A_i он описывается соотношением:
dG_i(t) A_i·(1-exp(-6·D_i·t)),
где A_i N_i·dQ_i·da_i;
N_i количество клеток i размера;
dQ_i приращение сечения рассеяния одиночной клетки i размера после завершения ее ориентации;
D_i коэффициент вращательной диффузии для клеток с размером b_i;
da_i анизотропия поляризуемости клеток i фракции, равная разности продольной и поперечной компонент тензора а поляризуемости;
t длительность воздействия электрического поля неизменного направления, фиксированной напряженности и частоты.

Стационарная фаза соответствует завершению процесса ориентации клеток при t→ ∞. Из-за линейной зависимости величины анизотропии поляризуемости клеток от их объема выполнение измерений на пороговом уровне напряженности Е_max для мелких клеток приводит к сильной степени ориентации больших клеток и искажению их вклада в da_i (Ландау Л.Д. Лифшиц Е.М. Электродинамика сплошных сред, М. Гостехиздат, 1957, с.14-28). За счет существенной зависимости приращения сечения рассеяния клеток от их размера (не ниже кубической), выполнение измерений при слабой степени ориентации больших клеток приводит к незначительному вкладу в суммарной электрооптический сигнал клеток с малыми размерами, т. е. вклад малого количества крупных клеток подавляет вклад от большого количества мелких клеток.

Сущность изобретения заключается в том, что при анализе гетерогенной по размерам популяции клеток были использованы приемы измерения напряженности и направления вектора электрического поля с переменной частотой F в пределах одного радиоимпульса воздействия поля, позволяющие выделить приращение сечения рассеяния для мелких клеток на фоне значительного изменения сечения рассеяния крупных клеток за счет отличия в характере оптических сигналов от клеток различных размеров при их ориентации в электрическом поле, направление (вектор) которого изменяют на 90^o с изменяемой частотой F. Причиной этого отличия является различная степень инерционности клеток разных размеров, определяемая величиной коэффициента вращательной диффузии. При этом при изменении направления вектора с частотой F_max (для случая изменения частоты F в сторону ее уменьшения) мелкие клетки перед изменением направления вектора электрического поля на 90^o находятся в стационарном, а более крупные клетки в релаксационном состоянии. Изменение напряженности Е электрического поля одновременно с изменением частоты F изменений направления вектора на 90^o позволяет увеличить и выделить оптический вклад мелких клеток, находящихся в стационарном состоянии при слабой степени их ориентации, от вклада крупных клеток, находящихся в стационарном состоянии при слабой степени их ориентации, от вклада крупных клеток, находящихся в релаксационном состоянии при средней или сильной степени ориентации этих клеток.

Таким образом, наличие этих приемов позволяет выделить вклад, вносимый в суммарное изменение оптической плотности каждой фракцией клеток, и, следовательно, определить при модельном представлении сечения рассеяния либо величину анизотропии поляризуемости для каждой фракции клеток одного размера при известном распределении размеров, либо распределение размеров при известной модельной зависимости анизотропии поляризуемости от размеров.

Программа изменений направления вектора электрического поля, его напряженности Е и частоты F изменений направления вектора в пределах каждого радиоимпульса воздействия поля представлена на фиг.1,а) и б) для случая пятикратного изменения направления вектора на 90^o для любой частоты F.

При таком программировании параметров воздействующего на клетки электрического поля происходит изменение амплитуды и формы электрооптического сигнала (фиг.1,в), по которым при использовании известных модельных соотношений для сечения рассеяния рассчитывают зависимость анизотропии поляризуемости клеток от их размеров и тем самым определяют электрофизическую гетерогенность суспензии.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом:
Через исследуемый образец суспензии поочередно пропускают два потока света, ортогональных друг другу, с частотой переключения не менее чем на два порядка больше чем частота F изменений направления вектора электрического поля. Количество изменений направления вектора электрического поля на 90^o для каждого значения частоты F определяется достижением постоянной величины сигнала G(t) на стационарной фазе ориентации. На фиг.2 представлены результаты моделирования воздействия количества изменений направления вектора поля на 90· от одного до пяти на форму электрооптического сигнала при начальной напряженности Е поля равной нулю и последующей подаче поля с напряженностью E_max и частотой F_max изменений направления вектора поля. Для наглядности графики изменения формы электрооптического сигнала как функции времени наложены друг на друга (номера графиков соответствуют количеству изменений направления вектора). Как видно из этой фигуры, влияние различных начальных условий на форму электрооптического сигнала становится пренебрежимо малым уже после третьего изменения направления вектора поля на 90^o.

