Штамм бактерий klebsiella pneumoniae, используемый в качестве референс-штамма для определения каталазной активности микроорганизмов при дифференциации патогенных и непатогенных микроорганизмов

 

Использование: область медицинской микробиологии, именно биотехнологии и может быть использовано в качестве референс-штамма для изучения каталазной активности при дифференциации патогенных и непатогенных микроорганизмов. Сущность изобретения: выделен штамм Klebsiella pneumoniae из клинического материала больного диареей, обладающий стабильным свойством интенсивно продуцировать катализу, позволяющий использовать его в качестве референс-штамма для изучения каталазой активности. 3 табл.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано в качестве референс-штамма для определения каталазной активности энтеробактерий и других микроорганизмов, когда необходима дифференциация патогенных и непатогенных микроорганизмов при обосновании этиологической значимости культур, выделенных от больных ОКИ, здоровых лиц и объектов окружающей среды.

Известен штамм Escherichia coli, продуцирующий каталазу (Jap. J.Bacteriol, 1986, 41, N 2, р. 535-539).

Недостатком известного штамма является нестабильность продукции фермента каталазы и других его биологических свойств, что не позволяет использовать его в качестве референс-штамма при определении каталазной активности микроорганизмов и дифференциации патогенных и непатогенных культур.

Цель изобретения новый штамм Klebsiella pneumoniae, обладающий стабильным свойством интенсивно продуцировать фермент каталазу, для использования его в качестве референс-штамма при определении каталазной активности при дифференциации патогенных и непатогенных микроорганизмов.

Штамм K. pneumoniae выделен из клинического материала больного диареей, депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича за N 215.

Свойства штамма K. pneumoniae.

Морфологические признаки. Грамотрицательные кроткие палочки, неподвижные, жгутиков и спор не образуют. При окраске в тушевом препарате по Бурри установлена продукция капсулы, размер которой составляет 0,5 диаметра тела бактериальной клетки.

Культуральные признаки: на мясо-пептонном бульоне через 3 ч при 37^oC наступает легкое помутнение среды, через 16 18 ч помутнение с легкой пленкой. На плотных питательных средах через 18 24 ч при 37^oC образует колонии которые выглядят следующим образом: на среде Эндо: колонии ярко-розового цвета с красной точкой в центре, выпуклые, маслянистые, диаметр колонии 3,0 4 мм, признаков диссоциации нет.

на среде К₂: колонии бледно-желтого цвета с более яркой точкой в центре, куполообразные, маслянистые с ровными краями, диаметр колоний 2,0 - 3,0 мм, признаков диссоциации нет.

на мясо-пептонном агаре: колонии светлые, полупрозрачные, с ровными краями, диаметр 1,5 2,0. Признаков диссоциации нет.

Физиолого-биохимические свойства (расщепление многоатомных спиртов, углеводов, декарбоксилирование аминокислот и т.д.

Оптимум роста (37,0 ± 0,5)^oC, оптимум рН среды 7,0 7,2. Оптимальные условия аэробные. Активно расщепляют глюкозу и глицерин с образованием кислоты и газа, а также маннит, сахарозу, мальтозу, арабинозу, адонит, дульцит, ксилозу, сорбит и рамнозу, лактозу замедленно, на 2-е сутки. Декарбоксилирует лизин, утилизирует малонат натрия, цитрат Козера и Симонса, обладает уреазной активностью, дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, т.е. ферментирует глюкозу с образованием ацетилметилкарбанола (ацетоина). Не образует сероводород и индол, в реакции метил-рот отрицательна. Орнитиндекарбоксилаза, аргининдегидролаза и фенилаланиндезаминаза отсутствуют, штамм неподвижен.

Антигенная структура: штамм серотипирован как K.pneumoniae К 16 (набор диагностических сывороток ЦИВС им. Мечникова).

Чувствительность к антибактериальным препаратам: исследованиями методом серийных разведений чувствительность к следующим препаратам: группа аминогликозидов неомицину (10 мкг/мл), канамицину (5 мкг/мл), гентамицину 2,5 мкг/мл), сизомицину (1 мкг/мл) клафорану (25 мкг/мл), тетрациклину (30 мкг/мл), доксициклину (25 мкг/мл), хлорамфениколу (5 мкг/мл), эритромицину (75 мкг/мл), полимиксину В (2,5 мкг/мл), налидиксовой кислоте (10 мкг/мл), триметоприму (25 мкг/мл), фуразолидону (10 мкг/мл), броксиквинолину (2,5 мкг/мл). Устойчив к бензилпенициллину (10 мкг/мл), ампициллину (1,5 мкг/мл), ампиоксу (1,5 мкг/мл), рифампицину (10 мкг/мл), ристомицину (250 мкг/мл).

Биологические свойства. Штамм активно синтезирует фермент катализу.