Частоту F изменяют в диапазоне от F_max до F_min таким образом, что F_i±₁ F_i/2^M, где i (0,j-1), (j-1,0), M положительное число, зависящее от желаемой степени определения гетерогенности суспензии. Количество шагов изменения частоты при этом определяется как j 1/M·log₂(F_max/F_min). Уменьшение М до 0,1 и менее сопровождается увеличением точности оценки гетерогенности, увеличением времени измерения и усложнением алгоритма обработки. Отсюда относительное изменение частоты F выбирают, исходя из компромисса между допустимым временем измерения и желаемой точностью.

Величину напряженности электрического поля Е для каждого значения частоты F поддерживают постоянной. Начальное значение напряженности E_max при частоте F_max изменения направления вектора соответствует пороговому уровню слабой степени ориентации мелких клеток. Конечная величина напряженности поля E_min соответствует уровню слабой степени ориентации фракции A_j наиболее крупных клеток. Напряженность Е электрического поля изменяют в диапазоне от E_max до E_min таким образом, что при изменении величины Е в сторону ее уменьшения.

При воздействии на суспензию электрического поля с напряженностью E_max и частотой F_max изменений направления вектора электрического поля, перед сменой направления вектора поля фракция мелких клеток A_o с размером b_o находится в стационарной, а A_i фракции более крупных клеток с размерами b_i, где i>1, в релаксационной фазе ориентации. Электрооптический сигнал после трехкратного изменения направления вектора электрического поля на 90^o, определяемый как разность между интенсивностью прошедших через исследуемую суспензию ортогональных световых потоков, будет состоять из линейных начальных отрезков экспоненты, соответствующих i фракциям и полного экспоненциального сигнала от фракции о самых мелких клеток. Выделение сигнала от фракции о осуществляют исключением из суммарного сигнала линейной составляющей от суммы фракций начиная со второй, например, вычитанием постоянной составляющей дифференцированного сигнала.

Переход к следующей напряженности Е₁ cопровождается одновременным уменьшением величины F в 2^M раз и уменьшением величины Е² на (E²_max-E²_min)/j. Линейный отрезок оптического отклика от фракции А₂ преобразуется в полный экспоненциальный сигнал (при М=1) или в его часть (при М<1), в зависимости от величины М. Кроме того электрооптический сигнал от всех фракций снижается на величину (E²_max-E²_min)/j за счет квадратичной зависимости величины электрооптического сигнала от Е.

Процесс выделения электрооптического сигнала от второй и последующих фракций является итерационным. На k шаге из суммарного сигнала исключаются линейные электрооптические сигналы от фракций А_i, где i k+1,j. Вклад фракции A_k находится при исключении из стационарной величины сигнала вклада фракций A_i, где i=0,k-1. Рассчитанные значения весовых множителей для этих фракций с каждым шагом измерения частоты будут уменьшаться на величину (E²_max-E²_min)/j.
Точность определения электрооптического сигнала для каждой фракции заданного размера возрастает при изменении направления вектора электрооптического поля за счет симметричности сигнала и исключения погрешности выбора нулевой линии отсчета, обеспечиваемых тем, что измерения проводят на одном образце исследуемой суспензии при поочередном пропускании ортогональных друг другу потоков света.

Выполнение измерений величины электрооптического сигнала в течение одного радиоимпульса позволяет определить совокупность значений коэффициентов A_n}_i для данной частоты заполнения радиоимпульса f_i. Проведение измерений на ряде частот позволяет определить наборы коэффициентовA_n}_i как функцию частоты f электрического поля. Нормировка величиныA_n}_i на величину оптической плотности суспензии и квадрат напряженности электрического поля позволяет найти величинуA_n}_i для каждой фракции клеток одного размера. Выполнение измерений на наборе частот электрического поля при подаче последовательности радиоимпульсов с разной частотой заполнения позволяет определить частотную дисперсию величиныA_n}_i для каждой фракции по размерам.

Для определения физиологических характеристик клеток, например их внутреннего гомеостаза, синтеза клеточных структур и др. используют зависимости величины A_i или величины анизотропии поляризуемости от частоты f электрического поля, полученные для каждой фракции клеток определенного размера. Гетерогенность суспензии по указанным физиологическим параметрам определяют путем расщепления электрооптического сигнала, полученного для каждой фракции с определенным размером клеток, на сумму сигналов, соответствующих фракциям клеток с различными поляризационными параметрами. Такие зависимости для фракций жизнеспособных клеток, поврежденных клеток, клеток на стадии споруляции или клеток, подверженных различным видам воздействий, получают в процессе предварительных измерений.

Устройство для электрооптического анализа клеток в суспензии (фиг.3) содержит электрооптическую ячейку 1 для исследуемой суспензии, сообщенную с емкостями для приготовления исследуемого образца и сбора отходов, не показанными на схеме, импульсные источники 2 и 3 света и зеркала 4-7, служащие для сведения световых потоков от источников 2 и 3 к фотоприемнику 8 (т.е. для обеспечения оптической связи источников 2 и 3 света с фотоприемником 8), соединенному в электрическую цепь с преобразователем 9 напряжения в частоту, выход которого соединен со входами стробируемых счетчиков 10 и 11 частоты. Устройство также содержит генератор 12 гармонического напряжения, аттенюатор 13, вход которого соединен с выходом генератора 12, парафазный усилитель 14, вход которого соединен с выходом аттенюатора 13, и коммутатор 15 электродов, входы которого соединены с выходами парафазного усилителя 14.

Электрооптическая ячейка 1 выполнена (фиг.4) в виде параллелепипеда с квадратным основанием, содержит четыре светопрозрачные стенки 16 и электроды 17-20, для случая четырехэлектpодной ячейки, или электроды 21-29, для случая девятиэлектродной ячейки (фиг.5). Электроды 17-20 и 21-29 выполнены в виде стрежней и служат для создания электрического поля в ячейке 1. Электроды 17-20 установлены вертикально по углам ячейки 1 на одинаковом расстоянии от ее вертикальной оси. Электроды 21-29 установлены в ячейке 1 вертикально тремя рядами по три электрода в каждом так, что расстояние между соседними электродами в ряду равно расстоянию между электродами, причем средний электрод 29 среднего ряда установлен по вертикальной оси ячейки 1 и является центральным. При этом электроды 17 и 18 соединены с выходами коммутатора 15 электродов, а электроды 19 и 20 соединены с выходами парафазного усилителя 14. Электроды 21 и 22 соединены с одним выходом коммутатора 15 электродов, а электроды 23 и 24 соединены с другим выходом коммутатора 15 электродов, электроды 25-28 соединены с одним выходом парафазного усилителя 14, а электрод 29 соединен с другим выходом парафазного усилителя 14.

Устройство снабжено микропроцессором 30 с общей шиной 31, с которой связаны управляющие входы генератора 12, аттенюатора 13, коммутатора 15 электродов и импульсных источников 2 и 3 света и выходы стробируемых счетчиков 10 и 11 частоты.

Устройство работает следующим образом. В электрооптическую ячейку 1 помещают исследуемый образец суспензии. На управляющие входы импульсных источников 2 и 3 света по общей шине 31 микропроцессора 30 подают кодовые последовательности, задающие интенсивность светового потока каждого из импульсных источников 2 и 3 света. По управляющим сигналам микропроцессора 30, следующим с частотой переключения световых потоков, импульсные источники 2 и 3 света поочередно создают световые потоки, которые проходят в перпендикулярные направлениях через электрооптическую ячейку 1 Одновременно в ячейке 1 создают электрическое поле с изменяемыми параметрами.