Каталазную активность штамма определяют двумя методами: общепринятым методом с 3% раствором перекиси водорода и количественным методом. Интенсивность продукции каталазы по четырехкрестной системе .

Количественный метод: в лунки титровальных планшетов вносят 0,2 мл раствора перекиси водорода, в концентрациях от 4% до 0,0015% затем 0,05 мл суточной бульонной культуры в концентрации 10⁹ м.т. инкубируют при 37^o C в течение 10 мин. Ход реакции останавливают добавлением 0,2 мл 2% раствора молибдата аммония. О каталазной активности судят по наличию окраски и ее интенсивности. Результат оценивают в титрах. Разложение 0,2 мл 2% раствора перекиси водорода вызывает 5·10⁶ м.т. штамма K.pneumoniae 215.

Вирулентные свойства: LD₅₀ для белых мышей 5·10⁷ м.т.

Штамм используют следующим образом: Пример 1. Культуру штамма K.pneumoniae 215 засевают на мясопептонный агар, К₂, Эндо или мясопептонный бульон и выращивают при (37,0±0,5^o C в течение 18-24 ч.

Одну петлю культуры вносят в 0,2 мл 3% перекиси водорода. О каталазной активности судят по интенсивности и длительности образования пены. Пенообразование наблюдают через 1-2 с, высота ее достигает 0,5 см, длительность в течение 1-1,5 мин, что соответствует при четырехкрестной системе оценки на 4 креста .

Пример 2. Культуру штамма K.pneumoniae-215 засевают в мясопептонный бульон, чашки или пробирки со скошенным мясопептонным агаром и выращивают при (37±0,5)^o C в течение 18-24 ч. Затем готовят взвесь культуры плотностью 10₉ м. т. (с помощью стандарта мутности) и исследуют количественным методом следующим образом: в лунки титровального планшета вносят 0,2 мл раствора перекиси водорода, раститрованного двушаговым разведением в концентрациях 8% 4% 2% 1% 0,5% 0,25% затем 0,05 мл культуры (10₉) м.т./мл), перемешивают и инкубируют при 37^oC в течение 10 мин. Ход ферментативной реакции останавливают добавлением 0,2 мл 2% раствора молибдата аммония. О каталазной активности судят по наличию окраски и ее интенсивности. Результат оценивают визуально и выражают в титрах или инструментально в ед. оптической плотности. Титр реакции 1:2-1:4, т.е. 5·10⁷ м.т. штамма K.pneumoniae-215 расщепляют 0,2 мл 4% или 2% раствора перекиси водорода.

Пример 3. Сравнительное изучение каталазной активности штамма K.pneumoniae-215 проводят как описано в примере 2 одновременно со штаммами других видов микроорганизмов. Результаты сравнительного изучения представлены в табл. 1.

Как видно из данных табл. 1 процент штаммов, обладающих каталазной активностью варьирует в широких пределах от 8,3 до 100% На долю высокоактивных штаммов, расщепляющих субстрат (H₂O₂) в концентрации 2% приходится лишь 2 штамма из числа каталазоположительных штаммов.

Таким образом штамм K.pneumoniae-215 может быть использован в качестве референс-штамма при изучении каталазной активности не только K.pneumoniae, но и других видов микроорганизмов.

Пример 4. Изучение каталазной активности штаммов K.pneumoniae, выделенных из различных источников проводили как описано в примере 2.

Как видно из данных табл.2, штаммы, обусловившие вспышки и групповые заболевания ОКИ среди новорожденных и детей первого года жизни, обладают более высокой каталазной активностью и более вирулентные по сравнению со штаммами, выделенными от здоровых детей.

Пример 5. Изучение особенности штамма K.pnreumoniae 215 стабильно интенсивно продуцировать фермент-каталазу проводят следующим образом: штамм хранят на полужидком голодном агаре под слоем вазелинового масла при 4^oC и лиофильно высушенный. Через каждые 6 мес. подвергают исследованию как описано в примерах 1 и 2.

Данные, представленные в табл. 3 свидетельствуют о том, что штамм K.pneumoniae-215 не утратил свойства интенсивно синтезировать фермент-каталазу при различных условиях хранения в течение 2,5 лет. По истечении указанного срока проводят три пассажа на мясопептонном агаре и исследуют как описано в примере 2. Активность пpодуцируемого фермента для лиофилизированного штамма 134 МЕ/мл, для штамма, хранившегося на голодном агаре -142 МЕ/мл.

Штамм K.pneumonriae 215 может быть использован в качестве референс-штамма для изучения каталазной активности микроорганизмов в частности клебсиелл, выделенных от больных, что очень важно для дифференциации патогенных и непатогенных штаммов.

Формула изобретения

Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae ГИСК-215, используемый в качестве референс-штамма для определения каталазной активности микроорганизмов при дифференциации патогенных и непатогенных микроорганизмов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3