По управляющему сигналу от микропроцессора 30 генератор 12 формирует гармоническое напряжение заданной частоты в диапазоне от 10³ до 10⁸ Гц в виде радиоимпульсов с фиксированной частотой заполнения. Напряжение поступает на управляющий аттенюатор 13, в котором коэффициент ослабления под управлением микропроцессора 30 меняется с переходом к следующей частоте изменения направления вектора электрического поля и таким образом изменяет напряженность поля в ячейке 1. Далее напряжение поступает на парафазный усилитель 14, формирующий два напряжения со смещением фазы в 180^o.

Два парафазных напряжения парафазного усилителя 14 одновременно подаются на электроды 17 и 18 или 25-28 и 29 непосредственно, а на электроды 19, 20 или 21 и 22, 23 и 24 через коммутатор 15 электродов. По управляющим сигналам от микропроцессора 30 коммутатор 15 обеспечивает поочередно подключение к электродам парафазных напряжений с частотой F изменения направления вектора электрического поля, что приводит к изменению направления вектора поля в электрической ячейке 1 на 90^o.

Электрическое поле в ячейке 1 вызывает ориентацию частиц, которая приводит к увеличению оптической плотности суспензии в одном направлении и уменьшению оптической плотности в перпендикулярном направлении, что соответствует изменению интенсивности ортогональных световых потоков, создаваемых поочередно источниками 2 и 3 света, определяемому как электрооптический сигнал. Изменение направления вектора электрического поля приводит к изменению ориентации клеток и смене характера изменения оптической плотности в этих направлениях на противоположный. Системой зеркал 4-7 световые потоки сводятся на фотоприемник 8. Выходное напряжение фотоприемника 8 поступает на преобразователь 9 напряжения в частоту. Импульсы с выхода преобразователя 9 накапливаются в стробируемых счетчиках 10 и 11 частоты. Количество импульсов соответствует интенсивности ортогональных световых потоков прошедших через ячейку 1. Содержание счетчиков 10 и 11 считывается в микропроцессор 30 и после определения их разности используется для расчета селективных величин анизотропии поляризуемости клеток различных фракций и их морфометрических параметров.

Конечным регистрируемым в микропроцессоре 30 сигналом является изменение во времени оптических свойств суспензии клеток, определяемое как разность интенсивностей ортогональных световых потоков, возникшая в процессе воздействия на суспензию радиоимпульса электрического поля с фиксированной частотой f заполнения и изменяющимися параметрами поля F и Е.

Программирование изменяющихся параметров электрического поля на протяжении каждого радиоимпульса обеспечивает возможность определения фракционного состава клеток в суспензии. Кроме того, изменение направления вектора электрического поля на протяжении радиоимпульса позволяет повысить точность измерений электрооптического сигнала за счет исключения влияния дрейфа нулевой линии.

Определение разности интенсивности ортогональных световых потоков, прошедших через один и тот же образец суспензии элементарный объем, позволяет исключить одинаковое действие в суспензии седиментации частиц и шумы флуктуаций плотности.

Преимущества предлагаемого способа и устройства для его осуществления иллюстрируются конкретными примерами осуществления способа:
Пример 1. Определение гетерогенности суспензии клеток E.coli.

Культуральную жидкость с клетками E.coli С 600, полученную после культивирования на качалке в течение 5 ч при 37^oC на минеральной среде М9 (Методы общей бактериологии/ под ред. Ф.Герхарда, т.1, М. Мир, 1984, гл.3) с добавкой 0,4% глюкозы и прогретую в водяной бане при 60^oC в течение 10 мин, отфильтровали через целлюлозную мембрану "Владипор N 5", осадок из клеток на фильтре промыли дистиллированной водой и ресуспендировали в ТРИС-фосфатный буфер с удельной электропроводностью 10^-2 Ом^-1м^-1. Полученную суспензию с оптической плотностью 0,4 ед. поместили в электрооптическую ячейку 1 описанного выше устройства.

Выполнили предварительные и основные измерения. Предварительные измерения провели для определения исходных параметров F_max, F_min, E_max, E_min и j для данной культуры. Для этого с микропроцессора 30 через общую шину 31 подачи сигнал на управляющие входы генератора 12 и получили с его выхода гармоническое напряжение с частотой f 1,024 МГц. Через цепь, состоящую из управляемого аттенюатора 13, парафазного усилителя 14 и коммутатора электродов 15 подали гармоническое напряжение на электроды 21-29 ячейки 1. С помощью микропроцессора 30 через общую шину 31 в каждый момент времени определяли разность содержимого счетчиков 10 и 11 и вывели ее на дисплей (необозначенный на чертежах) как функцию времени. Создали напряженность поля в ячейке Е 10000 В/м путем изменения величины затухания аттенюатора 13 при подаче на его управляющий вход сигнала с микропроцессора 30 через общую шину 31. Величину частоты f и величину напряженности Е выбирали из условия получения наибольшей величины электрооптического сигнала. Изменяя частоту F изменения направления вектора электрического поля от величины F=4 Гц до величины F 0,031 Гц обнаружили после определения микропроцессором 30 электрооптического сигнала, как разности содержимого счетчиков 10 и 11, появление электрооптического сигнала со стационарным участком на частоте F 0,5 Гц и выбрали эту частоту в качестве F_max. Определили, что исчезновение изменений стационарной величины электрооптического сигнала происходит на частоте 0,062 Гц, и выбрали эту частоту в качестве F_min. Направление вектора на 90^o меняли на каждой частоте F пять раз, столько же раз на каждой частоте F проводили измерения электрооптического сигнала. М выбрали равным 1 и рассчитали, что j=1/M·log₂(F_max/F_min) 1/1·log₂(0,5/0,062) 3.

Провели измерения электрооптического сигнала при частоте f 1024 кГц на частотах F от F_max 0,5 Гц до F_min 0,062 Гц на каждом значении напряженности Е при ее изменении от величины 620 В/м до величины 10000 В/м с количеством шагов равным 8 и шагом по Е² равным (E²_max-E²_min)/j (10000² 620²)/8. Рассчитывали величины весовых коэффициентов A_o и A_j, соответствующие фракциям с наименьшими и наибольшими размерами при каждой величине напряженности Е, согласно описанной выше итерационной процедуре. Построили графики зависимости электрооптического сигнала от квадрата напряженности для фракций с указанными размерами. Определяли значение напряженности Е_max 10000 В/м, при котором появляется отклонение графика A_o(E) от прямой линии. Аналогично по графику A_j(E) определили величину E_min 4200 В/м.

Основные измерения электрооптического сигнала с целью определения гетерогенности суспензии клеток провели на частотах f заполнения радиоимпульса f₁ 1 кГц и f₂ 8,4 МГц при изменении F от 0,5 Гц до 0,062 Гц и изменении Е от 10000 В/м до 4200 В/м при j 3 и М 1.

Значение частоты f₁ было выбрано с учетом теории объемной поляризуемости таким, что электрофизическая гетерогенность клеток не влияла на вид функциональной зависимости анизотропии поляризуемости от размеров. Значение частоты f₂, было выбрано таким, чтобы согласно модели объемной поляризуемости (Ландау Л.Д. Лифшиц Е.М. Электродинамика сплошных сред, М. Гостехиздат, 1957, с. 14-28) проявилась электрофизическая гетерогенность внутренних структур клетки, вызванная избирательным воздействием теплового фактора.

Результаты измерений электрооптического сигнала как функции времени и параметров f, F и Е приведены на фиг. 6. При обработке имеющихся данных согласно описанной выше итерационной процедуре были получены два множества параметровA_i}_i N_i·dQ_i·{da_i}₁ для f₁ 1 кГц иA_i}₂ N_i· dQ_i·{da_i}₂ для f₂ 8,4 МГц, где i 0, 1, 2, 3.

Обработка оптического отклика, показанного на фиг. 6, с целью определения морфологической гетерогенности суспензии выполнена в соответствии с вышеописанной итерационной процедурой и результаты этой обработки представлены на фиг. 7,а). На фиг. 7,б) показаны результаты контрольных измерений распределения размеров, полученных при обработке микрофотографий раздавленной капли суспензии клеток (Коллоидный журнал, 1989, т. 51, N 5, с. 844).

Из сопоставления данных, представленных на фиг. 7, видно, что результаты измерения морфометрической гетерогенности, полученные при обработке данных, представленных на фиг. 6, совпадают с результатами контрольных измерений с погрешностью, не превышающей 10% что подтверждает возможность использования предлагаемого способа для оценки морфометрической гетерогенности исследуемой популяции клеток.

На фиг. 8 показана зависимость анизотропии поляризуемости da₂ исследуемых клеток от их размеров на частоте f₂, нормированная на такую же зависимость da₁ на частоте f₁. Как видно из этой фигуры, нормированная величина анизотропии поляризуемости da₂/da₁ для клеток с размерами больше 3,2 мкм имеет меньшее значение, чем величина анизотропии поляризуемости для клеток с размерами меньше 1,8 мкм. Это свидетельствует об избирательном действии тепла на клетки с различными размерами и появлении по крайней мере двух фракций с отличающимися поляризационными параметрами. Интерпретация полученных данных с помощью теории объемной поляризуемости показывает, что уменьшение величины анизотропии поляризуемости у клеток с размерами больше 3,2 мкм связано с изменением электропроводности цитоплазмы за счет избирательного повреждения теплом более крупных клеток. Это подтверждает возможность использования предлагаемого способа для оценки электрофизической гетерогенности популяции клеток
Пример 2. Определение электрофизической гетерогенности клеток Bac. subtilis.

Культуральную жидкость с клетками Bac. subtilis, находящимися на стадии споруляции, полученную после культивирования на качалке при 30^oC в течение 24 ч на среде (Бельтюкова К.И. и др. Методы исследования возбудителей бактериальных болезней растений, Киев. Наукова думка, 1968), содержащий (в г/л) ферментативный гидролизат дрожжей (20), глюкозу (10), MgSO₄·7H₂О (0,2), CaCl₂ ·H₂O (0,01) и картофельно-глицериновую смесь, отфильтровали через целлюлозную мембрану "Владипор N5", осадок из клеток на фильтре промыли дистиллированной водой и ресуспендировали в ТРИС-фосфатный буфер с удельной электропроводностью 10^-2 Ом^-1 м^-1. Полученную суспензию с оптической плотностью 0,4 ед. поместили в электрооптическую ячейку 1. Провели вспомогательные и основные измерения, как описано в примере 1 и определили F_max 0,25 Гц, F_min 0,031 Гц, E_max 6000 В/м, E_min 2100 В/м. Выбрали М 1 и рассчитали j, как описано в примере 1, j 3.

Провели основные измерения на частотах f заполнения радиоимпульса f₁ 1 кГц и f₂ 4,2 МГц, выбранных исходя из тех же предпосылок, как описано в примере 1.

Результаты измерений электрооптического сигнала как функции времени и параметров f, F и Е приведены на фиг. 9. При их обработке с помощью рассмотренной выше итерационной процедуры были получены множества параметровA_i}₁ N_i· dQ_i·{da_i}_1M для f₁ 1 кГц иA_i}₂ N_i·dQ_i·da_i}₂ для f₂ 4,2 МГц, где i 0, 1, 2, 3.

Результаты нормировки элементов множестваA_i}₂ на элементы множестваA_i}₁, необходимой для выделения зависимости анизотропии поляризуемости от размера клеток, приведены на фиг. 10.

Нормированная величина анизотропии поляризуемости da₂/da₁ согласно фиг. 10 у клеток с размерами > 5,2 мкм имеет большее значение, чем у клеток с размерами < 3,6 мкм. Это свидетельствует об изменении электрофизических параметров клеток, находящихся на стадии завершения спорообразования в сравнении с мелкими клетками, не имеющими спор, и обнаружении по крайней мере двух фракций с различной морфологией и электрофизическими параметрами. Этот пример еще раз подтверждает возможность использования предполагаемого способа и устройства для его осуществления для оценки морфологической и электрофизической гетерогенности популяции клеток.

Формула изобретения

1. Способ электрооптического анализа клеток в суспензии, включающий наложение на суспензию переменного электрического поля в виде импульсов, пропускание через нее световых потоков, измерение интенсивности прошедших через суспензию световых потоков и определение их разности как величины электрооптического сигнала с последующим определением зависимости анизотропии поляризуемости клеток от частоты указанного электрического поля, отличающийся тем, что при наложении каждого указанного импульса электрического поля изменяют направление вектора напряженности электрического поля дискретно на 90^o с частотой F, при этом частоту F изменяют от F_min до F_max по формуле
F_i±₁= F_i/2^М,
где i(0,i-1), (j-1,0),

М положительное число;
F_max определяют по частоте изменения направления вектора напряженности электрического поля, при которой появляется электрооптический сигнал, а F_min определяют по частоте изменения направления вектора напряженности электрического поля, при которой исчезает изменение стационарной величины электрооптического сигнала.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что одновременно с изменением частоты F изменения направления вектора напряженности электрического поля изменяют напряженность Е электрического поля в диапазоне от E_min до E_max по формуле

в случае изменения напряженности электрического поля в сторону ее увеличения, или по формуле

в случае изменения напряженности электрического поля в сторону ее уменьшения,
где i=(0,i),

при этом E_min величина напряженности электрического поля, определяющая пороговый уровень слабой степени ориентации крупных клеток;
E_max величина напряженности, определяющая пороговый уровень слабой степени ориентации мелких клеток.

3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что указанные величины F_max, F_min, E_max и E_min определяют экспериментально в зависимости от вида исследуемой культуры клеток.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что изменяют направление вектора напряженности электрического поля на 90^o при любой частоте F изменения вектора напряженности электрического поля по меньшей мере три раза.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что исследуемую суспензию берут в виде элементарного объема, через который поочередно пропускают два световых потока, ортогональных друг другу.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что на исследуемую суспензию накладывают электрическое поле, вектор напряженности которого в начальный момент времени параллелен или ортогонален по меньшей мере одному указанному световому потоку.

7. Устройство для электрооптического анализа клеток в суспензии, содержащее электрооптическую ячейку, снабженную светопрозрачными окнами, расположенными друг напротив друга, и электродами, источник света, оптически связанный с фотоприемником, соединенным с блоком определения разности интенсивностей световых потоков, и генератор импульсов электрического напряжения, соединенный с электродами, отличающееся тем, что электрооптическая ячейка содержит четыре светопрозрачных окна и по меньшей мере четыре электрода в виде стержней, установленных между указанными окнами, при этом устройство снабжено дополнительным источником света, оптически связанным с фотоприемником, причем оба источника выполнены импульсными, а также устройство снабжено последовательно соединенными аттенюатором электрического напряжения с возможностью управления величиной электрического напряжения, парафазным усилителем и коммутатором электродов, подключенными к генератору электрического напряжения, при этом вход парафазного усилителя соединен с выходом аттенюатора, его выходы с двумя диагонально расположенными электродами и входами коммутатора электродов, выходы которого соединены с двумя другими диагонально расположенными электродами.

8. Устройство по п.7, отличающееся тем, что электрооптическая ячейка содержит девять электродов, установленных тремя рядами по три электрода в каждом ряду и расстояние между соседними электродами в ряду равно расстоянию между рядами, а средний электрод среднего ряда является центральным, при этом крайние электроды первого и третьего рядов соединены с одним выходом парафазного усилителя, центральный электрод соединен с другим выходом парафазного усилителя, а остальные попарно противолежащие электроды соединены с коммутатором электродов.

9. Устройство по п.7, отличающееся тем, что оно снабжено двумя стробируемыми счетчиками частоты, блок определения разности интенсивностей световых потоков выполнен в виде преобразователя напряжения в частоту, выход которого соединен с входами двух стробируемых счетчиков частоты.

10. Устройство по п.7, отличающееся тем, что электрооптическая ячейка выполнена в виде параллелепипеда с квадратным основанием.

11. Устройство по п.7, отличающееся тем, что указанная оптическая связь источников света и фотоприемником выполнена в виде четырех зеркал, одно из которых установлено на оси светового потока, создаваемого одним источником света, а другое на оси светового потока, создаваемого другим источником света, а два других расположены между предыдущими зеркалами и установлены относительно друг друга под углом, обеспечивающим падение указанных световых потоков на фотоприемник под углом 90^o.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10